Os autores gostariam de agradecer ADIR (Aide aux domicílio Insuffisants respiratoires) e Fondation de l&#39;Avenir por seu apoio financeiro e ao Dr. Fanie Barnabé-Heider para a edição do manuscrito.

1. Culturas primárias de Mucosa olfativa e olfativo Lâmpadas <ol><li> Antes de dissecção <ol><li> Adicione médio, para 50 ml, por adição de 44 ml de livre de cálcio de Dulbecco Modificado de Eagle / meio de Ham F12 (DMEM/F12), suplementado com 5 ml de soro fetal de bovino (FBS) e 1 ml de penicilina / estreptomicina. </li><li> Bata de 75 centímetros 2 frascos com poli-L-lisina (50 ug / ml, 1,5 ug / cm 2), 1 h à temperatura ambiente. </li><li> Lavar frascos com PBS 1x. </li><li> Armazene os frascos revestidos na geladeira por até 1 semana. </li></ol></li><li> Dissecação <ol><li> Qualquer método de eutanásia deve ser previamente aprovado pelo cuidado com os animais e uso comitê da instituição e realizado por pessoal qualificado. </li><li> Escolha ratos endogâmicos, como ratos Fischer. </li><li> Depois que o rato foi confirmado ter entrado anestesia profunda com pentobarbital de sódio ou outras formas injectáveis ​​de anestesia, como cetamina / xilazina, decapitá-lo e remova a pele. </li><li> Abra o crânio do anterior para a parte posterior. </li><li> Retire o OB tendo o cuidado de evitar as meninges. </li><li> No mesmo rato, abrir o sagittaly cavidade nasal. </li><li> Remover o OM tendo o cuidado de evitar a mucosa respiratória. Note-se que o epitélio OM pode ser facilmente identificadas pela sua cor amarelada. </li><li> Protocolos adicionais detalhadas sobre a dissecção da OM pode ser encontrar em um anterior <a href="https://www.jove.com/video/2762/isolating-nasal-olfactory-stem-cells-from-rodents-or-humans">J. Vis. Exp</a> . publicação 13. </li></ol></li><li> Cultura <ol><li> Coloque OB em solução tamponada de sal de Hank (HBSS) contendo tripsina a 0,1% durante 45 min a 37 ° C. </li><li> Coloque OM em HBSS contendo 0,05% de colagenase A durante 45 min a 37 ° C. </li><li> Parar a digestão enzimática por adição de 2 ml de meio morno. </li><li> Lavar as células com meio e centrifuga-los a 300 xg durante 3 min. </li><li> Triturar amostras de 2ml de meio com uma pipeta P1000 até obter uma suspensão homogénea de células é obtido. </li><li> Placa as células em frascos pré-revestidas (5-10 x 10 6 células / frasco) com 25 ml de meio morno. </li><li> Incubar e cultura das células a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Mude metade da média a cada 2 dias. </li><li> Após 6-8 dias in vitro, verificar a proporção de células positivas para p75 em amostras de células pequenas, assumido ser OECs em roedores, por citometria de fluxo ou por imunocitoquímica. Para estas análises, outros marcadores podem ser estudados como GFAP e S100β. </li></ol></li><li> A citometria de fluxo análise <ol><li> Coletar as células como descrito em (2.2) &quot;O transplante celular&quot;. </li><li> Incubar com o anticorpo primário p75 (1:100) durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Lavar as células com 2 ml de PBS-EDTA e centrífuga-los a 300 xg durante 3 min. </li><li> Incubar as células com PE de anticorpo anti-ratinho conjugado secundário durante 15min a 4 ° C no escuro (1:200). </li><li> Lavar as células com 2 ml de PBS-EDTA e centrífuga-los a 300 xg durante 3 min. </li><li> Ressuspender as células em 500 ul de PBS-EDTA. </li><li> Analise 10-30 x 10 células com 3-citómetro de fluxo. </li></ol></li><li> Análise imunocitoquímica <ol><li> Placa as células em placas de 6 poços pré-revestidas durante 48 horas, tal como descrito em &quot;cultura&quot; (secção 1.1.2). </li><li> Lavar as células com PBS. </li><li> Fixar as células com PFA a 4% durante 15 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as células com PBS. </li><li> Incubar as células com PBS / Triton X100 (0,1%) durante 15 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as células com PBS. </li><li> Incubar as células com os anticorpos primários (1:200): p75, S100β e GFAP durante a noite a 4 ° C. </li><li> Lavar as células com PBS. </li><li> Incubar as células com os anticorpos secundários (1:500) durante 1 hora à temperatura ambiente na escuridão. </li><li> Lavar as células com PBS. </li><li> Incubar as células com Hoechst 10 min a IT na escuridão. </li><li> Lavar as células com PBS. </li><li> Analisar as células utilizando um microscópio de fluorescência. </li></ol></li><li> Células