Uma parte deste trabalho teve o apoio financeiro do Instituto para a Promoção da Inovação pela Ciência e Tecnologia-Strategic Research Básico (IWT-SBO) Sunlight projeto e células biosolar. Erik Bolder e BackKim Nguyen são reconhecidos por sua contribuição para a otimização do processo de espancamento talão.

1. Preparação de Amostras Existem dois protocolos alternativos para a preparação de amostras compreendidos como os passos 1.1 e 1.2. Ambos os métodos são igualmente adequados e dão resultados semelhantes, mas se uma quantidade limitada de volume da cultura de algas está disponível, o método 1,1 é recomendada. NOTA: Para ambos os protocolos, preparar dois tubos talão batedor adicionais de acordo com o protocolo inteiro mas sem a adição de algas para que sejam usados ​​como um branco. Deste modo, os picos do cromatograma de GC resultante da extracção de componentes a partir de materiais usados ​​podem ser identificados e quantificados. 1.1. Preparação de amostras Protocolo Opção 1: recomendado quando uma quantidade limitada de Algas Cultura está disponível <ol><li> Determinar a concentração de algas peso seco (g / L) no caldo de cultura, por exemplo, como descrito por Breuer et ai. 1. </li><li> Transferir um volume de caldo de cultura que contém 5-10 mg de peso seco de algas paraum tubo de centrífuga de vidro. Calcule a quantidade exata de biomassa transferidos usando a concentração de biomassa determinada no passo 1.1.1. </li><li> Centrifugar 5 min a 1200 x g. </li><li> Descarte parte do sobrenadante, deixe cerca de 0,25 ml no tubo. </li><li> Re-suspender as algas no sobrenadante remanescente por pipetagem suave do sedimento cima e para baixo e transferir o sedimento de células completa para um tubo misturador de reforço usando uma pipeta de 200 uL. </li><li> Lavar o tubo de centrífuga de vidro e pipeta com ± 0,15 ml de água milliQ e transferir o líquido para o mesmo tubo de batedor de esferas. </li><li> Tubos de centrífuga de talão batedor durante um minuto a rotação máxima para garantir que não permanecem bolhas de ar na parte inferior dos tubos. É possível armazenar tubos talão batedor fechados à temperatura de -80 ° C. </li><li> Liofilização os tubos talão batedor contendo a amostra. É possível armazenar os tubos talão batedor fechados a -80 ° C. </li></ol> 1.2. Preparação de amostras Protocolo Opção 2 <ol><li> Centrifugar um volume indeterminado de caldo de cultura de algas e descartar o sobrenadante. Não é necessário para determinar a concentração de biomassa ou a medição do volume utilizado. </li><li> Medir ou calcular a osmolaridade do meio de cultura, utilizando a concentração dos sais principais presentes no meio de cultura. </li><li> Lava-se a pelete de células por ressuspensão do sedimento celular, no mesmo volume, tal como utilizado no passo 1.2.1, de uma solução de formato de amónio, o qual se aproxima a osmolaridade do meio de cultura. Uma solução de formato de amónio equiosmolar impede lise das células durante a lavagem das células. </li></ol> NOTA: A lavagem de células é necessário para remover os sais presentes no meio de cultura. Isto é especialmente importante para a análise de ácidos gordos em microalgas marinhas porque as concentrações elevadas de sal no seu meio de cultura. Se os sais ainda estaria presente, isso iria causar superestimação da quantidade de peso seco de células que será determinado mais tarde, em tseu protocolo. Formato de amónio é usado para lavar as células porque esta solução irá evaporar-se durante a liofilização e não deixa qualquer resíduo. <ol start="4"><li> Suspensão Centrífuga algas e elimine o sobrenadante. </li><li> Liofiliza-se o sedimento de células. </li><li> Pesar 5-10 mg de pó liofilizado de microalgas para um tubo de batedor de esferas. Registre o peso exato. </li></ol> 2. O rompimento celular e extração de lipídios NOTA: Esta seção descreve um procedimento de rompimento celular extensa. Possivelmente, alguns dos passos rompimento celular são redundantes e menos extensa rompimento celular pode produzir os mesmos resultados para algumas espécies de microalgas ou para a biomassa derivada de certas condições de cultivo. Isto precisa de validação para cada situação específica no entanto. Portanto, o extenso protocolo rompimento proposto é recomendada como um método universal adequado para todos os materiais de microalgas. <ol><li> Pesar uma quantidade exata de tripentadecanoin (triacylglycerol contendo três C15: 0 Ácidos gordos) e adiciona-se a uma quantidade conhecida com exactidão de 04:05 (v / v) de clorofórmio: metanol. Desta forma, a concentração de tripentadecanoin é exactamente conhecida. Apontar para uma concentração de 50 mg / L. Tripentadecanoin serve como padrão interno para quantificação de ácidos graxos. </li><li> Adicionar 1 ml de clorofórmio: metanol 04:05 (v / v) contendo tripentadecanoin a cada tubo de batimento (especificado nos reagentes e equipamento de mesa). Verificar que não existem pérolas que ficaram no interior da tampa do tubo de beadbeater, isto irá resultar em fugas dos tubos. Usar uma pipeta de deslocamento positivo para a adição exacta de