PLATIM e droso-Tools instalações do UMS3444 Biosciences, Lyon, França. A pesquisa da BM foi apoiada por doações da Fondation pour la Recherche Médicale do CNRS (ATIP) ea ANR-12-BSV1-0019-01. PD foi apoiado por Retina França associação e da École Normale Supérieure de Lyon (França). CL foi apoiado por La Ligue Nationale contre le Cancer associação.

1. Cruzando com linhas de Tomate / GFP-FLP / FRT A geração de moscas que levam o clone mutante requer um único cruzamento entre uma linhagem mutante de transporte de FRT eo correspondente Tomate / GFP-FLP / FRT voar linha. Este trabalho utilizou a coleção BruinFly de mutações FRT-recombinados ( <a href="http://www.bruinfly.ucla.edu" target="_blank">http://www.bruinfly.ucla.edu</a> ). Quatro linhas de Tomate / GFP-FLP / DRF pode ser utilizado, realizando FRT Rh1-tdtomatoninaC em cada um dos braços do segundo e terceiro cromossomas combinados com fonte de flipase (ey-FLP) e expressão de GFP em todas as PRs exteriores (Rh1-Gal4 UAS -GFP) 20: - 2L braço: linha # 43345, P {ry [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1, P {ry [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2, w [*]; P {w [+ MC] = ninaE-tdTomato-ninaC} P {2L ry [+ t7.2] = neoFRT} 40A; P {w [+ MC] = UAS-GFP-ninaC} 3 - 2R braço: linha # 43346, P {ry [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1, P {ry [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2, w [*]; P {ry [+ t7.2] = neoFRT} 42D P{W [+ MC] = ninaE-tdTomato-ninaC} 2R; P {w [+ MC] = UAS-GFP-ninaC} 3 - 3L braço: linha # 43347, P {ry [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1, P {ry [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2, w [*]; P {w [+ MC] = UAS-GFP-ninaC} 2, P {w [+ MC] = ninaE-tdTomato-ninaC} P {3L ry [+ t7.2] = neoFRT} 80B/TM6B, Tb [1] - 3R braço: linha # 43348, P {ry [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1, P {ry [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2, w [*]; P {w [+ MC] = UAS-GFP-ninaC} 2, P {ry [+ t7.2] = neoFRT} P {82B w [+ MC] = ninaE-tdTomato-ninaC} 3R/TM6B, Tb [1] Estas quatro linhas estão disponíveis no centro das ações da Bloomington Drosophila. Eles fornecida uma fonte de FLP no olho em desenvolvimento para a geração de clones mitóticos 21. O tipo selvagem cromossomo carrega uma seqüência FRT e RH1-tdTomato ninaC construir codificando a tdTomato proteína fluorescente vermelha, como um marcador para o tipo selvagem e PRs exteriores heterozigotos. Nesta construção, os últimos 41 aminoácidos da isoforma p174 do ninaC (nem inactivação ou activação C) do gene foi apsuspensa, em-quadro para o C-terminal da sequência tdTomato. A cauda C-terminal da isoforma p174 ninaC é responsável pela localização rhabdomeral da proteína de 22 e permite melhor visualização vivo de RP fluorescentes vermelhas, utilizando a técnica de neutralização de córnea. O promotor é o mínimo RH1 234 pb (-152 82) RH1 promotor. O marcador fluorescente verde GFP é expresso por todas as PRs exteriores, devido à presença do RH1-Gal4 (3kb promotor) e UAS-GFP ninaC construções. Os cruzamentos entre um estoque mosca transportando uma mutação no cromossoma x FRT (FRT-x) e as linhas de Tomate / GFP-FLP / DRF produz uma descendência com o genótipo seguinte (exemplo de mutação em 2L): RH1-Gal4, ey-FLP ; FRT40A, RH1-tdTomato ninaC / FRT40A-x; UAS-GFP ninaC. Nestes moscas, as células mutantes homozigóticos são gerados por recombinação mitótico no disco olho em desenvolvimento e se dividem para gerar um clone de fotorreceptores mutantes homozigotos (Figura 2A). HomossexualAs células mutantes zygous pode ser identificada porque expressam apenas a proteína fluorescente verde (GFP), enquanto que o de tipo selvagem e as células heterozigóticas circundante expressar tanto tdTomato e GFP (Figuras 2B e B &quot;). 2. Preparando Drosophila para fotorreceptoras Visualization Para PR visualização pela técnica córnea neutralização, imobilizar moscas em placas de agarose. <ol><li> Prepare um frasco de lavagem cheio de água destilada a 4 ° C e coloque-o no gelo. </li><li> Dissolver agarose regular em água (1,2-1,5% de agarose em 100 ml de água), por aquecimento em um forno de microondas. Colocar o balão em um banho de água a 55 ° C e deixar a solução de agarose a arrefecer-se a esta temperatura. Manter a agarose a 55 ° C até à sua utilização. </li><li> Anestesiar as moscas com CO 2, durante pelo menos 1 min. </li><li> Verter a solução de agarose quente (a 55 ° C) em placas de Petri (35 x 10 mm, 1,37 x 0,39 cm) e colocar imediatamentediatamente a anestesiados Drosophila na agarose. Para os iniciantes, começando com 10 moscas por placa de Petri é razoável. Maior prato de Petri (60 x 15 mm, 2,362 x 0,59 cm) podem também ser utilizados. </li><li> Sob um microscópio de dissecação, orientar a Drosophila de lado, com uma pinça, empurrar uma asa em agarose, de modo a que a asa e metade do corpo são incorporadas em agarose (Figuras 3A-3A &quot;&quot;). Furar