Una parte de este trabajo fue apoyado financieramente por el Instituto para la Promoción de la Innovación en Ciencia y Tecnología-Estratégico de Investigación Básica (TVN-SBO) Luz solar del proyecto y las células BIOSOLAR. Erik audaces y BackKim Nguyen son reconocidos por su contribución a la optimización del procedimiento golpes de talón.

1. Preparación de la muestra Hay dos protocolos alternativos para la preparación de muestras como etapas 1,1 y 1,2. Ambos métodos son igualmente adecuadas y dan resultados similares, pero si una cantidad limitada de volumen de cultivo de algas está disponible, se recomienda el método 1.1. NOTA: Para cualquiera de los protocolos, preparar dos tubos de batidor de bolas adicionales de acuerdo con todo el protocolo, pero sin adición de algas a ellos para ser utilizado como un espacio en blanco. De esta manera, los picos en el cromatograma GC resultante de la extracción de los componentes de los materiales utilizados pueden ser identificados y cuantificados. 1.1. Muestra Protocolo Preparación Opción 1: Recomendada cuando una cantidad limitada de Algas cultura es Disponible <ol><li> Determinar la concentración en peso seco de algas (g / l) en el caldo de cultivo, por ejemplo como se describe por Breuer et al. 1. </li><li> Transferir un volumen de caldo de cultivo que contiene 5-10 mg de peso seco de las algasun tubo de centrífuga de vidrio. Calcular la cantidad exacta de biomasa transferida mediante la concentración de biomasa determinada en el paso 1.1.1. </li><li> Centrifugar 5 min a 1200 x g. </li><li> Deseche parte del sobrenadante, deje aproximadamente 0,25 ml en el tubo. </li><li> Volver a suspender las algas en el sobrenadante restante por suave pipeteando el sedimento arriba y hacia abajo y transferir el sedimento celular completa a un tubo de batidor de bolas utilizando una pipeta de 200 l. </li><li> Enjuague el tubo de centrífuga y el vidrio de la pipeta con agua ± 0,15 ml milliQ y transferir el líquido al mismo tubo batidor de bolas. </li><li> Tubos de centrífuga de talón batidora durante un minuto a máxima rpm para asegurarse de que no queden burbujas de aire en la parte inferior de los tubos. Es posible almacenar tubos batidor de bolas cerrados a -80 ° C. </li><li> Liofilizar los tubos batidor de bolas que contienen la muestra. Es posible almacenar los tubos de batidor de bolas cerrados a -80 ° C. </li></ol> 1.2. Ejemplo de opción de protocolo Preparación 2 <ol><li> Centrifugar un volumen indeterminado de caldo de cultivo de algas y desechar el sobrenadante. No es necesario para determinar la concentración de biomasa o para medir el volumen utilizado. </li><li> Medir o calcular la osmolaridad del medio de cultivo utilizando la concentración de las principales sales presentes en el medio de cultivo. </li><li> Lavar el sedimento de células resuspendiendo el sedimento celular en el mismo volumen, tal como se utiliza en el paso 1.2.1, de una solución de formiato de amonio, que se aproxima a la osmolaridad del medio de cultivo. Una solución de formiato de amonio equiosmolar impide la lisis de células durante el lavado de las células. </li></ol> NOTA: El lavado de las células es necesario para eliminar las sales presentes en el medio de cultivo. Esto es especialmente importante para el análisis de ácidos grasos en microalgas marinas debido a las altas concentraciones de sal en su medio de cultivo. Si sales podrían estar aún presente, esto haría que la sobreestimación de la cantidad de peso seco