de rotulagem GFP <ol><li> Cinco dias antes do transplante, infectar OB e OM culturas durante a noite com vetor lentivírus abrigar reforçada GFP (multiplicidade de infecção: 20). </li><li> Antes de verificação transplante em pequenas amostras, a taxa de células GFP positivas por citometria de fluxo, como descrito anteriormente em &quot;cultura&quot; (seção 1.1). </li></ol></li></ol> 2. Cirurgia e Transplante <ol><li> Anastomose do nervo recorrente <ol><li> Todos os experimentos com animais devem ser previamente aprovados pelo cuidado com os animais e uso comitê da instituição e realizado por pessoal qualificado. </li><li> Antes da cirurgia autoclave todos os instrumentos e manter a esterilidade durante os procedimentos cirúrgicos. </li><li> Anestesiar ratos por injecção intraperitoneal de cloridrato de cetamina (12,5 mg / kg) e cloridrato de clorpromazina (0,625 mg / kg). Avaliar a adequação da anestesia por toe pitada antes da cirurgia. </li><li> Coloque o rato em decúbito dorsal. </li><li> Realizar de 2 cm verticais incisão cutânea cervical médio com um bisturi. </li><li> Uma incisão vertical dos músculos infra-hióideos seguindo a linha branca medial. </li><li> Expor laringe usando afastador autostático entre os músculos infra-hióideos. </li><li> Exponha o NLR. </li><li> Sob o controlo microscópico, cortar o nervo totalmente com microtesouras ao nível do sétimo anel traqueal. </li><li> Realize anastomose usando um ponto de 11,0 sutura sob controle microscópico. Esta operação conduz a uma desnervação motor específico da laringe. </li></ol></li><li> Transplante celular <ol><li> Imediatamente antes do transplante, remover as células dos pratos utilizando tripsina a 0,05% de EDTA durante 5 minutos a 37 ° C. </li><li> Parar a digestão enzimática por adição de 2 ml de meio morno. </li><li> Centrifugar a 300 xg durante 3 min. </li><li&gt; Sob um microscópio de contar as células utilizando um hemocitómetro, e ajustar a concentração celular de acordo com o protocolo específico. Neste modelo, as concentrações desejadas foram entre 1,2-6 x 10 6 células em 30 mL de DMEM/F12. </li><li> Faça preparação celular com 1:02 mix (30 e 60 mL deste experimento) de DMEM/F12-Matrige l em 1,5 ml do tubo antes de enxertia e colocá-lo no gelo. Para evitar efeitos não específicos, use o fator de crescimento reduzida Matrigel. </li><li> Pouco antes de o transplante de segurar o tubo na mão por alguns segundos para aquecer a mistura Matrigel-médio. </li><li> Depor o mix no local da anastomose com uma pipeta e espere até que a mistura auto-monta no nervo lesado. </li><li> Feche os músculos ea pele com uma sutura 4.0. </li><li> Casa dos ratos individualmente e manter sob uma lâmpada de aquecimento para 24 horas. </li></ol></li></ol> 3. Avaliação <ol><li> A laringoscopia <ol><li> Anestesiar ratos por intraperitoneal injecção de cloridrato de cetamina (12,5 mg / kg) e cloridrato de clorpromazina (0,625 mg / kg). Confirmam os ratos são anestesiados com uma pitada do dedo do pé, antes de prosseguir com o protocolo. </li><li> Coloque o rato em decúbito dorsal. </li><li> Insira um 30 ° videolaryngoscope ajustados para proporcionar a melhor visão da laringe. Determine marcos anatômicos para reproduzir o mesmo ponto de vista de cada gravação. </li><li> Grave os movimentos das cordas vocais usando o videolaryngoscope (5-10 seqüências / animal). Para cada animal selecionar três seqüências de sucessivas adução e abdução máxima máxima. </li><li> Analisar a função da laringe usando o software de análise de imagem. Determine movimento angular absoluta medindo a diferença entre o movimento de abdução máxima e adução máxima das cordas vocais. Determine pontuação dinâmica pela medição da amplitude de movimento. Determine escore funcional medindo a sincinesias e movimentos paradoxais. </li></ol></li><li> A eletromiografia (EMG) <ol><li&gt; Coloque um eletrodo para os músculos isquiotibiais do rato para o isolamento elétrico. </li><li> Expor laringe e traquéia, abrindo a pele e músculos, como descrito anteriormente em &quot;anastomose do nervo recorrente&quot; (seção 2.1). </li><li> Expor a cartilagem cricothyroid. </li><li> Abra a cartilagem cricothyroid para expor o músculo posterior cricoaritenoideo (PCA) com microtesoura. </li><li> Introduzir um eletrodo de agulha monopolar (38 x 0,45 mm) no músculo PCA. </li><li> Registre a atividade muscular elétrica do músculo PCA