The authors thank David Larson for developing the original protocol for imaging the live Drosophila pupal eye. We thank our colleagues Richard Carthew, Shoichiro Tsukita and Matthew Freeman, who developed the transgenic flies that we combined to generate our live-imaging fly lines. Brittany Baldwin-Hunter gave helpful comments on the manuscript. This work was supported by start-up funds awarded to Ruth Johnson by Wesleyan University.

A Figura 3 mostra um resumo do procedimento experimental. 1. Preparação do Tecido <ol><li> Para determinar as consequências de expressão modificada de um gene de interesse, configure o seguinte cruzamento em duplicado e mantida a 25 ° C: UAS-transgene (machos) X GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; NOTA + / SM5-TM6b (fêmeas virgens): Para obter o controle cruzado tecido UAS-lacZ machos para GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: fêmeas GFP. β-galactosidase não gera defeitos no comportamento de células na retina. </li><li> Para melhorar a eficácia de transgenes RNAi, cross UAS-RNAi machos para GMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b fêmeas virgens. NOTA: defeitos ocasionais no comportamento de células que expressam em retinas foram observados ectópica DCR-2 (dados não mostrados). Vigilância é recomendado se usar essa abordagem. </li><li> Seleito branco pré-pupas de genótipos adequados e coloque em 1,5 ml microtubos. Se as pupas expressar DCR-2, selecione pupas macho ou fêmea: expressão de UAS-DCR-2, uma inserção no cromossomo X, é mais forte nos machos. As pupas devem ser sexados a 0 hr APF antes de pigmentação do caso de pupa - as gônadas dos machos são visíveis como grandes globos translúcidos nas laterais da pupa (cerca de um terço do posterior). </li><li> Incubar microtubos contendo pupas, em um plástico ponta-box limpo a 25 ° C. Para evitar a dessecação de lugar pupas a 10 cm2 pedaço de tecido, embebido em água destilada, em ponta-box. NOTA: se a umidade na ponta-box se torna muito alto o caso de pupa pode ficar encharcado e difícil de dissecar em etapas subsequentes. </li><li> Incubar por tempo apropriado. Para capturar comportamentos celulares associados a padronização do olho, preparar pupas para geração de imagens em torno de 17 horas APF, 20 horas ou 24 horas APF APF. Veja resultados representativos para uma discussão mais aprofundada sobre quando os comportamentos específicos de células são melhor observados. </li><li> Coloque um pedaço de fita dupla face fresco em um Sylgard preto dissecção prato. Posicione um lado pupa, dorsal para cima, com a cabeça do pupa aderida à fita (Figura 1A) de dupla face .Try a não aderirem a região torácica e abdominal da pupa à fita dupla face. Com uma pinça cuidadosamente levantar e remover o opérculo para expor a cabeça de pupa. Rasgar ao longo do lado da caixa de pupa para expor a área em torno de um olho. </li><li> Remova cuidadosamente a pupa da fita adesiva. Se a pupa permanece aderente, aplique uma pequena quantidade de água destilada para a junção entre o caso de pupa e fita adesiva para enfraquecer a aderência. </li></ol> 2. Montagem <ol><li> Construa um pequeno 15 mm 2 moldura de papel mata-borrão e perfurar um buraco no middlethat é de 5,5 mm de diâmetro (Figura 1B). Mergulhe em água destilada e colocar emo centro de uma lâmina de microscópio. Usando uma seringa de 30 cc, esprema um anel uniforme de vaselina para cercar o quadro de papel mata-borrão. Certifique-se de que o anel de vaselina é marginalmente maior do que a largura da pupa e que o diâmetro do anel é ligeiramente menor que a largura de uma lamela de cobertura. </li><li> Adicionar uma pequena gota de vaselina directamente sobre a lâmina, no furo perfurado para o papel absorvente (Figura 1C) .Carefully providenciar a pupa, por seu lado, apoiado pelo rebordo vaselina (Figura 1D). </li><li> Coloque uma lamela em cima do anel de vaselina para que ele contata o epitélio acima do neuroepithelium olho (Figura 1D). Gentilmente comprimir a preparação para selar a lamela contra a vaselina e gerar uma pequena superfície de contato plana entre a região dos olhos pupa e lamela. </li></ol> 3. Imagem de Fluorescência <ol><li> Imagem a preparação de pupa usando ummicroscópio fluorescente. Cada 7 min captura secções em série através do domínio apical do neuroepitélio olho, na região das junções aderentes. NOTA: a) cortes seriados apropriados são geralmente 4-5 por z-stack composta de 0,2 um z-passos. b) Irregularidades na topologia do epitélio, incluindo colisões leves e dobras, pode tornar-se um desafio para adquirir imagens com foco de grandes regiões do tecido. Enquanto imagem, pode-se encontrar parte de uma área de interesse para ser em foco, e uma região vizinha de estar fora de foco. Incluindo uma pequena gota de água destilada entre o olho pupa e lamela pode eliminar algumas dobras de tecido aguda, mas não a característica topologia levemente desigual dos estágios iniciais da morfogênese olho de pupa. Nesses casos sobreamostra o tecido através do alargamento do z-stack até em foco fatias são adquiridos para todo o campo. c) A captura de cortes seriados a cada 7 min deve habilitar live-imagiologia por 3 a 4 horas sem uma redu significativasç ã o da intensidade da fluorescência da GFP que pode comprometer a qualidade da imagem. Intervalos de tempo mais curtos pode reduzir o tempo total da imagem. </li><li> Continuar imagiologia por 3 a 4 horas. Não use um foco automático e função do tempo que está disponível em muitos microscópios fluorescentes desde que o crescimento de pupa e bombeamento da hemolinfa move a posição da retina e vigilante re-focagem é necessária a cada 14-21 min. NOTA que a imagem para além