de células que se determinará más adelante en tsu protocolo. Formiato de amonio se utiliza para lavar las células porque esta solución se evapora completamente durante la liofilización y no deja ningún residuo. <ol start="4"><li> Suspensión Centrífuga algas y sobrenadante de descarte. </li><li> Liofilizar el sedimento celular. </li><li> Pesar 5-10 mg de polvo liofilizado de microalgas en un tubo batidor de bolas. Anotar el peso exacto. </li></ol> 2. La interrupción de la célula y de los lípidos de Extracción NOTA: En esta sección se describe un procedimiento extenso ruptura celular. Posiblemente, algunos de los pasos disrupción celular son redundantes y menos extensa interrupción de la célula podría producir los mismos resultados para algunas especies de microalgas o para la biomasa derivada de ciertas condiciones de cultivo. Esto necesitaría de validación para cada situación específica sin embargo. Por lo tanto el protocolo de interrupción extensa propuesta se recomienda como un método universal apto para todo el material de microalgas. <ol><li> Pesar una cantidad exacta de tripentadecanoin (triacylglycerol contiene tres C15: ácidos grasos 0) y agregarlo a una cantidad exactamente conocida de 04:05 (v / v) de cloroformo: metanol. De esta manera se conoce exactamente la concentración de tripentadecanoin. Apunta a una concentración de 50 mg / L. Tripentadecanoin sirve como el patrón interno para la cuantificación de ácidos grasos. </li><li> Añadir 1 ml de cloroformo: metanol 04:05 (v / v) que contiene tripentadecanoin a cada tubo de golpeo (especificado en los reactivos y equipos de mesa). Compruebe que no hay cuentas restantes dentro de la tapa del tubo BeadBeater, esto dará lugar a fugas de los tubos. Utilizar una pipeta de desplazamiento positivo para la adición precisa de disolventes. </li><li> Bolas venció a los tubos batidor de bolas 8x a 2.500 rpm durante 60 segundos, cada vez con un 120 sec interna entre cada latido. </li><li> Transferir la solución de los tubos dosificadores de vidrio hasta un 15 ml tubo de centrífuga de vidrio resistente al calor limpio con inserto de teflón tapones de rosca. Asegúrese de transferir todas las cuentas del tubo batidor de bolas también. </li><li> Para erah, el tubo de batidor de bolas, añadir 1 ml de cloroformo: metanol 4:5 (v / v) que contiene tripentadecanoin en el tubo de batidor de bolas, cerca de la tapa y mezclar, y transferir esta solución a la misma tubo de vidrio desde el paso 2.4. Lavar el tubo tres veces (en total de 4 ml de cloroformo: metanol 04:05 (v / v) que contiene tripentadecanoin se utiliza por muestra - 1 ml Añadido en el paso 2.2 y 3 ml para 3 etapas de lavado). </li><li> Vortex los tubos de vidrio para 5 seg y se somete a ultrasonidos en un baño de sonicación durante 10 min. </li><li> Añadir 2,5 ml de agua MilliQ, que contiene 50 mM de 2-amino-2-hidroximetil-propano-1 ,3-diol (Tris) y 1 M de NaCl, que se ajusta a pH 7 utilizando una solución de HCl. Esto causará una separación de fase entre cloroformo y metanol: agua. 1 M de NaCl se utiliza para mejorar el equilibrio de los lípidos hacia la fase de cloroformo. </li><li> Vortex durante 5 segundos y luego se somete a ultrasonidos durante 10 min. </li><li> Centrifugar durante 5 min a 1200 x g. </li><li> Transferir toda la fase de cloroformo (fase inferior) a un tubo de vidrio limpio usando un pipetee Pasteur de vidrioe. Asegúrese de no transferir ninguna interfase o fase superior. </li><li> Volver a extraer la muestra