através de um sistema de aquisição durante a ventilação espontânea. </li><li> Analisar a atividade muscular em termos de riqueza e sincronização com a respiração. Analisar EMGs, atribuir uma pontuação qualitativa 0-3 utilizando a seguinte escala: 0: rastreamento sem rima, sem aumento durante a inspiração, 1: rimado rastreamento com inspiratória aumentando, mas o rastreamento de pobre (neurogen), 2: rimado rastreamento com atividade mais rica, 3: rimado rastreamento, muito rico, constituindo uma ipadrão nterference, semelhante a uma actividade máxima intencional. </li><li> Exponha o nervo vago para medir a duração de latência e potencial. O nervo vago é escolhido como o sítio de estimulação porque NLR pode ser danificada durante a estimulação, devido ao seu pequeno tamanho. </li><li> Estimular o nervo vago com um eletrodo. </li><li> Anote os sinais elétricos no músculo PCA. Medir a latência e duração do potencial. Se possível utilizar um módulo de aquisição para gravar a atividade muscular, latência e duração do potencial como sistema Powerlab. </li></ol></li><li> Histologia <ol><li> Eutanásia do animal com overdose de pentobarbital. </li><li> Retire o coto distal do NLR sob controle microscópico. A parte distal do NLR é definida como a parte entre anastomose e da laringe. Note-se que é possível encontrar o local da anastomose várias semanas após a cirurgia, pois a sutura é uma sutura de 11,0 não absorvível. </li><li> Coloque a porção distal do NLR em glutaraldeído 2% com fosfato 0,1 M(PH = 7,3) durante 2 horas a 4 ° C. </li><li> Orientar cuidadosamente as amostras para realizar cortes coronais. </li><li> Lavar as amostras em tampão de fosfato. </li><li> Cortadas em segmentos mais pequenos (3-4 mm de comprimento) e sufixo durante 60 minutos à temperatura ambiente em 1% de cacodilato tamponada OsO4 e desidratados com etanol. </li><li> Amostras Orient em moldes de silicone e incorporado nas resinas consistem em POLYBED 812, DDSA e MNA, ao qual foi adicionado 2% da BDMA acelerador. </li><li> Faça cortes transversais semi-finos (1 Hm de espessura) utilizando um ultramicrotomia Sistema Pyramitome. </li><li> Mancha com 0,1% de azul de toluidina em tetraborato de sódio a 1% durante 75 segundos a 70 ° C. </li><li> Analisar amostras NLR com um sistema de análise de contagem. Contar o número de fibras e medir os perfis de fibras nervosas mielinizadas, determinando o limite exterior e interior da bainha de mielina. </li></ol></li><li> Transplantação <ol><li> Preparar células para transplante e transplantar as células como anteriormente descritosem &quot;O transplante celular&quot; (seção 2.2). </li><li> Análise </li><li> Eutanásia do animal com overdose de pentobarbital. Note-se que a fixação dos animais pode ser realizada utilizando injecção intracardíaca de PFA a 4%. </li><li> Retire cerca de 2 cm de NLR. Use proximal e partes distais do NLR. </li><li> Fix amostra NLR em nitrogênio líquido. </li><li> Armazenar as amostras a -80 ° C. </li><li> As amostras cortadas longitudinalmente usando criostato (10-20 mm de espessura). </li><li> Analisar amostras sob microscópio fluorescente para a detecção de células positivas para GFP. Note-se que o anticorpo anti-GFP pode ser utilizado para aumentar a emissão de fluorescência e para executar costainings. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Barraud, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+origin+of+olfactory+ensheathing+glia.">Neural crest origin of olfactory ensheathing glia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21040-21045 (2010).</li><li>Guerout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+gene+expression+profiling+of+olfactory+ensheathing+cells+from+olfactory+bulb+and+olfactory+mucosa.">Comparative gene expression profiling of olfactory ensheathing cells from olfactory bulb and olfactory mucosa.</a> Glia. 58, 1570-1580 (1002).</li><li>Honore, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization,+and+genetic+profiling+of+subpopulations+of+olfactory+ensheathing+cells+from+the+olfactory+bulb.">Isolation, characterization, and genetic profiling of subpopulations of olfactory ensheathing cells from the olfactory bulb.</a> Glia. 60, 404-413 (2012).