solventes. </li><li> Bead bater os tubos talão batedor 8x a 2.500 rpm por 60 segundos, cada vez com um segundo 120 interna entre cada batimento. </li><li> Transferir a solução dos tubos talão batedor para a 15 ml tubo de centrífuga de vidro limpo, resistente ao calor com inserção Teflon screw-caps. Certifique-se de transferir todas as contas do tubo batedor talão também. </li><li> Para erah tubo batedor grânulo, adicionar 1 ml de clorofórmio: metanol 04:05 (v / v) contendo tripentadecanoin no tubo batedor talão, perto da tampa, misture e transfira esta solução para o mesmo tubo de vidro a partir do passo 2.4. Lavar o tubo três vezes (um total de 4 ml de clorofórmio: metanol 04:05 (v / v) contendo tripentadecanoin é utilizado por exemplo - 1 ml adicionados na etapa 2,2 e 3 ml de 3 passos de lavagem). </li><li> Vortex os tubos de vidro de 5 seg e sonicado num banho de ultra-sons durante 10 min. </li><li> Adicionar 2,5 ml de água MilliQ, contendo 50 mM de 2-amino-2-hidroximetil-propano-1 ,3-diol (tris) e 1 M de NaCl, a qual é definida como a pH 7 usando uma solução de HCl. Isto irá causar uma separação de fases entre clorofórmio e metanol: água. NaCl 1 M é usado para melhorar o equilíbrio de lípidos para a fase de clorofórmio. </li><li> Vortex durante 5 segundos e, em seguida, sonicar durante 10 min. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 1200 x g. </li><li> Transferir toda a fase de clorofórmio (fase inferior) para um tubo de vidro limpo usando uma pipeta Pasteur de vidroe. Certifique-se a não transferir qualquer interfase ou fase superior. </li><li> Re-extrair a amostra por adição de 1 ml de clorofórmio ao tubo velho (contendo a solução de metanol: água). </li><li> Vortex durante 5 segundos e, em seguida, sonicar durante 10 min. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 1200 x g. </li><li> Recolher a fase clorofórmio (fase inferior) com uma pipeta de Pasteur de vidro e piscina com a primeira fração clorofórmio do passo 2.10. </li><li> Se as dificuldades são vivenciadas na coleta da fração clorofórmio inteiro na etapa anterior, repita os passos de 2,11-2,14. Caso contrário, continue com a etapa 2.16. </li><li> Evapora-se o clorofórmio a partir do tubo num fluxo de azoto gasoso. Após este passo as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C sob uma atmosfera de azoto gasoso. </li></ol> 3. Transesterificação de ésteres metílicos de ácidos graxos <ol><li> Adicionar 3 ml de metanol contendo 5% (v / v) de ácido sulfúrico para o tubo contendo os lípidos extraídos foram secos (tubo originalmente contêm a fracção de clorofórmio) efechar o tubo bem. </li><li> Vortex por 5 seg. </li><li> Incubar as amostras durante 3 horas a 70 ° C num bloco de aquecimento ou banho-maria. Periodicamente (a cada 30 min ±) garantir que as amostras não são fervente (causada por uma tampa de forma inadequada fechado) e tubos de vórtice. Durante esta reacção de ácidos gordos são metilados para os seus ésteres metílicos dos ácidos gordos (FAMEs). </li><li> Amostras de arrefecer à temperatura ambiente e adicionar 3 ml de água MilliQ e 3 ml de n-hexano. </li><li> Vortex durante 5 seg e misturar durante 15 minutos com um rotor tubo de ensaio. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 1200 x g. </li><li> Recolher 2 ml da fase de hexano (em cima) e colocar no tubo de vidro fresco utilizando uma pipeta Pasteur de vidro. </li><li> Adicionar 2 ml de água MilliQ para a fase de hexano recolhido para lavá-la. </li><li> Vortex durante 5 seg e centrifuga-se durante 5 min a 1200 x g. Após este passo, é possível guardar as amostras a -20 ° C sob atmosfera de azoto gasoso (não necessária separação de fase). </li></ol> 4. Quantificação de L EMAGsCromatografia Gasosa cantar <ol><li> Encher frascos de GC com a fase de hexano (fase superior) usando uma pipeta de Pasteur de vidro. </li><li> Coloque as tampas nos frascos de GC. Certifique-se as tampas são completamente selado, e não pode ser ligado, para evitar a evaporação a partir do frasco. </li><li> Encher os solventes de lavagem GC (hexano), esvazie os frascos de resíduos, e colocar em frascos de amostra auto-amostrador. Antes de executar as amostras reais no GC, executado pela primeira vez dois espaços em branco contendo apenas hexano no GC. </li><li> Executar as amostras sobre um GC-FID com uma coluna Nukol (30 mx 0,53 milímetros x 1,0 mm). Use uma temperatura de admissão de 250 ° C e utilizar hélio como gás transportador, a pressão de 81,7 kPa e taxa de divisão de 0,1:1, a taxa de fluxo total: 20 ml / min. FID temperatura do detector de 270 ° C com H 2 taxa de fluxo de 40 ml / min, taxa de fluxo de ar de 400 ml / min e Ele taxa de 9,3 ml / min de fluxo. Definir o volume de injeção de 1 ml / amostra. Injetor de pré e pós-lavagem com n-hexano. Temperatura do forno inicial é definido como 90 ° C durante 0,5 min e, em seguida, levantadas with 20 ° C / min até uma temperatura do forno de 200 ° C, é alcançado. A temperatura do forno é depois mantida a 200 ° C durante 39 min. O tempo total de execução é de 45 min. </li></ol>

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Autores têm nada a revelar.

