The authors thank David Larson for developing the original protocol for imaging the live Drosophila pupal eye. We thank our colleagues Richard Carthew, Shoichiro Tsukita and Matthew Freeman, who developed the transgenic flies that we combined to generate our live-imaging fly lines. Brittany Baldwin-Hunter gave helpful comments on the manuscript. This work was supported by start-up funds awarded to Ruth Johnson by Wesleyan University.

A Figura 3 mostra um resumo do procedimento experimental. 1. Preparação do Tecido <ol><li> Para determinar as consequências de expressão modificada de um gene de interesse, configure o seguinte cruzamento em duplicado e mantida a 25 ° C: UAS-transgene (machos) X GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; NOTA + / SM5-TM6b (fêmeas virgens): Para obter o controle cruzado tecido UAS-lacZ machos para GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: fêmeas GFP. β-galactosidase não gera defeitos no comportamento de células na retina. </li><li> Para melhorar a eficácia de transgenes RNAi, cross UAS-RNAi machos para GMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b fêmeas virgens. NOTA: defeitos ocasionais no comportamento de células que expressam em retinas foram observados ectópica DCR-2 (dados não mostrados). Vigilância é recomendado se usar essa abordagem. </li><li> Seleito branco pré-pupas de genótipos adequados e coloque em 1,5 ml microtubos. Se as pupas expressar DCR-2, selecione pupas macho ou fêmea: expressão de UAS-DCR-2, uma inserção no cromossomo X, é mais forte nos machos. As pupas devem ser sexados a 0 hr APF antes de pigmentação do caso de pupa - as gônadas dos machos são visíveis como grandes globos translúcidos nas laterais da pupa (cerca de um terço do posterior). </li><li> Incubar microtubos contendo pupas, em um plástico ponta-box limpo a 25 ° C. Para evitar a dessecação de lugar pupas a 10 cm2 pedaço de tecido, embebido em água destilada, em ponta-box. NOTA: se a umidade na ponta-box se torna muito alto o caso de pupa pode ficar encharcado e difícil de dissecar em etapas subsequentes. </li><li> Incubar por tempo apropriado. Para capturar comportamentos celulares associados a padronização do olho, preparar pupas para geração de imagens em torno de 17 horas APF, 20 horas ou 24 horas APF APF. Veja resultados representativos para uma discussão mais aprofundada sobre quando os comportamentos específicos de células são melhor observados. </li><li> Coloque um pedaço de fita dupla face fresco em um Sylgard preto dissecção prato. Posicione um lado pupa, dorsal para cima, com a cabeça do pupa aderida à fita (Figura 1A) de dupla face .Try a não aderirem a região torácica e abdominal da pupa à fita dupla face. Com uma pinça cuidadosamente levantar e remover o opérculo para expor a cabeça de pupa. Rasgar ao longo do lado da caixa de pupa para expor a área em torno de um olho. </li><li> Remova cuidadosamente a pupa da fita adesiva. Se a pupa permanece aderente, aplique uma pequena quantidade de água destilada para a junção entre o caso de pupa e fita adesiva para enfraquecer a aderência. </li></ol> 2. Montagem <ol><li> Construa um pequeno 15 mm 2 moldura de papel mata-borrão e perfurar um buraco no middlethat é de 5,5 mm de diâmetro (Figura 1B). Mergulhe em água destilada e colocar emo centro de uma lâmina de microscópio. Usando uma seringa de 30 cc, esprema um anel uniforme de vaselina para cercar o quadro de papel mata-borrão. Certifique-se de que o anel de vaselina é marginalmente maior do que a largura da pupa e que o diâmetro do anel é ligeiramente menor que a largura de uma lamela de cobertura. </li><li> Adicionar uma pequena gota de vaselina directamente sobre a lâmina, no furo perfurado para o papel absorvente (Figura 1C) .Carefully providenciar a pupa, por seu lado, apoiado pelo rebordo vaselina (Figura 1D). </li><li> Coloque uma lamela em cima do anel de vaselina para que ele contata o epitélio acima do neuroepithelium olho (Figura 1D). Gentilmente comprimir a preparação para selar a lamela contra a vaselina e gerar uma pequena superfície de contato plana entre a região dos olhos pupa e lamela. </li></ol> 3. Imagem de Fluorescência <ol><li> Imagem a preparação de pupa usando ummicroscópio fluorescente. Cada 7 min captura secções em série através do domínio apical do neuroepitélio olho, na região das junções aderentes. NOTA: a) cortes seriados apropriados são geralmente 4-5 por z-stack composta de 0,2 um z-passos. b) Irregularidades na topologia do epitélio, incluindo colisões leves e dobras, pode tornar-se um desafio para adquirir imagens com foco de grandes regiões do tecido. Enquanto imagem, pode-se encontrar parte de uma área de interesse para ser em foco, e uma região vizinha de estar fora de foco. Incluindo uma pequena gota de água destilada entre o olho pupa e lamela pode eliminar algumas dobras de tecido aguda, mas não a característica topologia levemente desigual dos estágios iniciais da morfogênese olho de pupa. Nesses casos sobreamostra o tecido através do alargamento do z-stack até em foco fatias são adquiridos para todo o campo. c) A captura de cortes seriados a cada 7 min deve habilitar live-imagiologia por 3 a 4 horas sem uma redu significativasç ã o da intensidade da fluorescência da GFP que pode comprometer a qualidade da imagem. Intervalos de tempo mais curtos pode reduzir o tempo total da imagem. </li><li> Continuar imagiologia por 3 a 4 horas. Não use um foco automático e função do tempo que está disponível em muitos microscópios fluorescentes desde que o crescimento de pupa e bombeamento da hemolinfa move a posição da retina e vigilante re-focagem é necessária a cada 14-21 min. NOTA que a imagem para além das 4 horas podem retardar ou parar a morfogênese do olho. </li><li> Use software deconvolution apropriado para reduzir o fundo e aumentar o contraste das imagens de cortes de série. Para cada arquivo z-stack, faça o seguinte no software LAS AF (ver Tabela de Materiais): Vá