a outra asa sobre a superfície da agarose. Nota: Se as moscas não são incorporados profundamente o suficiente na agarose, a mosca estará livre para mover sua cabeça durante o exame do PR, e isso vai resultar em imagens desfocadas. A orientação do olho também será perturbado. Pode ser difícil de mergulhar a Drosophila em que a agarose, devido quer a concentração de agarose ou a sua temperatura. É mais fácil de incorporar em moscas de agarose mais concentrada, mas se a agarose é muito concentrado, a mosca pode afundar. Se a agarose é muito legal, pode ser difficult para incorporar a mosca, mas uma temperatura muito elevada pode causar danos na córnea. </li><li> Colocar a placa de Petri, em gelo e permitir que a agarose solidificar. </li><li> Com uma pinça, orientar a cabeça de tal modo que um olho é exposto à objectiva de imersão (Figura 3A &#39;e 3A &quot;&quot;). Geralmente, um olho pode ser considerado para ser bem orientada sob o microscópio de dissecação quando o pseudopupil (visualizada como uma mancha preta) está no meio do olho. Uma orientação óptima do olho maximiza a largura do campo ommatidial em que RP estão focados. O objectivo da etapa de orientação é encontrar a região do olho, com o mais vasto campo de RP focados, geralmente no centro do olho. Este passo também é útil para a remoção de quaisquer pernas ou aristae que cobre o olho e impedindo a sua visualização. </li><li> Cobrir a mosca com água gelada e deixar a placa de Petri, em gelo até à visualização. Água gelada mantém as moscas anestesiados. </li></ol> 3. VisualizandoFotorreceptores sob o microscópio Para a visualização da RP através da córnea, este protocolo utiliza um microscópio vertical equipado com uma objectiva de água, com uma distância de trabalho (W N-Achroplan 40X/0.75). <ol><li> Colocar a placa de Petri cobertas com água gelada sobre uma lâmina de vidro sobre a fase de microscópio (Figuras 3 BC). A placa de Petri podem ser colados à placa de vidro, o que torna possível a movê-lo sem problemas com os parafusos micrométricos. </li><li> Mergulhar a objectiva de imersão em água da placa de Petri (Figuras 3B&#39;-3C &#39;). Posicione a cabeça da mosca sob o feixe de excitação (começar com o filtro de GFP, por exemplo). Mova o palco cima e para baixo até que o feixe converge no olho. Quando o olho está no nível certo, tende a refletir a luz de excitação. </li><li> Olhe pela ocular para fluorescência. Quando o olho está posicionado no centro do campo de visão, o foco abaixocórnea para visualizar os fotorreceptores fluorescentes. </li></ol> Nota 1: Ao olhar através da ocular, pode ser desconfortável para distinguir as partes do corpo da mosca, principalmente a parte distal do abdômen e na cabeça, por exemplo. Nesses casos, você deve olhar diretamente para o palco para reposicionar a Drosophila. Nota 2: Classical fluorescência ou microscopia confocal pode ser usado. A microscopia confocal oferece imagens com menos de fundo e um amplo campo de PRs focadas do que a microscopia clássica. Um exemplo de configuração é um LSM510 microscópio confocal (Zeiss) com um objetivo água 40X. Melhores resultados podem ser obtidos com a abertura do orifício do microscópio confocal mais largo do que é normalmente recomendado para o objectivo. Por exemplo, usar um valor de 204, em vez de o padrão 98 para a abertura do furo. Nota 3: Níveis mais altos de w + pigmentação do olho reduzir a fluorescência de fundo. </p&gt; 4. Curso de tempo de visualização de células fotorreceptoras O cuidado é necessário quando a seguir o destino de um PR individuais dentro do mesmo olho ao longo de um período de tempo. <ol><li> Reduzir a temperatura de agarose a 45 ° C, para maximizar a sobrevivência de Drosophila. A agarose solidifica muito rapidamente a esta temperatura. Apenas um Drosophila deve ser usado por uma placa de Petri, para assegurar que as moscas não são misturados durante observações. </li><li> Sistematicamente posicionar as moscas do mesmo lado, para a visualização do mesmo olho. Isto pode ser conseguido tomando o mosca anestesiado do seu frasco por uma asa e colocando a Drosophila na agarose. Sempre orientar o olho da mesma maneira, se possível, tornando mais fácil para encontrar clones PR que foram vistos antes. </li><li> Identificar os clones com base na sua forma sob o microscópio confocal. O campo de visão é geralmente localizado ao lado do clone de interesse. Em such casos, os olhos devem ser reorientados debaixo de água, para o centro do campo de visão do clone de interesse, com base na polaridade do olho (Figura 4). </li></ol> 5. Recuperando Moscas após Visualization <ol><li> Remover a água da placa de Petri. </li><li> Puxe a Drosophila fora da agarose com uma pinça. </li><li> Seca-se a Drosophila num tecido. </li><li> Retorne a Drosophila para um frasco, garantindo que ele não fique preso no alimento. Permitiu a mosca para se volta a 25 ° C. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