mediante la adición de 1 ml de cloroformo al tubo de edad (que contiene el metanol: solución de agua). </li><li> Vortex durante 5 segundos y luego se somete a ultrasonidos durante 10 min. </li><li> Centrifugar durante 5 min a 1200 x g. </li><li> Recoger la fase cloroformo (fase inferior) con una pipeta Pasteur de vidrio y de la piscina con la primera fracción de cloroformo desde el paso 2.10. </li><li> Si se experimentan dificultades en la recopilación de toda la fracción de cloroformo en el paso anterior, repita los pasos del 02.11 a 02.14. De lo contrario, continúe con el paso 2.16. </li><li> Evaporar el cloroformo del tubo en una corriente de gas nitrógeno. Después de este paso muestras se pueden almacenar a -20 ° C bajo una atmósfera de gas nitrógeno. </li></ol> 3. La transesterificación de ésteres metílicos de ácidos grasos <ol><li> Añadir 3 ml de metanol que contiene 5% (v / v) de ácido sulfúrico al tubo que contiene los lípidos extraídos se secaron (tubo originalmente que contienen la fracción de cloroformo) ycerrar el tubo bien. </li><li> Vortex durante 5 segundos. </li><li> Incubar las muestras durante 3 horas a 70 ° C en un calentador de bloque o al baño maría. Periódicamente (cada ± 30 min) asegurarse de que las muestras no están en ebullición (causada por una tapa mal cerrada) y tubos de vórtice. Durante esta reacción los ácidos grasos están metilados en sus ésteres metílicos de ácidos grasos (FAMEs). </li><li> Enfriar las muestras a temperatura ambiente y añadir 3 ml de agua MilliQ y 3 ml de n-hexano. </li><li> Vortex durante 5 segundos y se mezcla durante 15 min con un rotador tubo de ensayo. </li><li> Centrifugar durante 5 min a 1200 x g. </li><li> Recoger 2 ml de la fase de hexano (arriba) y poner en tubo de vidrio fresco con una pipeta Pasteur de vidrio. </li><li> Agregue el agua 2 ml MilliQ a la fase de hexano recogido para lavarlo. </li><li> Vortex durante 5 segundos y centrifugar durante 5 min a 1200 x g. Después de este paso es posible almacenar las muestras a -20 ° C bajo atmósfera de gas nitrógeno (separación de fase no es necesario). </li></ol> 4. Cuantificación de FAME Using cromatografía de gases <ol><li> Rellenar viales de GC con la fase de hexano (fase superior) usando una pipeta Pasteur de vidrio. </li><li> Coloque las tapas de los viales de GC. Asegúrese de que las tapas están completamente sellados y no se pueden dar vuelta, para evitar la evaporación del vial. </li><li> Vuelva a llenar los disolventes de lavado GC (hexano), vaciar los viales de desecho, y poner los viales de muestra en auto-muestreador. Antes de ejecutar las muestras reales en el GC, la primera carrera 2 espacios en blanco que contienen sólo hexano en el GC. </li><li> Ejecute las muestras en un GC-FID con una columna Nukol (30 mx 0,53 mm x 1,0 m). Utilice temperatura de entrada de 250 ° C y usar helio como gas portador, la presión de 81,7 kPa y relación de división de 0,1:1, velocidad de flujo total: 20 ml / min. Temperatura del detector FID de 270 º C con H 2 tasa de flujo de 40 ml / min, caudal de aire de 400 ml / min y Él tasa de 9,3 ml / min de caudal. Volumen de inyección Puesto a 1 l / muestra. Inyector Pre y lavado posterior con n-hexano. Temperatura inicial de la estufa se establece en 90 ° C durante 0,5 min y después se elevó ingenioh 20 ° hasta una temperatura del horno de 200 ° C se alcanza C / min. La temperatura del horno se mantiene entonces a 200 ° C durante 39 min. Tiempo total de ejecución es de 45 min. </li></ol>