</li><li>Franssen, E. H., de Bree, F. M., Verhaagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+ensheathing+glia:+their+contribution+to+primary+olfactory+nervous+system+regeneration+and+their+regenerative+potential+following+transplantation+into+the+injured+spinal+cord.">Olfactory ensheathing glia: their contribution to primary olfactory nervous system regeneration and their regenerative potential following transplantation into the injured spinal cord.</a> Brain Res. Rev. 56, 236-258 (2007).</li><li>Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+ensheathing+cells+and+Schwann+cells+differ+in+their+in+vitro+interactions+with+astrocytes.">Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes.</a> Glia. 32, 214-225 (2000).</li><li>Woodhall, E., West, A. K., Chuah, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+olfactory+ensheathing+cells+express+nerve+growth+factor,+brain-derived+neurotrophic+factor,+glia+cell+line-derived+neurotrophic+factor+and+their+receptors.">Cultured olfactory ensheathing cells express nerve growth factor, brain-derived neurotrophic factor, glia cell line-derived neurotrophic factor and their receptors.</a> Brain Res. Mol. Brain Res. 88, 203-213 (2001).</li><li>Dombrowski, M. A., Sasaki, M., Lankford, K. L., Kocsis, J. D., Radtke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+and+nodal+formation+of+regenerated+peripheral+nerve+fibers+following+transplantation+of+acutely+prepared+olfactory+ensheathing+cells.">Myelination and nodal formation of regenerated peripheral nerve fibers following transplantation of acutely prepared olfactory ensheathing cells.</a> Brain Res. 1125, 1-8 (2006).</li><li>Guerout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+olfactory+ensheathing+cells+promotes+axonal+regeneration+and+functional+recovery+of+peripheral+nerve+lesion+in+rats.">Transplantation of olfactory ensheathing cells promotes axonal regeneration and functional recovery of peripheral nerve lesion in rats.</a> Muscle Nerve. 43, 543-551 (2011).</li><li>Guntinas-Lichius, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+olfactory+ensheathing+cells+stimulates+the+collateral+sprouting+from+axotomized+adult+rat+facial+motoneurons.">Transplantation of olfactory ensheathing cells stimulates the collateral sprouting from axotomized adult rat facial motoneurons.</a> Exp. Neurol. 172, 70-80 (2001).</li><li>Makoukji, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lithium+enhances+remyelination+of+peripheral+nerves.">Lithium enhances remyelination of peripheral nerves.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109, 3973-3978 (2012).</li><li>Guerout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-transplantation+of+olfactory+ensheathing+cells+from+mucosa+and+bulb+origin+enhances+functional+recovery+after+peripheral+nerve+lesion.">Co-transplantation of olfactory ensheathing cells from mucosa and bulb origin enhances functional recovery after peripheral nerve lesion.</a> PloS one. 6, 22816 (2011).</li><li>Paviot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+laryngeal+motor+nerve+repair+is+greater+with+bulbar+than+with+mucosal+olfactory+ensheathing+cells.">Efficiency of laryngeal motor nerve repair is greater with bulbar than with mucosal olfactory ensheathing cells.</a> Neurobiol. Dis. 41, 688-694 (2011).</li><li>Girard, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+nasal+olfactory+stem+cells+from+rodents+or+humans.">Isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Nash, H. H., Borke, R. C., Anders, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+of+purification+for+establishing+primary+cultures+of+ensheathing+cells+from+the+adult+olfactory+bulb.">New method of purification for establishing primary cultures of ensheathing cells from the adult olfactory bulb.</a> Glia. 34, 81-87 (2001).</li><li>Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin+3+promotes+purification+and+proliferation+of+olfactory+ensheathing+cells+from+human+nose.">Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose.</a> Glia. 45, 111-123 (2004).</li><li>Paviot, A., Bon-Mardion, N., Duclos, C., Marie, J. P., Guerout, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Although+olfactory+ensheathing+cells+have+remarkable+potential+to+sustain+nerve+regeneration,+they+cannot+be+applied+to+a+severe+vagus+nerve+section/resection+model.">Although olfactory ensheathing cells have remarkable potential to sustain nerve regeneration, they cannot be applied to a severe vagus nerve section/resection model.</a> Muscle Nerve. 43, 919-920 (2011).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