O olho de Drosophila tem sido amplamente utilizada para decifrar as vias de sinalização que regulam o desenvolvimento, a sobrevivência e proliferação. No início de 1990, um grande número de telas genéticos foram realizados para identificar os caminhos necessários durante as fases iniciais de desenvolvimento do PR 25-27. A eficiência de telas genéticos foi aumentada grandemente através da técnica de recombinação mitótico, que faz com que seja possível testar as mutações de perda de função em clones de mosaico 21. Assim, o papel das mutações letais embrionárias poderiam ser sistematicamente testados em clones mutantes homozigotos nos olhos de moscas que eram de outra maneira heterozigotos. A maioria das projeções de mosaico têm-se centrado sobre o recrutamento PR cedo, a diferenciação, a projeção axonal ou morfogênese ocorrendo nas larvas ou pupas 10,25-31 desenvolvimento. Até o momento, apenas uma tela mosaico investigou os mecanismos que regulam a função adulto PR, através do monitoramento da resposta visual via electroretinOgram gravações 32. Com o método de Tomate / GFP-FLP / FRT ea possibilidade de realização de análise de curso de tempo em que vivem os animais mutantes, criamos um novo método para identificar os fatores que regulam adulto viabilidade PR e funcionar 20,24. O método de tomate / GFP-FLP / FRT tem várias vantagens importantes sobre o corte histológico clássico de olhos embebidos em resina. Em primeiro lugar, este método é muito mais rápido, mais barato e mais fácil de realizar do que o método histológico, desde que um microscópio de fluorescência equipado com um objetivo de imersão de água apropriado está disponível (ver Tabela de Reagentes e Equipamentos). Em segundo lugar, o método de tomate / GFP-FLP / DRF pode ser usado em conjunção com a expressão do transgene, tais como a expressão de P (UAS, w +), transportando uma mini-branco do transgene. Em contraste com os cortes histológicos, em que w + é utilizado para a detecção clonal no sistema de tomate / GFP-FLP / FRT, P (UAS, w +) não interfere com d clonaletection base de proteína fluorescente tomate. Usando P (UAS-FATP, w +) moscas transgénicas, fomos capazes de visualizar o resgate de PRs mutantes FATP (Figura 7). Em terceiro lugar, uma armadilha chave de todos os tipos de análise clonal, incluindo as baseadas em tomate / GFP-FLP / FRT, é a ambigüidade do genótipo de PRs perdidos. De facto, pode não ser claro se a PR está ausente, devido à falta de uma função de um gene específico, ou por causa de um efeito celular não autónomo, particularmente na fronteira entre o clone mutante. O método de tomate / GFP-FLP / FRT contorna este problema, para a degeneração, tornando possível seguir do tipo selvagem e mutantes PRs no mesmo animal em períodos de várias semanas. Nós fomos capazes de seguir o destino de PRs individuais por cinética análises sobre diferentes FATP moscas mutantes (Figura 6). O mesmo clone pode ser reconhecido num dado animal em momentos diferentes, por causa da forma precisa dos clones de tipo selvagem circundantes. Fomos capazes de mostrar inequívocaly que todos os PRs em falta foram mutante para FATP, indicando que o papel dos mutantes FATP em PRs é célula-autônoma. Assim, através da monitorização da perda de fotorreceptores na análise cinética, é possível determinar o genótipo de fotorreceptores em modelos de degeneração de início adulto. Finalmente, o método de tomate / GFP-FLP / FRT provou ser muito poderosa para a identificação de factores que regulam o estabelecimento de PCP 20. A possibilidade de atingir um grande número de ommatidia mosaico para um fenótipo de polaridade, sem a necessidade de secções, facilita a determinação rápida do PR requisito para o estabelecimento de PCP. No entanto, a análise mais fina da integridade PR exigiria o corte tradicional seguido por contraste de fase ou microscopia eletrônica. Em conclusão, o método de tomate / GFP-FLP / FRT abre novas possibilidades para a seleção mosaico eficiente para identificar os fatores que regulam os processos de desenvolvimento de relações públicas e funções adulto PR, como a visresposta ual e viabilidade.