O método descrito pode ser usado para determinar o conteúdo, bem como a composição dos ácidos gordos totais presentes na biomassa de microalgas. Ácidos gordos derivados a partir de todas as classes de lípidos, incluindo o armazenamento (TAG), bem como lípidos da membrana (fosfolípidos e glicolípidos), são detectados. Todos os comprimentos de cadeias de ácidos gordos e de graus de saturação, que estão presentes no microalgas podem ser detectados e distinguidos. O método baseia-se na ruptura mecânica da c...

Os ácidos gordos são um dos principais constituintes de biomassa de microalgas e normalmente fazem-se entre 5-50% do peso seco da célula 1-3. Eles estão presentes principalmente na forma de glycerolipids. Estes, por sua vez glycerolipids consistem principalmente de fosfolipídios, glicolipídios e triacilglicerol (TAG). Especialmente os ácidos graxos presentes no TAG são de interesse comercial, porque eles podem ser usados ​​como um recurso para a produção de combustíveis de transporte, produtos químicos a granel, nutracêuticos (ω-3 ácidos graxos) e produtos alimentares 3-6. Microalgas podem crescer em meios de cultura à base de água do mar, pode ter uma produtividade de área muito maior do que as plantas terrestres, e podem ser cultivadas em fotobiorreatores em locais que não são adequados para a agricultura, possivelmente, até mesmo no mar. Por estas razões, as microalgas são muitas vezes considerados uma alternativa promissora para as plantas terrestres para a produção de biodiesel e outros produtos a granel 3-6. Potencialmente nenhum l agrícolae ou de água doce (quando cultivadas em fotobiorreatores fechados ou quando microalgas marinhas são utilizadas) é necessário para a sua produção. Portanto, os biocombustíveis derivados de microalgas são consideradas 3 ª geração de biocombustíveis. O conteúdo celular total de ácidos gordos (% de peso seco), a composição de classe de lípidos, bem como o ácido gordo de comprimento e grau de saturação é altamente variável entre espécies de microalgas. Além disso, estas propriedades variam com as condições de cultura, tais como a disponibilidade de nutrientes, temperatura, pH, e a intensidade da luz de 1,2. Por exemplo, quando expostos à privação de nitrogênio, as microalgas podem acumular grandes quantidades de TAG. Sob condições óptimas de crescimento TAG constitui tipicamente menos de 2% de peso seco, mas quando expostos a azoto inanição conteúdo de TAG pode aumentar até 40% do peso seco das microalgas 1. Microalgas principalmente produzir ácidos graxos com comprimentos de cadeia de 16 e 18átomos de carbono, mas algumas espécies podem produzir ácidos gordos de até 24 átomos de carbono de comprimento. Ambos saturado, bem como os ácidos gordos altamente insaturados são produzidos por microalgas. Estes últimos incluem ácidos graxos com benefícios nutricionais (ω-3 os ácidos gordos) como C20: 5 (ácido eicosapentaenóico, EPA) e C22: 6 (ácido docosahexaenóico, DHA) para os quais não existam alternativas vegetais 1,2,4,7. O (distribuição de) ácidos graxos de comprimento de cadeia e grau de saturação também determina as propriedades e qualidade dos biocombustíveis derivados de algas e óleos comestíveis 4,8. Para desenvolver aplicativos comerciais de ácidos graxos de microalgas derivada, são necessários métodos analíticos confiáveis ​​para quantificação do teor de ácidos graxos e composição. Como também apontado por Ryckebosch et al. 9, a análise de ácidos graxos em microalgas se distingue de outros substratos (por exemplo, óleo vegetal, produtos alimentícios, tecidos animais, etc) sercausar 1) microalgas são células isoladas rodeadas por paredes celulares rígidas, o que complica a extracção de lípidos, 2) microalgas conter uma grande variedade de classes de lípidos e a distribuição de classe de lípidos é altamente variável 7. Estas classes de lípidos diferentes têm uma grande variedade em termos de estrutura química e propriedades, tais como a polaridade. Além disso, outros lípidos de acilo classes de lípidos são produzidos, 3) microalgas conter uma grande variedade de ácidos gordos, desde 12-24 átomos de carbono de comprimento e contendo tanto saturado, bem como os ácidos gordos altamente insaturados. Assim, os métodos desenvolvidos para analisar os ácidos gordos em outros substratos de microalgas, pode não ser adequada para a análise de ácidos gordos em microalgas. Como revisto por Ryckebosch et al. 9, a diferença principal entre os procedimentos de extracção de lípidos vulgarmente usados ​​é nos sistemas de solventes que são usados. Por causa da grande variedade de classes de lípidos presentes no microalgas, cada um variando de polaridade, a extraídaquantidade de lípido irá variar de acordo com os solventes utilizados 10-12. Isto leva a inconsistências no conteúdo e composição apresentada na literatura 9,10 lipídico. Dependendo do sistema de solvente utilizado, os métodos baseados na extracção de solvente, sem ruptura da célula por meio de, por exemplo, batimento do grânulo ou de ultra-sons, pode não extrair todos os lípidos, devido à estrutura rígida de algumas espécies de microalgas 9,13. No caso de extracção de lípidos incompleta, a eficiência da extracção de diferentes classes de lípidos pode variar 14. Este pode também ter um efeito na composição de ácidos gordos medidos, porque a composição do ácido gordo é variável entre as classes de lípidos 7. O nosso método baseia-se numa sequência de ruptura mecânica da célula, a extracção de lípidos à base de solvente, a transesterificação dos ésteres de ácidos gordos a metílicos dos ácidos gordos (FAMEs), e quantificação e identificação dos EMAG utilizando cromatografia de gás, em combinação com uma ionização de chamadetector mento (GC-FID). Um padrão interno, na forma de um triacilglicerol (tripentadecanoin) é adicionado antes do procedimento analítico. Possíveis perdas durante a extração e transesterificação incompleta podem ser corrigidas. O método pode ser usado para determinar o conteúdo, bem como a composição dos ácidos gordos presentes na biomassa de microalgas. Todos os ácidos gordos presentes nas diferentes classes de acil-lípido, incluindo o armazenamento (TAG), bem como lípidos da membrana (glicolípidos, fosfolípidos), são detectados, identificados