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Los autores tienen nada que revelar.

El método descrito se puede utilizar para determinar el contenido, así como la composición de ácidos grasos totales presentes en la biomasa de microalgas. Ácidos grasos derivados de todas las clases de lípidos, incluyendo el almacenamiento (TAG), así como los lípidos de membrana (fosfolípidos y glicolípidos), se detectan. Todas las longitudes de cadena y grados de saturación de ácidos grasos que están presentes en las microalgas pueden ser detectados y distinguido. El método se basa en la disrupción mecá...

Los ácidos grasos son uno de los principales constituyentes de biomasa de microalgas y típicamente constituyen entre 5-50% del peso seco celular 1-3. Ellos son principalmente presente en la forma de glicerolípidos. Estos, a su vez glicerolípidos consisten principalmente en fosfolípidos, glicolípidos y triacilglicerol (TAG). Especialmente los ácidos grasos presentes en TAG son de interés comercial, debido a que pueden ser utilizados como un recurso para la producción de combustibles para el transporte, productos químicos a granel, nutracéuticos (ácidos grasos ω-3), y los productos alimenticios 3-6. Las microalgas pueden crecer en medios de cultivo a base de agua de mar, puede tener una productividad mucho más alta de área de las plantas terrestres, y puede ser cultivada en fotobiorreactores en lugares que no son aptos para la agricultura, posiblemente, incluso en alta mar. Por estas razones, las microalgas se consideran a menudo una alternativa prometedora a las plantas terrestres para la producción de biodiesel y otros productos a granel 6.3. Potencialmente no l agrícolay o agua dulce es necesaria para su producción (cuando se cultiva en fotobiorreactores cerrados o cuando se utilizan las microalgas marinas). Por lo tanto, los biocombustibles derivados de las microalgas se consideran biocombustibles 3 ª generación. El contenido celular total de ácidos grasos (% de peso seco), la composición de clase de lípidos, así como la longitud de los ácidos grasos y el grado de saturación son muy variable entre las especies de microalgas. Además, estas propiedades varían con las condiciones de cultivo, tales como la disponibilidad de nutrientes, temperatura, pH, intensidad de la luz y 1,2. Por ejemplo, cuando se expone a la inanición de nitrógeno, las microalgas pueden acumular grandes cantidades de TAG. En condiciones óptimas de crecimiento TAG constituye típicamente menos de 2% de peso seco, pero cuando se expone a la inanición de nitrógeno contenido de la etiqueta puede aumentar hasta el 40% del peso seco de microalgas 1. Las microalgas producen principalmente ácidos grasos con longitudes de cadena de 16 y 18átomos de carbono, pero algunas especies pueden hacer que los ácidos grasos de hasta 24 átomos de carbono de longitud. Tanto saturada, así como ácidos grasos altamente insaturados son producidos por microalgas. Estos últimos incluyen los ácidos grasos con beneficios nutricionales (ácidos grasos ω-3) como C20: 5 (ácido eicosapentaenoico, EPA) y C22: 6 (ácido docosahexaenoico, DHA) para los que no existen alternativas vegetales 1,2,4,7. El (distribución de) ácidos grasos de longitud de cadena y grado de saturación también determina las propiedades y la calidad de los biocombustibles derivados de algas y aceites comestibles 4,8. Para desarrollar aplicaciones comerciales de los ácidos grasos de microalgas derivada, se necesitan métodos analíticos fiables para la cuantificación del contenido de ácidos grasos y la composición. Como también se ha señalado Ryckebosch et al. 9, el análisis de los ácidos grasos en las microalgas se distingue de otros sustratos (por ejemplo, aceite vegetal, productos alimenticios, tejidos animales, etc) sercausar 1) microalgas son células individuales rodeadas por paredes celulares rígidas, lo que complica la extracción de lípidos; 2) microalgas contienen una amplia variedad de clases de lípidos y la distribución de clases de lípidos es muy variable 7. Estas diferentes clases de lípidos tienen una amplia variedad en la estructura química y las propiedades tales como la polaridad. Además, se producen otras clases de lípidos que los lípidos acilo; 3) microalgas contienen una amplia variedad de ácidos grasos, que van desde 12 hasta 24 átomos de carbono de longitud