A retina de Drosophila é composto de cerca de 800 unidades ommatidial (Figura 1A), que são precisamente organizados, com um eixo claramente definida de polaridade (Figura 1B). Cada unidade contém 20 células: oito células fotorreceptoras (PRS) e 12 células acessórias, incluindo cones, células de pigmento e de cerdas células 1,2. Duas classes de PR são distinguidas com base no tipo de rodopsina (Rh) que expressam. Os seis PRs exteriores (R1-6) expressam Rh1 e estão dispostos num padrão trapezoidal (Figura 1C). No centro do trapézio, os dois PRs interiores (R7/R8) expressar quatro tipos possíveis de rodopsina (RH3, RH4, RH5 ou RH6) e estão organizados de tal modo que R7 se encontra no topo da R8 3. Mais de 2.500 genes estão envolvidos na morfogênese do olho Drosophila 4, que provou ser um modelo muito poderosa para estudos de um grande painel de processos, incluindo o desen olhovolvimento, recrutamento PR, diferenciação, polaridade celular planar, morfogênese, a sobrevivência, a apoptose e transdução visuais 5-9. Os investigadores que trabalham no olho Drosophila têm, ao longo de muitos anos, desenvolveu técnicas de imagem da retina e realização telas genéticos sistemáticos. A maneira mais fácil para a imagem da retina adulta é olhar para a córnea em um animal imobilizado (Figura 1A). A estrutura da córnea pode ser visualizado precisamente por microscopia electrónica de varrimento e foi usado em uma tela genética em larga escala pelo consórcio URCFG ( <a href="http://www.bruinfly.ucla.edu" target="_blank">http://www.bruinfly.ucla.edu</a> ) 10. Esta é uma abordagem muito eficaz para a visualização de mudanças globais morfológicas na estrutura da córnea, tais como rugosidade olho ou brilho, muitas vezes induzidos por mutações em genes que controlam os primeiros passos no desenvolvimento ou viabilidade celular. No entanto, a visualização global de córnea não é sufficient para identificar os fatores que regulam PR rhabdomere morfogênese ou adulto PR viabilidade e função. Tais análises exigem uma investigação aprofundada mais de integridade PR, com base em microscopia de contraste de fase de secções de resina semi-finas tangenciais da retina 11-13. Esta técnica é adequada para análise de mosaico, em que RP mutantes podem ser identificadas pela sua falta de 14,15 pigmento vermelho. Clones mutantes Mosaico também pode ser visualizado em dissecções Todo-mount da pupa ou adulto retina, com base na sua falta de proteína verde fluorescente sinal (GFP) em microscopia de fluorescência 16,17. Estas duas técnicas são muito úteis, mas ambas são trabalhosas e demoradas e não são, portanto, adequados para o rastreio em larga escala. Nós e outros têm desenvolvido o uso de técnicas de córnea de neutralização para a imagiologia de RP produzindo proteínas fluorescentes 18,19, para facilitar a rápida análise de RP. Com esta técnica, mutanteOs clones podem ser identificados com base na autofluorescência do (w +) pigmento vermelho em adultos clones Drosophila mosaico. No entanto, este método não proporciona a resolução de uma única célula é necessária para tratar autonomia célula emite 19. Nós resolvemos esse problema através do desenvolvimento do método de Tomate / GFP-FLP / FRT, que combina a imagem de proteínas fluorescentes por neutralização córnea com recombinação mitótica 20. Este método permite que o alto rendimento, a identificação rápida e precisa de PRs mutantes em clones de mosaico, com resolução de uma única célula ( <a href="http://www.ens-lyon.fr/LBMC/ApoDrosoDatabase/" target="_blank">http://www.ens-lyon.fr/LBMC/ApoDrosoDatabase/</a> ). Ele é adequado para uso em análises cinéticas, para seguir PRs individuais ao longo de um período de semanas em viver Drosophila. Descrevemos aqui o método de tomate / GFP-FLP / FRT e dicas para a sua utilização em análises simples, cinéticos de olhos de mosaico.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Agarose</td>
			<td>
				Euromedex</td>
			<td>
				D5-E</td>
			<td>
				Regular agarose is used to immobilize the flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Petri dish</td>
			<td>
				BD Falcon</td>
			<td>
				353001</td>
			<td>
				35 x 10 mm, 1.37 x 0.39 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Cold-ice water</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				To maintain the flies anesthetized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				[HEADER]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Dissecting microscope</td>
			<td>
				Dutcher</td>
			<td>
				SMZ645</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Water Bath</td>
			<td>
				Julabo</td>
			<td>
				9550102</td>
			<td>
				To keep the agarose solution at warm temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				40X Water objective</td>
			<td>
				Zeiss</td>
			<td>
				420967-9900-000</td>
			<td>
				Water dipping objective for the confocal microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