e quantificados com precisão e de forma reprodutível por este método usando apenas pequenas quantidades de amostra (5 mg) . Este método não fornece informações sobre a abundância relativa das diferentes classes de lipídios. No entanto, o método pode ser estendido para separar classes de lípidos do outro 1. A composição de ácidos gordos e de concentração das diferentes classes de lípidos pode ser determinada individualmente. Na literatura vários outros métodos sãodescrito para analisar os lipídios em microalgas. Alguns métodos de focar sobre o total de componentes lipofílicos 15, enquanto que outros métodos de se concentrar em ácidos gordos totais 9,16. Estas alternativas incluem determinação gravimétrica de lipídios totais extraídos, trans-esterificação direta de ácidos graxos combinados com quantificação utilizando cromatografia e coloração de células com corantes fluorescentes lipofílicos. Uma das alternativas mais utilizada para a quantificação de ácidos gordos usando cromatografia é quantificação de lípidos utilizando uma determinação gravimétrica 17,18. Vantagens de uma determinação gravimétrica são a falta de requisitos para equipamentos avançados e caros, como um cromatógrafo a gás, facilidade para definir o processo, por causa da disponibilidade de equipamento analítico padronizado (por exemplo Soxhlet), e uma determinação gravimétrica é menos demorado do que cromatografia de métodos baseados. A principal vantagem da utilização de métodos de cromatografia com base em other mão é que em tal método apenas os ácidos gordos são medidos. Numa determinação gravimétrica do ácido não gordo contendo lípidos, tais como pigmentos ou esteróides, são também incluídas na determinação. Estes lipídios ácido não gordo contendo pode fazer-se uma grande proporção (&gt; 50%) do total de lipídios. Se alguém está interessado apenas no teor de ácidos gordos (por exemplo, para aplicações de biodiesel), ele vai ser superestimada quando uma determinação gravimétrica é usado. Além disso, na determinação gravimétrica a precisão da balança analítica utilizada para pesar os lípidos extraídos determina o tamanho da amostra que tem de ser usado. Esta quantidade é tipicamente muito mais do que a quantidade necessária quando é utilizada cromatografia. Finalmente, uma outra vantagem da utilização de cromatografia sobre determinação gravimétrica é que a cromatografia fornece informações sobre a composição de ácidos gordos. Outra alternativa para o nosso método apresentado é 16,19,20 transesterificação direta.Neste método de extracção de lípidos e de transesterificação de ácidos gordos para EMAGs são combinadas num único passo. Este método é mais rápido do que um passo de extracção e de transesterificação em separado, mas a combinação destes passos limita os solventes que podem ser utilizados para extracção. Isso pode influenciar negativamente a eficiência da extração. Outra vantagem de uma etapa de extracção de lípidos e de transesterificação é separada que permite uma separação adicional entre a classe de lípidos destes passos 1. Isso não é possível quando transesterificação directa é utilizado. Outros métodos comumente utilizados para determinar o teor de lipídios em microalgas incluem manchando a biomassa com manchas fluorescentes lipofílicos, como Nilo vermelho ou BODIPY e medir o sinal de fluorescência 21,22. Uma vantagem destes métodos é que eles são menos trabalhoso que métodos alternativos. Uma desvantagem destes métodos é que a resposta fluorescente é, por várias razões, variável entre especies, as condições de cultivo, as classes de lipídios e procedimentos analíticos. Como exemplo, várias destas variações são causadas por diferenças na absorção do corante pelas microalgas. Portanto, é necessária calibração usando outro método quantitativo, de preferência realizada para todas as diferentes condições de cultivo e estágios de crescimento. Finalmente, este método não fornece informações sobre a composição de ácidos graxos e é menos preciso e reprodutível do que os métodos de cromatografia de base. O método apresentado baseia-se no método descrito por Lamers et al. 23 e 24 Santos et al. E também foi aplicada por outros autores 1,25-27. Também estão disponíveis outros métodos que são baseados nos mesmos princípios e pode fornecer resultados semelhantes 9,28.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Reagent and equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>tripentadecanoin (C15:0 TAG)</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>T4257</td>
 <td>CAS Number 7370-46-9</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample</td>
 <td>Sigma Aldrich </td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample</td>
 <td>Lipidox</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample</td>
 <td>Larodan</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Beadbeater</td>
 <td>Bertin Technologies</td>
 <td>Precellys 24</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>beadbeater tubes</td>
 <td>MP Biomedicals</td>
 <td>Lysing matrix E 
 116914500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GC-FID</td>
 <td>Hewlett-Packer</td>
 <td>HP6871</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GC column</td>
 <td>Supelco</td>
 <td>Nukol 25357</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Positive displacement pipette 100-1000&mu;l</td>
 <td>Mettler Toledo</td>
 <td>MR-1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Positive displacement pipet tips C-1000</td>
 <td>Mettler Toledo</td>
 <td>C-1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml</td>
 <td>VWR</td>
 <td>612-1925</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>glass tubes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>SCERE5100160011G1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000</td>
 <td>VWR</td>
 <td>SCERE5100160011G1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Teflon coated screw-caps</td>
 <td>VWR</td>
 <td>SCERKSSR15415BY10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator</td>
 <td>VWR</td>
 <td>445-2101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heated Evaporator/Concentrator</td>
 <td>Cole-Parmer</td>
 <td>YO-28690-25</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