As técnicas apresentadas aqui fazer OECs um modelo útil para estudar transplantes celulares em modelos de lesão de nervos periféricos. O protocolo de cultura de células é relativamente simples e pode ser facilmente levada a cabo. Por outro lado, os procedimentos cirúrgicos, em particular o capítulo / anastomose da NLR, exigem experiência e devem ser realizadas por pessoal qualificado. Os procedimentos descritos neste protocolo destacar fatores importantes para focar de forma a obter...

O sistema olfactivo principal é composto de duas partes distintas: a mucosa olfactiva (OM) no sistema nervoso periférico e o bolbo olfactivo (OB), no sistema nervoso central. O sistema olfactivo principal é caracterizado pela capacidade de os neurónios olfactivos primárias (PON) para a auto-renovação ao longo da vida em espécies de mamíferos. Esta capacidade torna-se possível devido à presença de células estaminais neurais na OM. PON crescimento e rebrota da OM para OB é facilitada pelas células gliais especializadas chamadas células olfativas ensheathing (OECO). OECs são células da crista neural que criam um microambiente favorável para a neurogênese do PON da OM para OB 1. Deste modo, OECs pode ser encontrada na MO e no OB constituindo diferentes subpopulações de células de 2,3. As diferentes propriedades de OECs os cientistas levam a usá-los para transplantes celulares em vários paradigmas de lesão do sistema nervoso 4. De fato, OECO fatores de crescimento produção, reduzir a cicatrização glial, prrebrota axonal Omote, e pode se misturam livremente com os astrócitos 5,6. No entanto, a grande maioria destes estudos são baseados em lesão medular (LM); alguns deles usaram OECs após lesão do nervo periférico (PNI) 7,8. Embora o sistema nervoso periférico tem uma grande capacidade de regeneração após a lesão do nervo, seções completas induzir aberrante rebrota axonal. De fato, após transecções completas do facial ou dos nervos recorrentes (NLR) axônios misrouted causar co-contrações musculares chamados sincinesias. Por isso, é de primordial importância para propor um modelo de PNI, não só para quantificar rebrota axonal, mas também para avaliar a eficiência das contrações musculares. Na literatura o modelo mais comum descrito é baseado em 9,10 lesão do nervo facial. Neste modelo, a uma avaliação funcional baseiam-se na recuperação de movimentos whisker 10. No entanto, é complicado para demonstrar a eficiência do movements e discriminar os fenômenos co-contrações musculares. Propomos aqui um modelo baseado em uma lesão do NLR. Este modelo permite avaliar não só a rebrota axonal e movimentos das cordas vocais, mas também a eficiência e funcionalidade desses movimentos após transplantes celulares 11,12. Este protocolo fornece um procedimento passo a passo para a cultura e transplante OECs do OM e OB em um modelo de seção NLR / anastomose e avaliar os animais após a cirurgia.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="591">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:155px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:197px;">E3521T</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E3387M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicilin/streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1152-8876</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBSS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M3467Y</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M3513P</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cacodylate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.03256.0100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DDSA</td>
			<td>BIOVALLEY</td>
			<td>00563-450</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MNA</td>
			<td>BIOVALLEY</td>
			<td>00886-450</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BDMA</td>
			<td>BIOVALLEY</td>
			<td>00141-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">POLYBED 812</td>
			<td>BIOVALLEY</td>
			<td>08791-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-mouse&#160;</td>
			<td>BD Bioscience&#160;</td>
			<td>550589</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel GFR</td>
			<td>BD Bioscience&#160;</td>
			<td>356231</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10103586001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti P75</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB 365</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">11.0 Wire</td>
			<td>Ethicon&#160;</td>
			<td>FG 2881</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Toluidine Blue&#160;</td>
			<td>RAL DIAGNOSTICS</td>
			<td>361590-0025</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>Sigma 2-16PK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator&#160;</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminar flow hood</td>
			<td>Faster</td>
			<td style="width:197px;">BH-EN 2003 S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow cytometer</td>
			<td>BD Bioscience&#160;</td>
			<td>FACSCalibur</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Videolaryngoscope</td>
			<td>Karl Storz Endoskope</td>
			<td>Telecam SL NLSC 20212120</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acquisition system</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>Powerlab system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pyramitome Ultramicrotomy System&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Leica</td>
			<td>Ultracut S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image analysis system</td>
			<td>Explora Nova</td>
			<td>Mercator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transplantation of olfactory ensheathing cells to evaluate functional recovery after peripheral nerve injury