	&nbsp;

the tomato/gfp-flp/frt method for live imaging of mosaic adult drosophila photoreceptor cells

O olho de Drosophila é largamente utilizado como um modelo para estudos de desenvolvimento e degeneração neuronal. Com a poderosa técnica de recombinação mitótico, telas elegantes genéticos baseados na análise clonal levaram à identificação de vias de sinalização envolvidos no desenvolvimento do olho e dos fotorreceptores (PR), a diferenciação em estádios larvares. Nós descrevemos aqui o método de tomate / GFP-FLP / DRF, o qual pode ser utilizado para análise rápida clonal no olho vivo adulto de Drosophila. As células fotorreceptoras fluorescentes são visualizados com a técnica de neutralização de córnea, em retinas com clones de mosaico gerados por recombinação mediada por flipase. Este método possui várias vantagens importantes sobre o seccionamento histológico clássico da retina: ele pode ser usado para o rastreio de alto rendimento e provou ser um método eficaz para identificar os factores que regulam PR sobrevivência e função. Ele pode ser utilizado para análises de cinética de PR degeneração da mesma estar animAl ao longo de várias semanas, para demonstrar a necessidade de genes específicos para PR a sobrevivência ou função na mosca adulta. Este método também é útil para abordar questões de autonomia em células mutantes para o desenvolvimento, tais como aqueles em que o estabelecimento da polaridade celular planar é afectada.