y que contiene tanto saturados, así como ácidos grasos altamente insaturados. Por lo tanto, los métodos desarrollados para analizar ácidos grasos en sustratos distintos de microalgas, podrían no ser adecuados para analizar los ácidos grasos en microalgas. Como revisado por Ryckebosch et al. 9, la principal diferencia entre los procedimientos de extracción de lípidos de uso común es en los sistemas de disolventes que se utilizan. Debido a la gran variedad de clases de lípidos presentes en microalgas, cada uno que varía en la polaridad, la extraídacantidad de lípidos variará con disolventes utilizados 10-12. Esto lleva a las inconsistencias en el contenido de lípidos y la composición se presenta en 9,10 literatura. Dependiendo del sistema disolvente utilizado, los métodos basados ​​en extracción con disolventes y sin interrupción de la célula a través de, por ejemplo, latidos del grano o sonicación, podrían no extraer todos los lípidos debido a la estructura rígida de algunas especies de microalgas 9,13. En el caso de la extracción de lípidos incompleta, la eficacia de la extracción de las diferentes clases de lípidos puede variar 14. Esto también puede tener un efecto sobre la composición de ácidos grasos medido, porque la composición de ácidos grasos es variable entre las clases de lípidos 7. Nuestro método se basa en una secuencia de disrupción mecánica celular, extracción de lípidos a base de disolvente, transesterificación de los ácidos grasos a ésteres metílicos de ácidos grasos (FAMEs), y la cuantificación e identificación de FAME utilizando cromatografía de gases en combinación con una ionización de llamadetector ción (GC-FID). Un patrón interno en la forma de triglicéridos (tripentadecanoin) se añade antes del procedimiento analítico. Las posibles pérdidas durante la extracción y transesterificación incompleta pueden ser corregidos para. El método puede ser utilizado para determinar el contenido, así como la composición de los ácidos grasos presentes en la biomasa de microalgas. Todos los ácidos grasos presentes en las diferentes clases-acilo de los lípidos, incluido el almacenamiento (TAG), así como los lípidos de membrana (glicolípidos, fosfolípidos), son detectados, identificados y cuantificados con precisión y de forma reproducible por este método usando sólo pequeñas cantidades de muestra (5 mg) . Este método no proporciona información sobre la abundancia relativa de las diferentes clases de lípidos. Sin embargo, el método se puede ampliar para separar clases de lípidos entre sí 1. La composición de ácidos grasos y la concentración de las diferentes clases de lípidos se puede determinar individualmente. En la literatura varios otros métodos sondescrito para analizar los lípidos en microalgas. Algunos métodos se centran en componentes lipofílicos total de 15, mientras que otros métodos se centran en los ácidos grasos totales 9,16. Estas alternativas incluyen la determinación gravimétrica del total de lípidos extraídos, trans-esterificación directa de los ácidos grasos combinados con la cuantificación mediante cromatografía y tinción de las células con tintes fluorescentes lipofílicos. Una alternativa comúnmente utilizado para la cuantificación de ácidos grasos, usando la cromatografía es la cuantificación de los lípidos utilizando una determinación gravimétrica 17,18. Ventajas de una determinación gravimétrica son la falta de requisitos para el equipo avanzado y caro como un cromatógrafo de gases, la facilidad para establecer el procedimiento, debido a la disponibilidad de aparatos de análisis estandarizado (por ejemplo Soxhlet), y una determinación gravimétrica es menos tiempo que la cromatografía de métodos basados ​​en. La principal ventaja de la utilización de métodos de cromatografía basado en la OTHER mano es que en un procedimiento de este tipo sólo se miden los ácidos grasos. En una determinación gravimétrica del ácido no graso que contiene lípidos, como los pigmentos o los esteroides, también se incluyen en la determinación. Estos lípidos de ácido no graso que contiene pueden constituir una gran proporción (&gt; 50%) de los lípidos totales. Si uno está interesado sólo en el contenido de ácidos grasos (por ejemplo, para aplicaciones de biodiesel), se sobreestimó cuando se utiliza una determinación gravimétrica. Además, en una determinación gravimétrica