<html> Células olfativas ensheathing (OECO) são células da crista neural que permitem o crescimento e rebrota dos neurônios olfativos primários. Com efeito, o sistema olfactivo principal é caracterizado pela sua capacidade de dar origem a novos neurónios, mesmo em animais adultos. Esta capacidade particular, é, em parte, devido à presença de OECs que criam um microambiente favorável neurogenesis. Esta propriedade de OECs foi utilizado para transplantação celular, tal como nos modelos de lesão da espinal-medula. Embora o sistema nervoso periférico tem uma maior capacidade de regeneração após lesão nervosa do que o sistema nervoso central, seções completas induzir misrouting durante rebrota axonal em particular após facial da secção do nervo laríngeo. Especificamente, o corte total do nervo laríngeo recorrente (NLR) induz rebrota axonal aberrante resultando em sincinesias das cordas vocais. Neste modelo específico, nós mostramos que o transplante OECs aumenta eficiência axonal rebrota. ve_content &quot;&gt; OECs são constituídas de várias subpopulações presentes tanto na mucosa olfactiva (OM-OECO) e os bulbos olfativos (OB-OECO). Apresentamos aqui um modelo de transplante celular baseado na utilização destas diferentes subpopulações de OECs numa modelo de lesão do NLR. Usando este paradigma, culturas primárias de OB-OECs e OM-OECs foram transplantadas em Matrigel após secção e anastomose do NLR. Dois meses após a cirurgia, foi avaliada animais transplantados por análises complementares com base na videolaringoscopia, eletromiografia (EMG) e estudos histológicos. Primeiro, videolaringoscopia nos permitiu avaliar as funções laríngeas, em particular co-contrações musculares fenômenos. Então, EMG analisa riqueza demonstrada e sincronização de atividades musculares. Finalmente, estudos histológicos com base em azul de toluidina permitiu a quantificação do número e perfil de fibras mielinizadas. Todos juntos, vamos descrever aqui como isolar, cultura, identify e transplante OECs da OM e OB após NLR seção-anastomose e como avaliar e analisar a eficiência dessas células transplantadas sobre as funções de rebrota e laringe axonal.