O método de tomate / GFP-FLP / DRF pode ser utilizado para estudar o efeito de uma mutação ou de expressão ectópica no desenvolvimento e sobrevivência de fotorreceptores na retina de Drosophila. Ele é rápido, tornando-o ideal para fins de rastreio, como demonstrado recentemente 20. A presença de PRs mutantes ao lado do tipo selvagem PRs no mesmo olho facilita a detecção de defeitos associados com PRs mutantes e para resolver a questão da autonomia celular. Os defeitos do desenvolvimento observados na nossa análise afectadas vários processos, incluindo o recrutamento de PR, a morfogénese e a polaridade da célula planar (PCP) estabelecimento (Figura 5). Sete na sua ausência é necessária para o recrutamento PR, em particular para R7 um do PR interior. A perda de sete em resultados revelia na perda do PR interior e alguns PRs exteriores (Figura 5A). Cabeça Granulado (GRH) está envolvido no estabelecimento PCP e alguns omatídeos são inverted em grh clones mutantes (Figura 5B). Este método faz com que seja possível identificar os fotorreceptores mutantes em ommatidia mosaico, permitindo a identificação das PRs em que é exigido o gene para a aquisição correcta da PCP. Mostrámos que grh é necessária para a aquisição correcta da PCP em R3 precursores 20. Com efeito, observou-se que, no ommatidia invertido, R4, que se origina a partir do precursor anormalmente R3, era sempre mutante. Migalhas (OCR) é uma proteína de membrana apical necessário para morfogênese rhabdomere 23. A perda de OCR nos resultados mutantes CRBS 11A22 em irregulares, PRs maiores ou menores (Figura 5C). Este método também pode ser usado para seguir o destino de RP individuais durante a vida adulta (Figura 6). É ideal para estudos de neurodegeneração, porque um grupo de fotorreceptores mutantes homozigóticos pode ser visto e o mesmo grupo pode ser encontrada no mesmo olho domesmo voar ao longo de um período de dias ou semanas. Por conseguinte, é possível determinar quais as RP sobreviver e que está destinado a morrer, porque cada clone tem uma forma única, que pode ser reconhecida quando o olho está posicionado sob o microscópio de fluorescência. À medida que a retina é polarizado, é possível orientar a retina para encontrar o mesmo clone de novo, na base da sua forma. Foi utilizado este método para mostrar que FATP k10307 mutação induz degeneração progressiva PR na idade adulta (Figura 6, 24). Este método de visualização pode também ser utilizado para analisar a autonomia da célula. Em FATP k10307 retina mosaico, perda PR foi restrito a FATP PRs mutantes, os PRs do tipo selvagem sendo afetados. A exigência de FATP para a viabilidade PR é, portanto, célula autônoma. Nós também foram capazes de resgatar o PR mutante FATP por reexpressing tipo selvagem FATP com um motorista RH1-Gal4 e uma construção UAS-FATP (Figura 7). Opossibilidade de realizar tais experiências de resgate é uma das vantagens do método de tomate / GFP-FLP / FRT sobre análise clonal com base em cortes histológicos da retina embedded-resina. Na verdade, a detecção de clones com o método do tomate / GFP-FLP / FRT não é afectada pela utilização de P (UAS, w +) construções de transgénicos, enquanto que a pigmentação vermelha associada com o gene de mini-branco (w +) cobre o olho com pigmento vermelho , mascarando clones de mosaico em cortes histológicos. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50610/50610fig1.jpg" /> Figura 1. Organização do olho Drosophila. (A) A fotografia de um olho Drosophila tirada com microscópio estereoscópico. O olho de Drosophila é composto de cerca de 800 ommatidia. (B) Esquema de um campo de 64 ommatidia no meio do olho. Os seis neurônios fotorreceptores exterior (PRS) de cada omatídeo,mostrado em verde, são organizados em um trapézio estereotipada que aponta para os pólos mais próximas do olho. Eles consequentemente apontar em direções opostas na ventral e na parte dorsal do olho e são imagem de espelho de acordo com a fronteira entre as duas partes, que é chamado o equador. (C) Diagrama esquemático de um omatídeo. Cada omatídeo contém oito PRs. PRs R1 a R6, mostrados em verde, são os PRs exteriores. Eles expressam a molécula fotossensível rhodopsin1 (Rh1) e são equivalentes a células de mamíferos rod. As PRs interiores, R7 e R8, são mostradas em cinza (R7 senta em cima do R8). As PRs internos expressar rodopsina 3, 4, 5 ou 6 e são o equivalente de células cone de mamíferos. Para simplificar, somente o rhabdomere, a parte sensível à luz do PR, é mostrado para cada PR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50610/50610fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <imgalt = &quot;Figura 2&quot; fo: content-width = src &quot;4.25in&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/50610/50610fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. Gerando e visualizando clones PR mosaico no olho Drosophila com o método de tomate / GFP-FLP / FRT. (A) Representação esquemática da geração de clones de mosaico do método de tomate / GFP-FLP / FRT. Os clones do mosaico são gerados por recombinação mitótico, devido à expressão do flipase (sob o controlo do promotor sem olhos) durante o desenvolvimento do olho e as sequências FRT. Após a recombinação da sequência DRF e divisão celular, mutante homozigótica, homozigóticos de tipo selvagem e as células heterozigóticas podem ser gerados a partir de uma célula heterozigótica. Essas células dividem-se novamente para formar clones mosaico de PRs no olho adulto. A identificação de células mutantes é facilitado pela inserção de um constructo que expressa o tdTomato proteína fluorescente vermelha no cromossoma de tipo selvagem, a rotular de tipo selvagem e as células heterozigóticas. (B-B&#39;&#39;) Visualização de clones PR mosaico com tmétodo que ele Tomate / GFP-FLP / FRT. O método de tomate / GFP-FLP / FRT combina recombinação mitótico, córnea neutralização e microscopia confocal. Todos os PRs expressar a GFP proteína verde fluorescente, que facilitam a visualização das PRs usando neutralização córnea e microscopia confocal (B). PRs podem ser visualizados em um nível de uma única célula. Os clones de mosaico mutantes são gerados por recombinação mitótico e podem ser identificados pela ausência da tdTomato proteína fluorescente vermelha (B &#39;). Consequentemente, em imagens fundidas, PRs homozigotos aparecem em verde, enquanto que do tipo selvagem e heterozigotos PRs são amarelos (B&#39;&#39;). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50610/50610fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50610/50610fig3.jpg" /> Figura 3. Configurando a Drosophila para visualizatíon de córnea neutralização. (A-A&#39;&#39;&#39;&#39;) de fotografias de uma Drosophila imobilizadas sobre uma placa cheia com agarose. No painel A&#39;&#39;&#39;&#39;, um pedaço de agarose contendo o mosca foi cortado para tirar uma fotografia do perfil. A Drosophila é meio embutido no agarose, com a direita dentro da agarose ea asa esquerda preso na superfície de agarose (A, A&#39;&#39;, A&#39;&#39;&#39;&#39;). Quando a Drosophila está incorporado no agarose, a cabeça é frequentemente mal posicionada para a visualização do olho (A, A &#39;). A cabeça deve, portanto, ser reorientado com uma pinça de tal modo que o centro do olho é que aponta para cima (A&#39;&#39;, A&#39;&#39; &#39;). (B-B&#39;) diagrama esquemático, mostrando um Drosophila imobilizado sobre uma placa de agarose e o posicionamento do Drosophila no âmbito do objectivo do microscópio. (C-C &#39;) As fotografias do pôr-do-Drosophila no palco domicroscópio sob o seu objetivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50610/50610fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50610/50610fig4.jpg" /> Figura 4. Orientação do olho para análise curso a tempo. A figura mostra fotografias de uma cabeça Drosophila em duas orientações diferentes e os campos correspondentes do ommatidia vistos por córnea neutralização, representados como diagramas esquemáticos. (A) Durante a primeira observação, o olho é colocado de tal modo que um clone de tipo selvagem ou heterozigótica RP (amarelo) é visto no meio do campo, ao nível do equador (linha a vermelho). (B) Durante a segunda observação, o olho, muitas vezes não é exactamente a mesma orientação. Assim, o mesmo grupo de fotorreceptores pode ser encontrado de novo, mas que não é possível ver omesmo campo exata (à esquerda). O olho deve ser reorientado para o mesmo campo para ser visto novamente. A posição do equador pode ser usada como um guia. Neste exemplo, sabemos que o campo observado é muito ventral e que o olho devem, portanto, ser transformado ventralmente para colocar o equador no meio do campo observado mais uma vez, tal como na primeira observação. <img alt="Figura 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50610/50610fig5.jpg" /> Figura 5. Exemplos de defeitos de desenvolvimento PR detectados pelo método de tomate / GFP-FLP / FRT. (A) Visualização da sina [BG02648] PRs mutantes mosaico, mostrando a perda de PRs internos. No ommatidia mutante, RP exteriores estão agrupados em conjunto, devido à ausência do interior PR R7. De fato, sina é conhecido por ser necessário para o recrutamento PR interior. (B) Visualização de grh mosaico [s2140] PRs mutantes mostrando defeitos de polaridade. O mosaico mutante ommatidia, surrundada por um círculo, estão apontando na direção oposta a partir do tipo selvagem ommatidia, indicando uma inversão dorso-ventral. Um estudo detalhado com o método de tomate / GFP-FLP / FRT mostrou que grh foi requerido na precursor R3 para a aquisição correta de omatídeo polaridade 20. (C) Visualização de crb [j1B5] PRs mutantes mosaico, mostrando PRs mutantes homozigotos deformadas. CRB é conhecido por ser necessária para a morfogênese rhabdomere. <img alt="Figura 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50610/50610fig6.jpg" /> Figura 6. Curso de Análise de Tempo de FATP mosaico [k10307] PRs mutantes com o método de Tomate / GFP-FLP / FRT, ao longo de 14 dias. Uma FATP mosaico [k10307] retina mutante é observado no dia 1 (A, A &#39;), dia 4 ( B, B &#39;), dia 8 (C, C&#39;) e no dia 14 (D, D &#39;) após a eclosão. O mesmo grupo de PRs mosaico pode ser fundaçõesd em cada ponto de tempo, no campo observado (rectângulo branco, A, B, C, D). Neste campo de PRs (A &#39;, B&#39;, C &#39;, D&#39;), PRs mutantes homozigotos são marcados em verde, enquanto PRs do tipo selvagem heterozigotos e homozigotos são marcados em amarelo. A partir do dia 4 (B &#39;) em diante, as PRs mutantes homozigotos começam a desaparecer, indicando que o FATP [k10307] mutação provoca uma degeneração progressiva dessas PRs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50610/50610fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50610/50610fig7.jpg" /> Figura 7. Resgate de FATP [k10307] PRs mutantes com um (A) Visualização de controle mosaico levando mini-branco-construir-expressando FATP. As PRs mosaico são visualizados com o método de tomate / GFP-FLP / FRT em moscas de 15 dias de idade. PRs. (B) Visualization de mosaico FATP PRs mutante, mostrando a perda de PRs mutantes. (C) Visualização de mosaico FATP PRs mutantes em um FATP mosca reexpressing no PR exterior (RH1&gt; FATP). As PRs mutantes são resgatados. A presença de um gene mini-branco e da pigmentação dos olhos vermelhos associado na RH1&gt; condições FATP não altera de tomate ou de fluorescência da GFP ou detecção clonal.