la exactitud de la balanza analítica utilizada para pesar los lípidos extraídos determina el tamaño de la muestra que debe ser utilizado. Esta cantidad es típicamente mucho más de la cantidad necesaria cuando se utiliza cromatografía. Por último, otra de las ventajas de la utilización de cromatografía sobre determinación gravimétrica es que la cromatografía se proporciona información acerca de la composición de ácidos grasos. Otra alternativa a la aplicación de este método se presenta es 16,19,20 transesterificación directa.En este método de extracción de lípidos y la transesterificación de los ácidos grasos a FAME se combinan en un solo paso. Este método es más rápido que una etapa de extracción y la transesterificación por separado, pero la combinación de estos pasos limita los disolventes que se pueden utilizar para la extracción. Esto podría influir negativamente en la eficiencia de extracción. Otra ventaja de una etapa de extracción de lípidos y transesterificación separada es que permite para una separación adicional de la clase de lípidos entre estos pasos 1. Esto no es posible cuando se utiliza transesterificación directa. Otros métodos comúnmente utilizados para determinar el contenido de lípidos en microalgas incluyen la tinción de la biomasa con manchas fluorescentes lipófilos tales como Rojo Nilo o BODIPY y la medición de la señal de fluorescencia 21,22. Una ventaja de estos métodos es que son menos laborioso que los métodos alternativos. Una desventaja de estos métodos es que la respuesta fluorescente es, por diversas razones, variable entre especies, las condiciones de cultivo, clases de lípidos, y los procedimientos analíticos. Como un ejemplo, varias de estas variaciones son causadas por diferencias en la captación del colorante por las microalgas. Por lo tanto, se necesita calibración utilizando otro método cuantitativo, realizado preferentemente para todas las diferentes condiciones de cultivo y etapas de crecimiento. Por último, este método no proporciona información acerca de la composición de ácidos grasos y es menos precisa y reproducible que los métodos cromatográficos basados. El método que se presenta se basa en el método descrito por Lamers et al. 23 y Santos et al. 24 y también se ha aplicado por varios otros autores 1,25-27. También están disponibles otros métodos que se basan en los mismos principios y podrían proporcionar resultados similares 9,28.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Reagent and equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>tripentadecanoin (C15:0 TAG)</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>T4257</td>
 <td>CAS Number 7370-46-9</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample</td>
 <td>Sigma Aldrich </td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample</td>
 <td>Lipidox</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample</td>
 <td>Larodan</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Beadbeater</td>
 <td>Bertin Technologies</td>
 <td>Precellys 24</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>beadbeater tubes</td>
 <td>MP Biomedicals</td>
 <td>Lysing matrix E 
 116914500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GC-FID</td>
 <td>Hewlett-Packer</td>
 <td>HP6871</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GC column</td>
 <td>Supelco</td>
 <td>Nukol 25357</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Positive displacement pipette 100-1000&mu;l</td>
 <td>Mettler Toledo</td>
 <td>MR-1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Positive displacement pipet tips C-1000</td>
 <td>Mettler Toledo</td>
 <td>C-1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml</td>
 <td>VWR</td>
 <td>612-1925</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>glass tubes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>SCERE5100160011G1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000</td>
 <td>VWR</td>
 <td>SCERE5100160011G1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Teflon coated screw-caps</td>
 <td>VWR</td>
 <td>SCERKSSR15415BY10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator</td>
 <td>VWR</td>
 <td>445-2101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heated Evaporator/Concentrator</td>
 <td>Cole-Parmer</td>
 <td>YO-28690-25</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