até o painel Ferramentas, selecione Deconvolution 3D e clique em Aplicar. </li><li> Gerar imagem para cada arquivo de pilha deconvoluídos uma projeção máxima (MP): Vá até o painel Ferramentas, selecione Projeção 3D e clique em Aplicar. NOTA: O algoritmo de máxima de projeção pode falhar para gerar um uniformely imagem em foco para o tecido que foi oversampled. Uma técnica para afiar as regiões fora de foco é descrito na etapa 5.2. </li></ol> 4. Pós-Imaging Resgate Pupal e Verificação Fenótipo <ol><li> Para avaliar se os artefatos foram introduzidos ou a pupa prejudicado durante o exame, retire cuidadosamente a pupa da plataforma de imagem: usando uma pinça retire a lamela e transferir a pupa para um frasco limpo de alimentos. Guarde-o em temperatura ambiente ou 25 ° C até que a mosca adulta emerge. </li><li> Examine cuidadosamente o fenótipo do olho adulto e comparar com os olhos de moscas adultas emergentes da cruz fly inicial. </li></ol> 5. Processamento de Imagem <ol><li> Alinhamento automático Image: NOTA: O tecido Drosophila ao vivo vai mudar e crescer ao longo do processo de imagem. Consequentemente, os centros de imagens recolhidas nos sucessivos pontos de tempo pode não corresponder ao mesmo ponto no tecido Drosophila. Além disso, oToda disco retinal gira cerca de 30 ° entre ~ 21 e 23 hr APF. Para realçar os comportamentos de células individuais e reduzir as distrações causadas pelo crescimento do organismo, alinhe cada MP image.While esta pode ser realizada manualmente, o software de edição de imagem usada aqui (ver Tabela de Materiais) tem algoritmos internos que podem acelerar o processo. <ol><li> Na guia Arquivo do menu principal, Scripts Abrir e selecione Carregar arquivos em Stack. </li><li> Importe os arquivos de imagem MP no painel Layers de carga e selecione OK. Certifique-se de que a tentativa de alinhar automaticamente Fonte opção Imagens não está marcada. NOTA: Se esta opção for selecionada, o software pode utilizar um algoritmo de alinhamento que distorce os dados da imagem. </li><li> Uma vez que todos os arquivos MP ter carregado no painel de Layers, certifique-se que todas as imagens estão em ordem cronológica de tal forma que o ponto de tempo mais próximo está no topo da pilha de camadas. Se as camadas não estão na ordem correta, arraste e solte-os até que eles são ordenadoscorretamente. </li><li> Selecione Auto-Align Layers na guia Editar do menu principal. Escolha Reposition e clique em OK. </li><li> Se o algoritmo Auto-Align não consegue orientar os quadros para um ponto focal relevante, fazer pequenos ajustes usando a ferramenta Move. </li></ol></li><li> Afiação Composite: NOTA: regiões Fora de foco de uma imagem inicial MP pode ser aguçado por «culturas &#39;a pilha deconvoluídos correspondente no software LAS AF. Recorte de uma pilha permite um arquivo para restringir manualmente o intervalo de uma pilha-z que é submetido ao algoritmo de projecção máxima. <ol><li> Localize a função de corte no painel Ferramentas (na guia Processos). Restringir manualmente as fatias iniciais e finais, que abrangem apenas o cinto de adesão no interior da região inicialmente fora de foco. Clique em Aplicar para gerar um novo arquivo de pilha que é otimizado para esta região. </li><li> Gerar uma nova projeção máxima para a pilha otimizado localmente e exportação como um arquivo TIFF. </li><li> Em the software de edição de imagem (ver Tabela de Materiais), Scripts abertas (localizadas na guia Arquivo do menu principal) e selecione Carregar Arquivos na Pilha. </li><li> Importe o arquivo de imagem inicial MP e arquivo otimizado localmente MP para um ponto determinado momento no painel Layers de carga e selecione OK. Certifique-se de que a tentativa de alinhar automaticamente Fonte opção Imagens não está marcada. </li><li> Selecione as duas camadas nas camadas painel e em seguida, escolha Mesclar camadas automaticamente (localizado na guia Editar do menu principal) para mascarar automaticamente as regiões apropriadas das duas imagens, produzindo uma forma uniforme em foco campo da retina. Salve esta imagem composta como um arquivo TIFF. </li><li> Repita os passos 5.2.1 através de 5.2.5 para todas as imagens subótimas MP. </li></ol></li><li> Outros Ajustes: girar, cortar e ajustar os níveis das camadas de filmes: <ol><li> Com todas as camadas selecionadas, use a ferramenta Transform (Edit&gt; Free Transform) para girar as imagens, de modo que o eixo dorso-ventral da retina está alinhadopara o eixo y do quadro de filme. </li><li> Se necessário, use a ferramenta de corte para reduzir o campo de visão para um tamanho e forma desejados. </li><li> Use de ajuste do nível (de quadros individuais) para ajudar a aumentar o contraste entre a membrana celular e do corpo da célula. </li><li> Para efeitos estilísticos e enfatizar comportamentos de células específicas, apresentar falsa cor para destacar pontos de interesse em cada quadro. </li></ol></li><li> Animação: transformar as imagens em um filme: <ol><li> Abra o painel de Animação a partir da guia do Windows do menu principal. Selecione Criar Quadros de Camadas no menu localizado no canto superior direito do painel de Animação. </li><li> Note-se que as camadas são adicionadas ao painel de animação em ordem sequencial começando a partir do fundo da pilha. Para inverter a ordem dos quadros, primeiro selecione todos os quadros e, em seguida, selecione Inverter quadros a partir do menu do painel Animação. </li><li> Selecione um tempo de retardo de imagem para cada quadro usando o menu suspenso abaixo do polegar quadroprego. NOTA: O atraso de quadro para Movies 1-4 apresentada neste artigo é de 0,8 segundos. </li><li> Na guia Arquivo do menu principal, aberta Exportar e selecione Acabamento em Vídeo. Escolha QuickTime Export sob Opções de arquivo e selecione um formato de vídeo desejado. Sob rendem Opções definir Frame Rate para personalizada, insira uma taxa de quadros de 15, e clique em Render. </li></ol></li></ol>