analysis of fatty acid content and composition in microalgae

Um método para determinar o conteúdo e a composição dos ácidos gordos totais presentes em microalgas é descrito. Os ácidos gordos são um dos principais constituintes de biomassa de microalgas. Estes ácidos gordos podem estar presentes em diferentes classes de acil-lípido. Especialmente os ácidos gordos presentes nos triacilgliceróis (TAG) são de interesse comercial, porque eles podem ser utilizados para a produção de combustíveis de transporte, os produtos químicos a granel, nutracêuticos (ω-3 ácidos gordos), e produtos alimentares. Para desenvolver aplicações comerciais, são necessários métodos analíticos confiáveis ​​para quantificação do teor de ácidos graxos e composição. Microalgas são células isoladas cercadas por uma parede celular rígida. Um método de análise de ácido gordo deve proporcionar ruptura suficiente de células para libertar todos os lípidos de acilo e o procedimento de extracção utilizado deve ser capaz de extrair todas as classes de lípidos de acilo. Com o método aqui apresentado todos os ácidos gordos presentes no microalgas podem ser exacta e reprodutível idendos e quantificados utilizando pequenas quantidades de amostra (5 mg), independentemente da sua cadeia de comprimento, grau de insaturação, ou a classe de lipídios que fazem parte. Este método não fornece informação sobre a abundância relativa de diferentes classes de lípidos, mas pode ser estendida para separar classes de lípidos de cada outro. O método baseia-se numa sequência de ruptura mecânica da célula, a extracção de lípidos à base de solvente, a transesterificação dos ésteres de ácidos gordos a metílicos dos ácidos gordos (FAMEs), e quantificação e identificação dos EMAG utilizando cromatografia em fase gasosa (GC-FID). Uma norma interna TAG (tripentadecanoin) é adicionado antes do procedimento analítico para corrigir as perdas durante a extração e transesterificação incompleta.

Um cromatograma típico que é obtido através deste processo é mostrado na Figura 1. FAMEs são separados por tamanho e grau de saturação pela coluna GC e protocolo utilizado. Ácidos graxos de cadeia de comprimento mais curto e mais ácidos graxos saturados (menos ligações duplas) têm tempos de retenção mais curtos. A coluna GC usado eo protocolo não pretende separar isômeros de ácidos graxos (o mesmo comprimento da cadeia e grau de saturação, mas diferentes posições de ligações dupla...

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Analysis of Fatty Acid Content and Composition in Microalgae

Um método para a determinação do teor de ácidos gordos e composição de microalgas baseado em ruptura mecânica da célula, a extracção de lípidos à base de solvente, a transesterificação, e quantificação e identificação de ácidos gordos por cromatografia em fase gasosa é descrito. Uma norma interna tripentadecanoin é usado para compensar as possíveis perdas durante a extração e transesterificação incompleta.

Análise do conteúdo de ácidos graxos e composição em Microalgas

A method to determine the content and composition of total fatty acids present in microalgae is described. Fatty acids are a major constituent of ...

analysis-of-fatty-acid-content-and-composition-in-microalgae

Research

JoVE Journal

Environment

59.4K visualizações.  Wageningen University and Research Center.  Um método para a determinação do teor de ácidos gordos e composição de microalgas baseado em ruptura mecânica da célula, a extracção de lípidos à base de solvente, a transesterificação, e quantificação e identificação de ácidos gordos por cromatografia em fase gasosa é descrito. Uma norma interna tripentadecanoin é usado para compensar as possíveis perdas durante a extração e transesterificação incompleta. 