das 4 horas podem retardar ou parar a morfogênese do olho. </li><li> Use software deconvolution apropriado para reduzir o fundo e aumentar o contraste das imagens de cortes de série. Para cada arquivo z-stack, faça o seguinte no software LAS AF (ver Tabela de Materiais): Vá até o painel Ferramentas, selecione Deconvolution 3D e clique em Aplicar. </li><li> Gerar imagem para cada arquivo de pilha deconvoluídos uma projeção máxima (MP): Vá até o painel Ferramentas, selecione Projeção 3D e clique em Aplicar. NOTA: O algoritmo de máxima de projeção pode falhar para gerar um uniformely imagem em foco para o tecido que foi oversampled. Uma técnica para afiar as regiões fora de foco é descrito na etapa 5.2. </li></ol> 4. Pós-Imaging Resgate Pupal e Verificação Fenótipo <ol><li> Para avaliar se os artefatos foram introduzidos ou a pupa prejudicado durante o exame, retire cuidadosamente a pupa da plataforma de imagem: usando uma pinça retire a lamela e transferir a pupa para um frasco limpo de alimentos. Guarde-o em temperatura ambiente ou 25 ° C até que a mosca adulta emerge. </li><li> Examine cuidadosamente o fenótipo do olho adulto e comparar com os olhos de moscas adultas emergentes da cruz fly inicial. </li></ol> 5. Processamento de Imagem <ol><li> Alinhamento automático Image: NOTA: O tecido Drosophila ao vivo vai mudar e crescer ao longo do processo de imagem. Consequentemente, os centros de imagens recolhidas nos sucessivos pontos de tempo pode não corresponder ao mesmo ponto no tecido Drosophila. Além disso, oToda disco retinal gira cerca de 30 ° entre ~ 21 e 23 hr APF. Para realçar os comportamentos de células individuais e reduzir as distrações causadas pelo crescimento do organismo, alinhe cada MP image.While esta pode ser realizada manualmente, o software de edição de imagem usada aqui (ver Tabela de Materiais) tem algoritmos internos que podem acelerar o processo. <ol><li> Na guia Arquivo do menu principal, Scripts Abrir e selecione Carregar arquivos em Stack. </li><li> Importe os arquivos de imagem MP no painel Layers de carga e selecione OK. Certifique-se de que a tentativa de alinhar automaticamente Fonte opção Imagens não está marcada. NOTA: Se esta opção for selecionada, o software pode utilizar um algoritmo de alinhamento que distorce os dados da imagem. </li><li> Uma vez que todos os arquivos MP ter carregado no painel de Layers, certifique-se que todas as imagens estão em ordem cronológica de tal forma que o ponto de tempo mais próximo está no topo da pilha de camadas. Se as camadas não estão na ordem correta, arraste e solte-os até que eles são ordenadoscorretamente. </li><li> Selecione Auto-Align Layers na guia Editar do menu principal. Escolha Reposition e clique em OK. </li><li> Se o algoritmo Auto-Align não consegue orientar os quadros para um ponto focal relevante, fazer pequenos ajustes usando a ferramenta Move. </li></ol></li><li> Afiação Composite: NOTA: regiões Fora de foco de uma imagem inicial MP pode ser aguçado por «culturas &#39;a pilha deconvoluídos correspondente no software LAS AF. Recorte de uma pilha permite um arquivo para restringir manualmente o intervalo de uma pilha-z que é submetido ao algoritmo de projecção máxima. <ol><li> Localize a função de corte no painel Ferramentas (na guia Processos). Restringir manualmente as fatias iniciais e finais, que abrangem apenas o cinto de adesão no interior da região inicialmente fora de foco. Clique em Aplicar para gerar um novo arquivo de pilha que é otimizado para esta região. </li><li> Gerar uma nova projeção máxima para a pilha otimizado localmente e exportação como um arquivo TIFF. </li><li> Em the software de edição de imagem (ver Tabela de Materiais), Scripts abertas (localizadas na guia Arquivo do menu principal) e selecione Carregar Arquivos na Pilha. </li><li> Importe o arquivo de imagem inicial MP e arquivo otimizado localmente MP para um ponto determinado momento no painel Layers de carga e selecione OK. Certifique-se de que a tentativa de alinhar automaticamente Fonte opção Imagens não está marcada. </li><li> Selecione as duas camadas nas camadas painel e em seguida, escolha Mesclar camadas automaticamente (localizado na guia Editar do menu principal) para mascarar automaticamente as regiões apropriadas das duas imagens, produzindo uma forma uniforme em foco campo da retina. Salve esta imagem composta como um arquivo TIFF. </li><li> Repita os passos 5.2.1 através de 5.2.5 para todas as imagens subótimas MP. </li></ol></li><li> Outros Ajustes: girar, cortar e ajustar os níveis das camadas de filmes: <ol><li> Com todas as camadas selecionadas, use a ferramenta Transform (Edit&gt; Free Transform) para girar as imagens, de modo que o eixo dorso-ventral da retina está alinhadopara o eixo y do quadro de filme. </li><li> Se necessário, use a ferramenta de corte para reduzir o campo de visão para um tamanho e forma desejados. </li><li> Use de ajuste do nível (de quadros individuais) para ajudar a aumentar o contraste entre a membrana celular e do corpo da célula. </li><li> Para efeitos estilísticos e enfatizar comportamentos de células específicas, apresentar falsa cor para destacar pontos de interesse em cada quadro. </li></ol></li><li> Animação: transformar as imagens em um filme: <ol><li> Abra o painel de Animação a partir da guia do Windows do menu principal. Selecione Criar Quadros de Camadas no menu localizado no canto superior direito do painel de Animação. </li><li> Note-se que as camadas são adicionadas ao painel de animação em ordem sequencial começando a partir do fundo da pilha. Para inverter a ordem dos quadros, primeiro selecione todos os quadros e, em seguida, selecione Inverter quadros a partir do menu do painel Animação. </li><li> Selecione um tempo de retardo de imagem para cada quadro usando o menu suspenso abaixo do polegar quadroprego. NOTA: O atraso de quadro para Movies 1-4 apresentada neste artigo é de 0,8 segundos. </li><li> Na guia Arquivo do menu principal, aberta Exportar e selecione Acabamento em Vídeo. Escolha QuickTime Export sob Opções de arquivo e selecione um formato de vídeo desejado. Sob rendem Opções definir Frame Rate para personalizada, insira uma taxa de quadros de 15, e clique em Render. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+cell-cell+adherens+junctions+reveals+that+Drosophila+mesoderm+invagination+begins+with+two+phases+of+apical+constriction+of+cells.">Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 493-501 (2001).</li><li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+features+of+adherens+junctions+during+Drosophila+embryonic+epithelial+morphogenesis+revealed+by+a+Dalpha-catenin-GFP+fusion+protein.">Dynamic features of adherens junctions during Drosophila embryonic epithelial morphogenesis revealed by a Dalpha-catenin-GFP fusion protein.</a> Dev. Genes Evol. 209, 218-225 (1999).</li><li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye.">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87, 651-660 (1996).</li><li>Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+specification+in+the+developing+Drosophila.+retina.">Cell fate specification in the developing Drosophila. retina.</a> Dev Suppl. , 19 (1993).</li><li>Wolff, T., Ready, D. F., Bate, M., Arias, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila.+retina.">Pattern formation in the Drosophila. retina.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 1277-1325 (1993).</li><li>Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+behavior+in+the+developing.+Drosophila+pupal+retina.">Cellular behavior in the developing. Drosophila pupal retina.</a> Mech. Dev. 125, 223-234 (2008).</li><li>Monserrate, J. P., Brachmann, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+death+zone:+a+spatially+restricted+region+for+programmed+cell+death+that+sculpts+the+fly+eye.">Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye.</a> Cell Death Differ. 14, 209-217 (2007).</li><li>Lee, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+Drosophila+Dicer-1+and+Dicer-2+in+the+siRNA/miRNA+silencing+pathways.">Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways.</a> Cell. 117, 69-81 (2004).</li><li>Zitserman, D., Roegiers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+sensory+organ+precursor+cells+in+intact+Drosophila+pupae.">Live-cell imaging of sensory organ precursor cells in intact Drosophila pupae.</a> J. Vis. Exp. (51), 2706 (2011).</li><li>Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis.">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).</li><li>Sato, M., Suzuki, T., Nakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waves+of+differentiation+in+the+fly+visual+system.">Waves of differentiation in the fly visual system.</a> Dev. Biol. 380, 1-11 (2013).</li><li>Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+wingless+in+an+early+pupal+cell+death+event+that+contributes+to+patterning+the+Drosophila+eye.">A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye.</a> Mech. Dev. 121, 1523-1530 (2004).</li><li>Larson, D. E., Johnson, R. I., Swat, M., Cordero, J. B., Glazier, J. A., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+simulation+of+cellular+patterning+within+the+Drosophila+pupal+eye.">Computer simulation of cellular patterning within the Drosophila pupal eye.</a> PLoS Comput. Biol. 6, e1000841 (2010).</li><li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+order+in+the+Drosophila+pupal+retina.">The emergence of order in the Drosophila pupal retina.</a> Dev. Biol. 136, 346-362 (1989).</li><li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+is+required+for+successive+cell+decisions+in+the+developing+Drosophila+retina.">Notch is required for successive cell decisions in the developing Drosophila retina.</a> Genes Dev. 1099, 1112 (1989).</li><li>Miller, D. T., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+induction+of+patterning+and+programmed+cell+death+in+the+developing+Drosophila+retina.">Local induction of patterning and programmed cell death in the developing Drosophila retina.</a> Development. 125, 2327-2335 (1998).</li><li>Sawamoto, K., Okano, H., Kobayakawa, Y., Hayashi, S., Mikoshiba, K., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+argos+in+regulating+cell+fate+decisions+during+Drosophila+eye+and+wing+vein+development.">The function of argos in regulating cell fate decisions during Drosophila eye and wing vein development.</a> Dev. Biol. 164, 267-276 (1994).</li><li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pathway+of+signals+regulating+effector+and+initiator+caspases+in+the+developing+Drosophila+eye.">A pathway of signals regulating effector and initiator caspases in the developing Drosophila eye.</a> Development. 129, 3269-3278 (2002).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tugging+force+regulates+the+size+of+cell-cell+junctions.">Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 9944-9949 (2010).</li><li>Miyake, Y., Inoue, N., Nishimura, K., Kinoshita, N., Hosoya, H., Yonemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actomyosin+tension+is+required+for+correct+recruitment+of+adherens+junction+components+and+zonula+occludens+formation.">Actomyosin tension is required for correct recruitment of adherens junction components and zonula occludens formation.</a> Exp. Cell Res. 312, 1637-1650 (2006).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