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	<li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+cell-cell+adherens+junctions+reveals+that+Drosophila+mesoderm+invagination+begins+with+two+phases+of+apical+constriction+of+cells.">Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 493-501 (2001).</li><li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+features+of+adherens+junctions+during+Drosophila+embryonic+epithelial+morphogenesis+revealed+by+a+Dalpha-catenin-GFP+fusion+protein.">Dynamic features of adherens junctions during Drosophila embryonic epithelial morphogenesis revealed by a Dalpha-catenin-GFP fusion protein.</a> Dev. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+induction+of+patterning+and+programmed+cell+death+in+the+developing+Drosophila+retina.">Local induction of patterning and programmed cell death in the developing Drosophila retina.</a> Development. 125, 2327-2335 (1998).</li><li>Sawamoto, K., Okano, H., Kobayakawa, Y., Hayashi, S., Mikoshiba, K., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+argos+in+regulating+cell+fate+decisions+during+Drosophila+eye+and+wing+vein+development.">The function of argos in regulating cell fate decisions during Drosophila eye and wing vein development.</a> Dev. Biol. 164, 267-276 (1994).</li><li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pathway+of+signals+regulating+effector+and+initiator+caspases+in+the+developing+Drosophila+eye.">A pathway of signals regulating effector and initiator caspases in the developing Drosophila eye.</a> Development. 129, 3269-3278 (2002).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tugging+force+regulates+the+size+of+cell-cell+junctions.">Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 9944-9949 (2010).</li><li>Miyake, Y., Inoue, N., Nishimura, K., Kinoshita, N., Hosoya, H., Yonemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actomyosin+tension+is+required+for+correct+recruitment+of+adherens+junction+components+and+zonula+occludens+formation.">Actomyosin tension is required for correct recruitment of adherens junction components and zonula occludens formation.</a> Exp. Cell Res. 312, 1637-1650 (2006).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