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Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently than plants3, but also synthesize advanced biofuels2-4. Generally, atmospheric CO2 is not a sufficient source for supporting maximal algal growth5. On the other hand, the high concentrations of CO2 in industrial exhaust gases have adverse effects on algal physiology. Consequently, both cultivation conditions (such as nutrients and light) and the control of the flue gas flow into the photo-bioreactors are important to develop an efficient &ldquo;flue gas to algae&rdquo; system. Researchers have proposed different photobioreactor configurations4,6 and cultivation strategies7,8 with flue gas. Here, we present a protocol that demonstrates how to use models to predict the microalgal growth in response to flue gas settings. We perform both experimental illustration and model simulations to determine the favorable conditions for algal growth with flue gas. We develop a Monod-based model coupled with mass transfer and light intensity equations to simulate the microalgal growth in a homogenous photo-bioreactor. The model simulation compares algal growth and flue gas consumptions under different flue-gas settings. The model illustrates: 1) how algal growth is influenced by different volumetric mass transfer coefficients of CO2; 2) how we can find optimal CO2 concentration for algal growth via the dynamic optimization approach (DOA); 3) how we can design a rectangular on-off flue gas pulse to promote algal biomass growth and to reduce the usage of flue gas. On the experimental side, we present a protocol for growing Chlorella under the flue gas (generated by natural gas combustion). The experimental results qualitatively validate the model predictions that the high frequency flue gas pulses can significantly improve algal cultivation.

Flue gas from power plants is a cheap CO2 source for algal growth. We have built prototype &#34;flue gas to algal cultivation&#34; systems and described how to scale up the algal cultivation process. We have demonstrated the use of a mass-transfer bio-reaction model to simulate and to design the optimal operation of flue gas for the growth of Chlorella sp. in algal photo-bioreactors.

Otimizar Configurações de gases de combustão para promover o crescimento de microalgas em fotobiorreatores via simulações de computador

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

Ambiente

Quantification of Heavy Metals and Other Inorganic Contaminants on the Productivity of Microalgae

Increasing demand for renewable fuels has researchers investigating the feasibility of alternative feedstocks, such as microalgae. Inherent advantages include high potential yield, use of non-arable land and integration with waste streams. The nutrient requirements of a large-scale microalgae production system will require the coupling of cultivation systems with industrial waste resources, such as carbon dioxide from flue gas and nutrients from wastewater. Inorganic contaminants present in these wastes can potentially lead to bioaccumulation in microalgal biomass negatively impact productivity and limiting end use. This study focuses on the experimental evaluation of the impact and the fate of 14 inorganic contaminants (As, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V and Zn) on Nannochloropsis salina growth. Microalgae were cultivated in photobioreactors illuminated at 984 &#181;mol m-2 sec-1 and maintained at pH 7 in a growth media polluted with inorganic contaminants at levels expected based on the composition found in commercial coal flue gas systems. Contaminants present in the biomass and the medium at the end of a 7 day growth period were analytically quantified through cold vapor atomic absorption spectrometry for Hg and through inductively coupled plasma mass spectrometry for As, Cd, Co, Cr, Cu, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V and Zn. Results show N. salina is a sensitive strain to the multi-metal environment with a statistical decrease in biomass yieldwith the introduction of these contaminants. The techniques presented here are adequate for quantifying algal growth and determining the fate of inorganic contaminants.

Integration of microalgal cultivation with industrial flue gas will ultimately introduce heavy metals and other inorganic compounds into the growth media. This study presents a procedure used to determine the end fate and impact of heavy metals and inorganic contaminants on the growth of Nannochloropsis salina grown in photobioreactors.

Quantificação de Metais Pesados ​​e outros contaminantes inorgânicos sobre a produtividade de Microalgas

Increasing demand for renewable fuels has researchers investigating the feasibility of alternative feedstocks, such as microalgae. Inherent advantages ...

Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content

Outdoor aerosol research commonly uses particulate matter sampled on filters. This procedure enables various characterizations of the collected particles to be performed in parallel. The purpose of the method presented here is to obtain a highly accurate and reliable analysis of the endotoxin and DNA content of bio-aerosols extracted from filters. The extraction of high molecular weight organic molecules, such as lipopolysaccharides, from sampled filters involves shaking the sample in a pyrogen-free water-based medium. The subsequent analysis is based on an enzymatic reaction that can be detected using a turbidimetric measurement. As a result of the high organic content on the sampled filters, the extraction of DNA from the samples is performed using a commercial DNA extraction kit that was originally designed for soils and modified to improve the DNA yield. The detection and quantification of specific microbial species using quantitative polymerase chain reaction (q-PCR) analysis are described and compared with other available methods.

Two complementary analyses of atmospheric biological particles from air sampled filters are described herein: the extraction and detection of endotoxin, and of DNA.

Análise Filtro amostrado-Air para endotoxinas e conteúdo de DNA

Outdoor aerosol research commonly uses particulate matter sampled on filters. This procedure enables various characterizations of the collected particles ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about the overall structure of terrestrial microbial communities. PLFA profiling has been extensively used in a range of ecosystems as a biological index of overall soil quality, and as a quantitative indicator of soil response to land management and other environmental stressors.
The standard method presented here outlines four key steps: 1. lipid extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, 2. fractionation using solid phase extraction columns to isolate phospholipids from other extracted lipids, 3. methanolysis of phospholipids to produce fatty acid methyl esters (FAMEs), and 4. FAME analysis by capillary gas chromatography using a flame ionization detector (GC-FID). Two standards are used, including 1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC(19:0/19:0)) to assess the overall recovery of the extraction method, and methyl decanoate (MeC10:0) as an internal standard (ISTD) for the GC analysis.