A descrição de desenvolvimento do tipo selvagem (acima) constitui a base para a comparação de padrões de eventos em RNAi ou genótipos superexpressão. Comparações de desenvolvimento do tecido vivo são de valor inestimável para determinar precisamente quais os comportamentos celulares são regulados por uma proteína de interesse. Além disso, e não descrita aqui, imagem de células vivas permite que se faça descrições qualitativas e / ou quantitativas da função de um gene de interesse em que os eventos p...

O composto do olho de Drosophila é caracterizada por a disposição dos seus estereotipado ~ 750 ommatidia separadas por um favo de mel-reticulado de células de pigmento acessório 4,5. Estas células de pigmento são modeladas por uma combinação coordenada de eventos: movimentos locais de células, crescimento de células, alterações na forma da célula, e a apoptose. Visualização vivo deste epitélio permite estudar os mecanismos moleculares subjacentes a esses acontecimentos num contexto tridimensional fisiologicamente relevante e não perturbada. Em contraste com os protocolos anteriores 6,7, a técnica descrita aqui incorpora um método eficiente para estabilizar o movimento tecidos estranhos que não pode ser desacoplado do processo de imagiologia. Este método aumenta a estudos de comportamento de células no desenvolvimento de Drosophila epitélio pupa olho - um tecido que cresce, gira, e deslocamentos ao longo da imagem. Além disso, a estabilização de movimento técnica dedescrito aqui será útil para estudar as células em outros contextos em que ocorre o movimento estranho. Para visualizar os limites das células no campo de retina de Drosophila, mosca linhas transgénicas foram geradas que expressam ubi-DE-caderina: GFP, bem como UAS-α-catenina: GFP sob o controlo do controlador do olho GMR-GAL4 específico 1-3. A utilização de dois marcadores de membrana GFP permite a visualização de limites da célula com menor intensidade de luz. Isso minimiza o dano tecidual e fotodegradação na exposição repetida a comprimentos de onda de alta energia, permitindo uma maior taxa de quadros e duração do filme. Para melhorar a eficácia de transgenes RNAi, UAS-DCR-2 também foi incorporada uma segunda linha de fly 8. Numa terceira actualização de protocolos anteriores, um equipamento de imagem simples que pode ser facilmente montado na maioria dos laboratórios é descrito. Este aparelho elimina a exigência de ter uma imagem r especializadaig gerado por uma universidade &quot;máquina shop &#39;ou serviço similar. Este equipamento de imagem é semelhante ao utilizado para a imagem de outros tecidos pupa 9,10. É apresentado aqui um protocolo de imagens ao vivo de células simples que pode ser usado para avaliar directamente os eventos morfogenéticas que contribuem para a modelação do olho de ~ 17 e 42 horas após a formação pupário (hr APF). Especificamente, este protocolo permite que se determinar as conseqüências de modificar a expressão de genes durante o desenvolvimento de pupa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="672">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:124px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;">GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b</td>
			<td>Available on request from authors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;">UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b&#160;</td>
			<td>Available on request from authors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Scotch double stick tape</td>
			<td style="width:124px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Black Sylgard dissection dish</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 h to polymerize</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sylgard</td>
			<td style="width:124px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">SYLG184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sylgard (Black)</td>
			<td style="width:124px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">SYLG170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Glass petri dish</td>
			<td style="width:124px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">25 x 75 x 1 mm glass microscope slide</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-550-413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">22 x 40 mm glass coverslip</td>
			<td style="width:124px;">VWR</td>
			<td>48393-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Whatman 3mm Chromatography Paper</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">05-713-336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Vaseline</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">19-086-291</td>
			<td>Or purchase at local pharmacy.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">30ml syringe</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S7510-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Adobe Photoshop CS5</td>
			<td style="width:124px;">Adobe</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Leica TCS SP5 DM microscope</td>
			<td style="width:124px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software</td>
			<td style="width:124px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-imaging of the drosophila pupal eye