A descrição de desenvolvimento do tipo selvagem (acima) constitui a base para a comparação de padrões de eventos em RNAi ou genótipos superexpressão. Comparações de desenvolvimento do tecido vivo são de valor inestimável para determinar precisamente quais os comportamentos celulares são regulados por uma proteína de interesse. Além disso, e não descrita aqui, imagem de células vivas permite que se faça descrições qualitativas e / ou quantitativas da função de um gene de interesse em que os eventos p...

O composto do olho de Drosophila é caracterizada por a disposição dos seus estereotipado ~ 750 ommatidia separadas por um favo de mel-reticulado de células de pigmento acessório 4,5. Estas células de pigmento são modeladas por uma combinação coordenada de eventos: movimentos locais de células, crescimento de células, alterações na forma da célula, e a apoptose. Visualização vivo deste epitélio permite estudar os mecanismos moleculares subjacentes a esses acontecimentos num contexto tridimensional fisiologicamente relevante e não perturbada. Em contraste com os protocolos anteriores 6,7, a técnica descrita aqui incorpora um método eficiente para estabilizar o movimento tecidos estranhos que não pode ser desacoplado do processo de imagiologia. Este método aumenta a estudos de comportamento de células no desenvolvimento de Drosophila epitélio pupa olho - um tecido que cresce, gira, e deslocamentos ao longo da imagem. Além disso, a estabilização de movimento técnica dedescrito aqui será útil para estudar as células em outros contextos em que ocorre o movimento estranho. Para visualizar os limites das células no campo de retina de Drosophila, mosca linhas transgénicas foram geradas que expressam ubi-DE-caderina: GFP, bem como UAS-α-catenina: GFP sob o controlo do controlador do olho GMR-GAL4 específico 1-3. A utilização de dois marcadores de membrana GFP permite a visualização de limites da célula com menor intensidade de luz. Isso minimiza o dano tecidual e fotodegradação na exposição repetida a comprimentos de onda de alta energia, permitindo uma maior taxa de quadros e duração do filme. Para melhorar a eficácia de transgenes RNAi, UAS-DCR-2 também foi incorporada uma segunda linha de fly 8. Numa terceira actualização de protocolos anteriores, um equipamento de imagem simples que pode ser facilmente montado na maioria dos laboratórios é descrito. Este aparelho elimina a exigência de ter uma imagem r especializadaig gerado por uma universidade &quot;máquina shop &#39;ou serviço similar. Este equipamento de imagem é semelhante ao utilizado para a imagem de outros tecidos pupa 9,10. É apresentado aqui um protocolo de imagens ao vivo de células simples que pode ser usado para avaliar directamente os eventos morfogenéticas que contribuem para a modelação do olho de ~ 17 e 42 horas após a formação pupário (hr APF). Especificamente, este protocolo permite que se determinar as conseqüências de modificar a expressão de genes durante o desenvolvimento de pupa.

<table><tbody><tr><td>GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b</td><td>Available on request from authors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b&amp;nbsp;</td><td>Available on request from authors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scotch double stick tape</td><td>3M</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>Black Sylgard dissection dish</td><td></td><td></td><td>Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 hr to polymerize</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG184</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard (Black)</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG170</td><td></td></tr><tr><td>Glass petri dish</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>25 x 75 x 1 mm glass microscope slide</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-413</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 mm glass coverslip</td><td>VWR</td><td>48393-172</td><td></td></tr><tr><td>Forceps&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 3mm Chromatography Paper</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-713-336</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-086-291</td><td>Or purchase at local pharmacy.</td></tr><tr><td>30 ml syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>S7510-30</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 DM microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