analysis of fatty acid content and composition in microalgae

Un método para determinar el contenido y la composición de ácidos grasos totales presentes en microalgas se describe. Los ácidos grasos son un componente importante de la biomasa de microalgas. Estos ácidos grasos pueden estar presentes en diferentes clases-acilo de los lípidos. Especialmente los ácidos grasos presentes en los triglicéridos (TAG) son de interés comercial, ya que pueden ser utilizados para la producción de combustibles para el transporte, los productos químicos a granel, nutracéuticos (ácidos grasos ω-3), y los productos alimenticios. Para desarrollar aplicaciones comerciales, se necesitan métodos analíticos fiables para la cuantificación del contenido de ácidos grasos y la composición. Las microalgas son células individuales rodeadas por una pared celular rígida. Un método de análisis de ácidos grasos debe proporcionar suficiente disrupción celular para liberar todos los lípidos de acilo y el procedimiento de extracción utilizado debe ser capaz de extraer todas las clases de lípidos acilo. Con el método presentado aquí todos los ácidos grasos presentes en microalgas pueden ser precisa y reproducible idennotificada y cuantificado usando pequeñas cantidades de muestra (5 mg) independientes de su longitud de cadena, grado de insaturación, o la clase de lípidos que son parte de. Este método no proporciona información sobre la abundancia relativa de las diferentes clases de lípidos, pero se puede ampliar para separar clases de lípidos entre sí. El método se basa en una secuencia de disrupción mecánica celular, extracción de lípidos a base de disolvente, transesterificación de los ácidos grasos a ésteres metílicos de ácidos grasos (FAMEs), y la cuantificación e identificación de FAME, usando la cromatografía de gases (GC-FID). Una norma interna TAG (tripentadecanoin) se añade antes del procedimiento analítico para corregir las pérdidas durante la extracción y transesterificación incompleta.

Un cromatograma típico que se obtiene a través de este proceso se muestra en la Figura 1. FAME se separan por tamaño y grado de saturación por la columna de la GC y protocolo utilizado. Ácidos de cadena más cortas de longitud grasos y ácidos grasos saturados (menos dobles enlaces) tienen tiempos de retención más cortos. La columna GC utilizado y el protocolo no tienen la intención de separar isómeros de ácidos grasos (misma longitud de cadena y grado de saturación, pero diferentes posicione...

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Analysis of Fatty Acid Content and Composition in Microalgae

Un método para la determinación del contenido de ácido graso y la composición en microalgas basado en disrupción mecánica celular, extracción de lípidos a base de disolvente, de transesterificación, y la cuantificación e identificación de los ácidos grasos utilizando cromatografía de gases se describe. Un estándar interno tripentadecanoin se utiliza para compensar las posibles pérdidas durante la extracción y la transesterificación incompleta.

Análisis de contenido de ácido graso y Composición en microalgas

A method to determine the content and composition of total fatty acids present in microalgae is described. Fatty acids are a major constituent of ...

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Research

JoVE Journal

Environment

59.4K vistas.  Wageningen University and Research Center.  Un método para la determinación del contenido de ácido graso y la composición en microalgas basado en disrupción mecánica celular, extracción de lípidos a base de disolvente, de transesterificación, y la cuantificación e identificación de los ácidos grasos utilizando cromatografía de gases se describe. Un estándar interno tripentadecanoin se utiliza para compensar las posibles pérdidas durante la extracción y la transesterificación incompleta. 

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Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently than plants3, but also synthesize advanced biofuels2-4. Generally, atmospheric CO2 is not a sufficient source for supporting maximal algal growth5. On the other hand, the high concentrations of CO2 in industrial exhaust gases have adverse effects on algal physiology. Consequently, both cultivation conditions (such as nutrients and light) and the control of the flue gas flow into the photo-bioreactors are important to develop an efficient &ldquo;flue gas to algae&rdquo; system. Researchers have proposed different photobioreactor configurations4,6 and cultivation strategies7,8 with flue gas. Here, we present a protocol that demonstrates how to use models to predict the microalgal growth in response to flue gas settings. We perform both experimental illustration and model simulations to determine the favorable conditions for algal growth with flue gas. We develop a Monod-based model coupled with mass transfer and light intensity equations to simulate the microalgal growth in a homogenous photo-bioreactor. The model simulation compares algal growth and flue gas consumptions under different flue-gas settings. The model illustrates: 1) how algal growth is influenced by different volumetric mass transfer coefficients of CO2; 2) how we can find optimal CO2 concentration for algal growth via the dynamic optimization approach (DOA); 3) how we can design a rectangular on-off flue gas pulse to promote algal biomass growth and to reduce the usage of flue gas. On the experimental side, we present a protocol for growing Chlorella under the flue gas (generated by natural gas combustion). The experimental results qualitatively validate the model predictions that the high frequency flue gas pulses can significantly improve algal cultivation.