Ilustrações com controle e reinervadas (/ anastomosados ​​seção) animais foram escolhidos como os resultados podem variar de acordo com os transplantes celulares realizados (OM, OB ou OM + OB). Cultura celular As células aderem rapidamente à superfície do plástico e tornou-se agrupadas em faixas paralelas de células que são alongadas ou afilada, triangular, multipolar, ou em forma de fuso (Figuras 1A e 1B). Após 8 dias de</em...

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Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Células olfativas ensheathing (OECO) são células da crista neural que permitem o crescimento dos neurônios olfativos primários. Esta propriedade específica pode ser utilizado para transplantação celular. Apresentamos aqui um modelo de transplante celular baseado na utilização de OECs em um modelo de lesão do nervo laríngeo.

Transplante de células olfativas Ensheathing para avaliar a recuperação funcional após a lesão do nervo periférico

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.7K visualizações.  University of Rouen.  Células olfativas ensheathing (OECO) são células da crista neural que permitem o crescimento dos neurônios olfativos primários. Esta propriedade específica pode ser utilizado para transplantação celular. Apresentamos aqui um modelo de transplante celular baseado na utilização de OECs em um modelo de lesão do nervo laríngeo. 

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An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

Nervo Óptico um modelo murino de lesão por esmagamento Estudo de Sobrevivência de células da retina Gânglio

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Neurociência

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

Dorsal Root Ganglia neurônios e células-tronco diferenciadas adiposo-derivados: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultura modelo para estudar a regeneração do nervo periférico

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as accessibility to numerous imaging approaches, electrophysiological techniques and behavioral assays. The Xenopus tadpole olfactory system is particularly well suited to investigate the function of synapses established during normal development or reformed after injury. Here, we describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae. We outline a combination of in vivo measurements of presynaptic calcium responses in glomeruli of the olfactory bulb with olfactory-guided behavior assays. Methods can be combined with the transection of olfactory nerves to study the rewiring of synaptic connectivity. Experiments are presented using both wild-type and genetically modified animals expressing GFP reporters in central nervous system cells. Application of the approaches described to genetically modified tadpoles can be useful for unraveling the molecular bases that define vertebrate behavior.

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system in vivo. We describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae in normal rearing conditions or after injury.

Avaliação funcional das vias olfativas vivos Xenopus girinos

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) model in male Sprague-Dawley rats was chosen. By changing the rat&#39;s weight (260&#8722;330 g), the thread bolt type (2636/2838/3040/3043) and the brain infarct time (2-3 h), a higher Longa&#39;s score, a larger infarct volume and a greater model success ratio were screened using the Longa&#39;s score and TTC staining. The optimum model condition (300 g, 3040 thread bolt, 3 h brain infarct time) was acquired and used in a 1-90 day observation period after reperfusion via assessment of sensorimotor functions and infarct volume. At these conditions, the bilateral asymmetry test had a significant difference from 1 to 90 days, and the grid-walking test had a significant difference from 1 to 60 days; both differences could be a suitable sensorimotor functional test. Thus, the most appropriate condition of a novel rat model in the recovery and sequela stages of brain ischemia was found: 300 g rats that underwent MCAO with a 3040 thread bolt for a 3 h brain infarct and then reperfused. The appropriate sensorimotor functional tests were a bilateral asymmetry test and a grid-walking test.

The&#160;purpose of this study is to establish and validate an animal model for research in the recovery and sequela stages of brain ischemia by testing brain infarction and sensorimotor function after middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) after 1-90 days in rats.

Um modelo pré-clínico para avaliar a recuperação do cérebro após acidente vascular cerebral agudo em ratos

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Análise Cinética 3D para a Avaliação Funcional no modelo de rat da lesão ciática de esmagamento nervoso

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

Purificação de Fibroblastos e Células Schwann de nervos sensoriais e motores in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Entrega intra-arterial de células-tronco neurais ao cérebro de ratos e ratos: aplicação à isquemia cerebral

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Automated Gait Analysis to Assess Functional Recovery in Rodents with Peripheral Nerve or Spinal Cord Contusion Injury