Phospholipid fatty acids provide information about the structure of soil microbial communities. We present methods for extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, fractionation of extracted lipids using solid phase extraction columns, and methanolysis to produce fatty acid methyl esters, which are analyzed by capillary gas chromatography.

Extração e Análise de Microbial Phospholipid Fatty Acids em solos

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Composition and Properties of Aquafaba: Water Recovered from Commercially Canned Chickpeas

Chickpea and other pulses are commonly sold as canned products packed in a thick solution or a brine. This solution has recently been shown to produce stable foams and emulsions, and can act as a thickener. Recently interest in this product has been enhanced through the internet where it is proposed that this solution, now called aquafaba by a growing community, can be used a replacement for egg and milk protein. As aquafaba is both new and being developed by an internet based community little is known of its composition or properties. Aquafaba was recovered from 10 commercial canned chickpea products and correlations among aquafaba composition, density, viscosity and foaming properties were investigated. Proton NMR was used to characterize aquafaba composition before and after ultrafiltration through membranes with different molecular weight cut offs (MWCOs of 3, 10, or 50 kDa). A protocol for electrophoresis, and peptide mass fingerprinting is also presented. Those methods provided valuable information regarding components responsible for aquafaba functional properties. This information will allow the development of practices to produce standard commercial aquafaba products and may help consumers select products of superior or consistent utility.

Aquafaba is a viscous juice from canned chickpea that, when stirred vigorously, produces a relatively stable white froth or foam. The primary research goal is to identify the components of aquafaba that contribute viscosifying/thickening properties using nuclear magnetic resonance (NMR), ultrafiltration, electrophoresis, and peptide mass fingerprinting.

Composição e propriedades de Aquafaba: água recuperada de grão de bico enlatado comercialmente

Chickpea and other pulses are commonly sold as canned products packed in a thick solution or a brine. This solution has recently been shown to produce ...

The Calibration and Use of Capacitance Sensors to Monitor Stem Water Content in Trees

Water transport and storage through the soil-plant-atmosphere continuum is critical to the terrestrial water cycle, and has become a major research focus area. Biomass capacitance plays an integral role in the avoidance of hydraulic impairment to transpiration. However, high temporal resolution measurements of dynamic changes in the hydraulic capacitance of large trees are rare. Here, we present procedures for the calibration and use of capacitance sensors, typically used to monitor soil water content, to measure the volumetric water content in trees in the field. Frequency domain reflectometry-style observations are sensitive to the density of the media being studied. Therefore, it is necessary to perform species-specific calibrations to convert from the sensor-reported values of dielectric permittivity to volumetric water content. Calibration is performed on a harvested branch or stem cut into segments that are dried or re-hydrated to produce a full range of water contents used to generate a best-fit regression with sensor observations. Sensors are inserted into calibration segments or installed in trees after pre-drilling holes to a tolerance fit using a fabricated template to ensure proper drill alignment. Special care is taken to ensure that sensor tines make good contact with the surrounding media, while allowing them to be inserted without excessive force. Volumetric water content dynamics observed via the presented methodology align with sap flow measurements recorded using thermal dissipation techniques and environmental forcing data. Biomass water content data can be used to observe the onset of water stress, drought response and recovery, and has the potential to be applied to the calibration and evaluation of new plant-level hydrodynamics models, as well as to the partitioning of remotely sensed moisture products into above- and belowground components.

The hydraulic capacitance of biomass is a key component of the vegetation water budget, which serves as a buffer against short and long-term drought stresses. Here, we present a protocol for the calibration and use of soil moisture capacitance sensors to monitor water content in the stems of large trees.

A calibração e a utilização de sensores de capacitância de monitorar o conteúdo de água do caule em árvores

Water transport and storage through the soil-plant-atmosphere continuum is critical to the terrestrial water cycle, and has become a major research focus ...

Combining Eye-tracking Data with an Analysis of Video Content from Free-viewing a Video of a Walk in an Urban Park Environment

As individuals increasingly live in cities, methods to study their everyday movements and the data that can be collected becomes important and valuable. Eye-tracking informatics are known to connect to a range of feelings, health conditions, mental states and actions. But because vision is the result of constant eye-movements, teasing out what is important from what is noise is complex and data intensive. Furthermore, a significant challenge is controlling for what people look at compared to what is presented to them.
The following presents a methodology for combining and analyzing eye-tracking on a video of a natural and complex scene with a machine learning technique for analyzing the content of the video. In the protocol we focus on analyzing data from filmed videos, how a video can be best used to record participants&#39; eye-tracking data, and importantly how the content of the video can be analyzed and combined with the eye-tracking data. We present a brief summary of the results and a discussion of the potential of the method for further studies in complex environments.

The objective of the protocol is to detail how to collect video data for use in the laboratory; how to record eye-tracking data of participants looking at the data and how to efficiently analyze the content of the videos that they were looking at using a machine learning technique.