live-imaging of the drosophila pupal eye

Processos inerentes de Drosophila desenvolvimento pupal pode mudar e distorcer o epitélio olho nas maneiras que fazem comportamento célula individual difícil de controlar durante imagens de células vivas. Estes processos incluem: rotação da retina, crescimento celular e movimento do organismo. Além disso, as irregularidades na topologia do epitélio, incluindo colisões sutis e dobras muitas vezes apresentado como o pupa é preparado para a imagem latente, fazer-se um desafio para adquirir imagens com foco de mais do que alguns ommatidia em um único plano focal. O fluxo de trabalho descrito aqui remédios esses problemas, permitindo uma fácil análise de processos celulares durante Drosophila desenvolvimento pupal olho. Apropriadamente pupas-staged estão dispostos em uma plataforma de imagiologia que podem ser facilmente montados na maioria dos laboratórios de Ubiquitina-DE-caderina:. GFP e GMR-GAL4 UAS -driven-α-catenina: GFP são utilizados para visualizar os limites da célula no epitélio do olho 1 -3. Após deconvolution éaplicado a imagens fluorescentes capturados em múltiplos planos focais, as imagens de projecção máximos são gerados para cada ponto de tempo e aumentada utilizando software de edição de imagem. Algoritmos de alinhamento são usados ​​para estabilizar rapidamente movimento supérfluo, fazendo com que o comportamento das células individuais mais fácil de controlar.

Vivo-imaging do olho de pupa é uma estratégia bem-sucedida para observar o comportamento de células que contribuem para a padronização do neuroepithelium. O papel das proteínas específicas pode ser facilmente avaliada através da expressão de transgenes que modificam os níveis de proteína durante o desenvolvimento do olho. Para fazer isso GMR-GAL4 é utilizado para conduzir a expressão do transgene por trás do sulco morfogenética. Isto oferece a vantagem de não perturbar eventos anteriores que est...

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Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Vivo-imaging da<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

9.4K visualizações.  Wesleyan University. This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Vídeo: Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Em células vivas, imagens de células precursoras de órgãos sensoriais na Intact Drosophila As pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Neurociência

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Longo prazo Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco para os olhos

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Biologia do Desenvolvimento

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Imagens ao vivo da migração das células da glia no Disco Drosophila Eye Imaginal

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Biologia

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

Na Vivo Imagem latente da morfogênese músculo-tendão em pupas de Drosophila

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscópica de fluorescência para Tomografia In-vivo Imaging de desenvolvimento Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larval Neuroblastos

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Preparação de Desenvolvimento e Adultos Drosophila Brains e retina de imagens ao vivo

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

<meta charset="utf8"></head><body>Imagem ao vivo estendida da morfogênese da perna de pupa de Drosophila sem pupúrio

Long-Term Live Imaging of Drosophila Pupal Leg Development After Puparium Removal

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which fate-determined cells form three-dimensional organismal shapes remains unclear. Recent advances in confocal microscopy have facilitated efforts to observe cell dynamics during development through live imaging. The Drosophila melanogaster pupa is ideal for live imaging due to its immobility, transparent pupal cuticle, and the availability of fluorescent reporter lines. A primary challenge for imaging is the puparium, the cuticle surrounding the pupa, which obstructs optical imaging. While previous methods involved either partial or complete removal of the puparium, maintaining pupal viability for extended periods after this procedure has remained challenging. Here, a simple method is presented for days-long live imaging of the Drosophila leg during the pupal stage, involving complete puparium removal. The method includes removing the puparium from a pupa adhered to double-sided tape, followed by assembling a small chamber on a glass-bottom dish to enclose the pupa and a drop of water. This setup is straightforward, reliable, and supports extended pupal survival by preventing desiccation. Long-term live imaging of the Drosophila pupa has significantly contributed to capturing how the adult leg undergoes dramatic three-dimensional structural changes over 2-3 days. These changes include the transient formation of an intriguing structure (the Parthenon-like structure) by epithelial cells, rapid tissue narrowing, joint formation, and bristle elongation. This method is applicable to the observation of various tissues and can potentially be combined with other techniques, such as optical gene induction, to advance the understanding of cell dynamics during the final shape formation of tissues in the pupal stage.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Descobrindo estruturas epiteliais dinâmicas durante o desenvolvimento de Drosophila

Here, a protocol is presented for long-term live imaging of the Drosophila leg during the pupal stage, involving complete removal of the puparium. This protocol can also be applied to other tissues.

Imagem ao vivo de longo prazo do desenvolvimento da perna de pupa de Drosophila após a remoção do pupário

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which ...

Vivo-imaging da

Resumo

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Imagem ao vivo de longo prazo do desenvolvimento da perna de pupa de Drosophila após a remoção do pupário

Imagem ao vivo de longo prazo do desenvolvimento da perna de pupa de Drosophila após a remoção do pupário

Imagem ao vivo de longo prazo do desenvolvimento da perna de pupa de Drosophila após a remoção do pupário