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and a lot of comparative data has been published in the literature. This includes a multitude of assessment methods to study functional recovery following nerve injury and repair. Besides evaluation of nerve regeneration by means of histology, electrophysiology, and other in vivo and in vitro assessment techniques, functional recovery is the most important criterion to determine the degree of neural regeneration. Automated gait analysis allows recording of a vast quantity of gait-related parameters such as Paw Print Area and Paw Swing Speed as well as measures of inter-limb coordination. Additionally, the method provides digital data of the rats&#8217; paws after neuronal damage and during nerve regeneration, adding to our understanding of how peripheral and central nervous injuries affect their locomotor behavior. Besides the predominantly used sciatic nerve injury model, other models of peripheral nerve injury such as the femoral nerve can be studied by means of this method. In addition to injuries of the peripheral nervous systems, lesions of the central nervous system, e.g., spinal cord contusion can be evaluated. Valid and reproducible data assessment is strongly dependent on meticulous adjustment of the hard- and software settings prior to data acquisition. Additionally, proper training of the experimental animals is of crucial importance. This work aims to illustrate the use of computerized automated gait analysis to assess functional recovery in different animal models of peripheral nerve injury as well as spinal cord contusion injury. It also emphasizes the method&#8217;s limitations, e.g., evaluation of nerve regeneration in rats with sciatic nerve neurotmesis due to limited functional recovery. Therefore, this protocol is thought to help researchers interested in peripheral and central nervous injuries to assess functional recovery in rodent models.

Automated gait analysis is a feasible tool to evaluate functional recovery in rodent models of peripheral nerve injury and spinal cord contusion injury. While it requires only one setup to assess locomotor function in various experimental models, meticulous hard- and soft-ware adjustment and training of the animals is highly important.

Análise automatizada da marcha para avaliar a recuperação funcional em roedores com lesão de contusão do nervo periférico ou da medula espinhal

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and ...

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory bulb. Throughout adult life, they are key for axonal growing of newly generated olfactory neurons, from the lamina propria to the ONL. Due to their pro-regenerative properties, these cells have been used to foster axonal regeneration in spinal cord or optic nerve injury models.
We present an in vitro model to assay and measure OEG neuroregenerative capacity after neural injury. In this model, reversibly immortalized human OEG (ihOEG) is cultured as a monolayer, retinas are extracted from adult rats and retinal ganglion neurons (RGN) are cocultured onto the OEG monolayer. After 96 h, axonal and somatodendritic markers in RGNs are analyzed by immunofluorescence and the number of RGNs with axon and the mean axonal length/neuron are quantified.
This protocol has the advantage over other in vitro assays that rely on embryonic or postnatal neurons, that it evaluates OEG neuroregenerative properties in adult tissue. Also, it is not only useful for assessing the neuroregenerative potential of ihOEG but can be extended to different sources of OEG or other glial cells.

We present an in vitro model to assess olfactory ensheathing glia (OEG) neuroregenerative capacity, after neural injury. It is based on a coculture of axotomized adult retinal ganglion neurons (RGN) on OEG monolayers and subsequent study of axonal regeneration, by analyzing RGN axonal and somatodendritic markers.

Cocultura de Neurônios de Gânglio Axotomizado de Rato Retinal com Glia Ensheathing Olfactory, como um Modelo In Vitro de Regeneração Axonal Adulta

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...

Motor Dual-Tasks for Gait Analysis and Evaluation in Post-Stroke Patients

Eighteen stroke patients were recruited for this study involving the evaluation of cognition and walking ability and multitask gait analysis. Multitask gait analysis consisted of a single walking task (Task 0), a simple motor dual-task (water-holding, Task 1), and a complex motor dual-task (crossing obstacles, Task 2). The task of crossing obstacles was considered to be equivalent to the combination of a simple walking task and a complex motor task as it involved more nervous system, skeletal movement, and cognitive resources. To eliminate heterogeneity in the results of the gait analysis of the stroke patients, the dual-task gait cost values were calculated for various kinematic parameters. The major differences were observed in the proximal joint angles, especially in the angles of the trunk, pelvis, and hip joints, which were significantly larger in the dual motor tasks than in the single walking task. This research protocol aims to provide a basis for the clinical diagnosis of gait function and an in-depth study of motor control in stroke patients with motor control deficits through the analyses of dual-motor walking tasks.

This paper presents a protocol specifically for dual motor task gait analysis in stroke patients with motor control deficits.

Dupla tarefa motora para análise e avaliação da marcha em pacientes pós-AVE

Eighteen stroke patients were recruited for this study involving the evaluation of cognition and walking ability and multitask gait analysis. Multitask ...