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The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

O método de tomate / GFP-FLP / FRT envolve visualizando células fotorreceptoras mosaico em viver Drosophila. Ele pode ser usado para seguir os destinos das células fotorreceptoras individuais na retina durante dias ou semanas. Este método é ideal para estudos de degeneração da retina e doenças neurodegenerativas ou o desenvolvimento de células fotorreceptoras.

O tomate / GFP-FLP / FRT Method for Imaging ao vivo de Mosaico Adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; As células fotorreceptoras

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

18.0K visualizações.  Ecole Normale Supérieure de Lyon.  O método de tomate / GFP-FLP / FRT envolve visualizando células fotorreceptoras mosaico em viver Drosophila. Ele pode ser usado para seguir os destinos das células fotorreceptoras individuais na retina durante dias ou semanas. Este método é ideal para estudos de degeneração da retina e doenças neurodegenerativas ou o desenvolvimento de células fotorreceptoras. 

Vídeo: The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Imagens ao vivo da migração das células da glia no Disco Drosophila Eye Imaginal

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Biologia

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

Elaboração de Drosophila Os embriões para Live-Imaging Usando o protocolo gota suspensa

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Imagens ao vivo de Drosophila melanogaster Embrionárias Migrações hemócitos

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Preparação de Desenvolvimento e Adultos Drosophila Brains e retina de imagens ao vivo

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment of live cells with micron-scale resolution1. Oxygen is one of the most important molecules in the cycle of life. It serves as the terminal electron acceptor of oxidative phosphorylation in the mitochondria and is used in the production of reactive oxygen species. Measurements of oxygen are important for the study of mitochondrial and metabolic functions, signaling pathways, effects of various stimuli, membrane permeability, and disease differentiation. Oxygen consumption is therefore an informative marker of cellular metabolism, which is broadly applicable to various biological systems from mitochondria to cells to whole organisms. Due to its importance, many methods have been developed for the measurements of oxygen in live systems. Current attempts to provide high-resolution oxygen imaging are based mainly on optical fluorescence and phosphorescence methods that fail to provide satisfactory results as they employ probes with high photo-toxicity and low oxygen sensitivity. ESR, which measures the signal from exogenous paramagnetic probes in the sample, is known to provide very accurate measurements of oxygen concentration. In a typical case, ESR measurements map the probe's lineshape broadening and/or relaxation-time shortening that are linked directly to the local oxygen concentration. (Oxygen is paramagnetic; therefore, when colliding with the exogenous paramagnetic probe, it shortness its relaxation times.) Traditionally, these types of experiments are carried out with low resolution, millimeter-scale ESR for small animals imaging. Here we show how ESR imaging can also be carried out in the micron-scale for the examination of small live samples. ESR micro-imaging is a relatively new methodology that enables the acquisition of spatially-resolved ESR signals with a resolution approaching 1 micron at room temperature2. The main aim of this protocol-paper is to show how this new method, along with newly developed oxygen-sensitive probes, can be applied to the mapping of oxygen levels in small live samples. A spatial resolution of ~30 x 30 x 100 &mu;m is demonstrated, with near-micromolar oxygen concentration sensitivity and sub-femtomole absolute oxygen sensitivity per voxel. The use of ESR micro-imaging for oxygen mapping near cells complements the currently available techniques based on micro-electrodes or fluorescence/phosphorescence. Furthermore, with the proper paramagnetic probe, it will also be readily applicable for intracellular oxygen micro-imaging, a capability which other methods find very difficult to achieve.

This protocol describes a method for micron-scale three-dimensional imaging of oxygen concentration in the immediate environment of live cells by electron spin resonance microscopy.

Ressonância paramagnética eletrônica Micro-imagem das Espécies ao vivo para o Mapeamento de oxigênio

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

Preparação Individual Drosophila Ovos Câmaras de imagens ao vivo

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Imagens ao vivo de Proteínas GFP-rotulados em<em&gt; Drosophila</em&gt; Oócitos

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

Formação de imagens 4D de agregação de proteínas em células vivas

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imagens ao vivo de Apuramento celular por apoptose durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogênese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...