Combinando dados de rastreamento de olhos com uma análise de conteúdo de vídeo de livre-visualizando um vídeo de uma caminhada em um ambiente de parque urbano

As individuals increasingly live in cities, methods to study their everyday movements and the data that can be collected becomes important and valuable. ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, we described a protocol for multiple analyses of the biological compositions in environmental PM. Five experiments are presented: (1) PM number monitoring by using a laser particle counter; (2) PM collection by using a cyclonic aerosol sampler; (3) PM collection by using a high-volume air sampler with filters; (4) culturable microbes collection by the Andersen six-stage sampler; and (5) detection of biological composition of environmental PM by bacterial 16SrDNA and fungal ITS region sequencing. We selected hazy days and a livestock farm as two typical examples of the application in this protocol. In this study, these two sampling methods, cyclonic aerosol sampler and filter sampler, showed different sampling efficiency. The cyclonic aerosol sampler performed much better in terms of collecting bacteria, while these two methods showed the same efficiency in collecting fungi. Filter samplers can work under low temperature conditions while cyclonic aerosol samplers have a sampling limitation for temperature. A solid impacting sampler, such as an Andersen six-stage sampler, can be used to sample bioaerosols directly into the culture medium, which increases the survival rate of culturable microorganisms. However, this method mainly relies on culture while more than 99% of microbes cannot be cultured. DNA extracted from the culturable bacteria collected by the Andersen six-stage sampler and samples collected by cyclonic aerosol sampler and filter sampler were detected by bacterial 16S rDNA and fungal ITS region sequencing.All the methods above may have wide application in many fields of study, such as environmental monitoring and airborne pathogen detection. From these results, we can conclude that these methods can be used under different conditions and may help other researchers further explore the health impacts of environmental bioaerosols.

Understanding the biological composition of environmental particulate matter is important for the study of its significant impacts on human health and disease spread. Here, we used three types of bioaerosol sampling methods and a biological analysis of airborne microbes to better explore airborne microbial communities under different environmental conditions.

Composição e análise da distribuição de Bioaerossóis sob diferentes condições ambientais

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the treatment of wastes. As most new research efforts begin at laboratory scale, there is a need for cost-effective methods for culturing microalgae in a reproducible manner. Here, we communicate an effective approach to culture microalgae in laboratory-scale photobioreactors, and to measure the growth and neutral lipid content of that algae. Instructions are also included on how to set up the photobioreactor system. Although the example organisms are species of Chlorella and Auxenochlorella, this system can be adapted to cultivate a wide range of microalgae, including co-cultures of algae with non-algae species. Stock cultures are first grown in bottles to produce inoculum for the photobioreactor system. Algae inoculum is concentrated and transferred to photobioreactors for cultivation in batch mode. Samples are collected daily for the optical density readings. At the end of the batch culture, cells are harvested by centrifuge, washed, and freeze dried to obtain a final dry weight concentration. The final dry weight concentration is used to create a correlation between the optical density and the dry weight concentration. A modified Folch method is subsequently used to extract total lipids from the freeze-dried biomass and the extract is assayed for its neutral lipid content using a microplate assay. This assay has been published previously but protocol steps were included here to highlight critical steps in the procedure where errors frequently occur. The bioreactor system described here fills a niche between simple flask cultivation and fully-controlled commercial bioreactors. Even with only 3-4 biological replicates per treatment, our approach to culturing algae leads to tight standard deviations in the growth and lipid assays.

Here, we present a protocol to construct lab-scale bubble column photobioreactors and use them to culture microalgae. It also provides a method for the determination of the culture growth rate and neutral lipid content.

Cultivo de microalgas verdes em fotobiorreatores coluna de bolha e um ensaio para lípidos neutros

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...

Manufacturing Simple and Inexpensive Soil Surface Temperature and Gravimetric Water Content Sensors

Quantifying temperature and moisture at the soil surface is essential for understanding how soil surface biota respond to changes in the environment. However, at the soil surface these variables are highly dynamic and standard sensors do not explicitly measure temperature or moisture in the upper few millimeters of the soil profile. This paper describes methods for manufacturing simple, inexpensive sensors that simultaneously measure the temperature and moisture of the upper 5 mm of the soil surface. In addition to sensor construction, steps for quality control, as well as for calibration for various substrates, are explained. The sensors incorporate a Type E thermocouple to measure temperature and assess soil moisture by measuring the resistance between two gold-plated metal probes at the end of the sensor at a depth of 5 mm. The methods presented here can be altered to customize probes for different depths or substrates. These sensors have been effective in a variety of environments and have endured months of heavy rains in tropical forests as well as intense solar radiation in deserts of the southwestern U.S. Results demonstrate the effectiveness of these sensors for evaluating warming, drying, and freezing of the soil surface in a global change experiment.

Accurately measuring temperature and water content of the upper 5 mm of the soil surface can improve our understanding of environmental controls on biological, chemical, and physical processes. Here we describe a protocol for manufacturing, calibrating, and conducting measurements with soil surface temperature and moisture sensors.

Fabricação de sensores de temperatura de superfície do solo simples e baratos e sensores de conteúdo de água gravimétrica

Quantifying temperature and moisture at the soil surface is essential for understanding how soil surface biota respond to changes in the environment. ...