Processos inerentes de Drosophila desenvolvimento pupal pode mudar e distorcer o epitélio olho nas maneiras que fazem comportamento célula individual difícil de controlar durante imagens de células vivas. Estes processos incluem: rotação da retina, crescimento celular e movimento do organismo. Além disso, as irregularidades na topologia do epitélio, incluindo colisões sutis e dobras muitas vezes apresentado como o pupa é preparado para a imagem latente, fazer-se um desafio para adquirir imagens com foco de mais do que alguns ommatidia em um único plano focal. O fluxo de trabalho descrito aqui remédios esses problemas, permitindo uma fácil análise de processos celulares durante Drosophila desenvolvimento pupal olho. Apropriadamente pupas-staged estão dispostos em uma plataforma de imagiologia que podem ser facilmente montados na maioria dos laboratórios de Ubiquitina-DE-caderina:. GFP e GMR-GAL4 UAS -driven-α-catenina: GFP são utilizados para visualizar os limites da célula no epitélio do olho 1 -3. Após deconvolution éaplicado a imagens fluorescentes capturados em múltiplos planos focais, as imagens de projecção máximos são gerados para cada ponto de tempo e aumentada utilizando software de edição de imagem. Algoritmos de alinhamento são usados ​​para estabilizar rapidamente movimento supérfluo, fazendo com que o comportamento das células individuais mais fácil de controlar.

Vivo-imaging do olho de pupa é uma estratégia bem-sucedida para observar o comportamento de células que contribuem para a padronização do neuroepithelium. O papel das proteínas específicas pode ser facilmente avaliada através da expressão de transgenes que modificam os níveis de proteína durante o desenvolvimento do olho. Para fazer isso GMR-GAL4 é utilizado para conduzir a expressão do transgene por trás do sulco morfogenética. Isto oferece a vantagem de não perturbar eventos anteriores que est...

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Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Vivo-imaging da<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

9.3K visualizações.  Wesleyan University. This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Vídeo: Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Longo prazo Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco para os olhos

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Biologia do Desenvolvimento

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells named wing imaginal discs formed during embryonic development. In the larval stages the imaginal discs grow, increasing its number of cells and forming monolayered epithelial&#160;structures. Inside the pupal case, the imaginal discs bud out and fold into bilayers along a line that becomes the future margin of the wing. During this process, the longitudinal primodia veins originate vein cells on the prospective dorsal and ventral surfaces of the wing. During the pupal stage the stripes of vein cells of each surface communicate in order to generate tight tubes; at the same time, the cross-veins begin their formation.
With the help of appropriate molecular markers, it is possible to identify the major elements composing the wing during its development. For this reason, the ability to accurately detect transcripts or proteins in this structure is critical for studying their abundance and localization related to the development process of the wing.
The procedure described here focuses on manipulating pupal wings, providing detailed instructions on how to dissect the wing during the pupal stage. The dissection of pupal tissue is more difficult to perform than their counterparts in third instar larvae. This is why this approach was developed, to obtain rapid and efficient high quality samples. Details of how to immunostain and mount these wing samples, to allow the visualization of proteins or cell components, are provided in the protocol. With little expertise it is possible to collect 8-10 high quality pupal wings in a short amount of time.

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

The ability to accurately detect transcripts or proteins in Drosophila tissues is critical for studying their abundance and localization related to the development process. Here is the description of a straightforward procedure to dissect pupal wings. These wings can be used as samples in several techniques (immunohistochemistry, PCR assay, etc.).

Um método rápido e eficiente para dissecar asas Pupal de Drosophila apropriado para Immunodetections ou ensaios PCR

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Bioengenharia de microrganismos humanizados de medula óssea no mouse e sua visualização por imagem ao vivo

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imagem ao vivo do mouse Fusão do palato secundário

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

Dissecção e coloração dos ovários Pupal drosófila

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

Dissecação da Retina Pupal drosófila para imuno-histoquímica, análise ocidental e isolamento de RNA

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Imagens ao vivo e análise de contrações musculares no embrião de Drosophila

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Descongelamento, cultivo e Cryopreserving linhas de células de Drosophila

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

Imagem e Análise da Dinâmica de Orientação e Crescimento tecidual na Epitélia Drosophila em Desenvolvimento durante os estágios pupal

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

Preparação de Drosophila Larval e Pupal Testes para Análise de Divisão Celular em Tecido Vivo e Intacto

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...