Flue gas from power plants is a cheap CO2 source for algal growth. We have built prototype &#34;flue gas to algal cultivation&#34; systems and described how to scale up the algal cultivation process. We have demonstrated the use of a mass-transfer bio-reaction model to simulate and to design the optimal operation of flue gas for the growth of Chlorella sp. in algal photo-bioreactors.

Optimizar la combustión Gas Ciudad para promover el crecimiento de microalgas en fotobiorreactores a través de Simulaciones computacionales

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

Investigación

Medio ambiente

Quantification of Heavy Metals and Other Inorganic Contaminants on the Productivity of Microalgae

Increasing demand for renewable fuels has researchers investigating the feasibility of alternative feedstocks, such as microalgae. Inherent advantages include high potential yield, use of non-arable land and integration with waste streams. The nutrient requirements of a large-scale microalgae production system will require the coupling of cultivation systems with industrial waste resources, such as carbon dioxide from flue gas and nutrients from wastewater. Inorganic contaminants present in these wastes can potentially lead to bioaccumulation in microalgal biomass negatively impact productivity and limiting end use. This study focuses on the experimental evaluation of the impact and the fate of 14 inorganic contaminants (As, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V and Zn) on Nannochloropsis salina growth. Microalgae were cultivated in photobioreactors illuminated at 984 &#181;mol m-2 sec-1 and maintained at pH 7 in a growth media polluted with inorganic contaminants at levels expected based on the composition found in commercial coal flue gas systems. Contaminants present in the biomass and the medium at the end of a 7 day growth period were analytically quantified through cold vapor atomic absorption spectrometry for Hg and through inductively coupled plasma mass spectrometry for As, Cd, Co, Cr, Cu, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V and Zn. Results show N. salina is a sensitive strain to the multi-metal environment with a statistical decrease in biomass yieldwith the introduction of these contaminants. The techniques presented here are adequate for quantifying algal growth and determining the fate of inorganic contaminants.

Integration of microalgal cultivation with industrial flue gas will ultimately introduce heavy metals and other inorganic compounds into the growth media. This study presents a procedure used to determine the end fate and impact of heavy metals and inorganic contaminants on the growth of Nannochloropsis salina grown in photobioreactors.

La cuantificación de los metales pesados ​​y otros contaminantes inorgánicos en la productividad de microalgas

Increasing demand for renewable fuels has researchers investigating the feasibility of alternative feedstocks, such as microalgae. Inherent advantages ...

Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content

Outdoor aerosol research commonly uses particulate matter sampled on filters. This procedure enables various characterizations of the collected particles to be performed in parallel. The purpose of the method presented here is to obtain a highly accurate and reliable analysis of the endotoxin and DNA content of bio-aerosols extracted from filters. The extraction of high molecular weight organic molecules, such as lipopolysaccharides, from sampled filters involves shaking the sample in a pyrogen-free water-based medium. The subsequent analysis is based on an enzymatic reaction that can be detected using a turbidimetric measurement. As a result of the high organic content on the sampled filters, the extraction of DNA from the samples is performed using a commercial DNA extraction kit that was originally designed for soils and modified to improve the DNA yield. The detection and quantification of specific microbial species using quantitative polymerase chain reaction (q-PCR) analysis are described and compared with other available methods.

Two complementary analyses of atmospheric biological particles from air sampled filters are described herein: the extraction and detection of endotoxin, and of DNA.

Análisis del filtro de aire en la muestra de endotoxinas y contenido de ADN

Outdoor aerosol research commonly uses particulate matter sampled on filters. This procedure enables various characterizations of the collected particles ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about the overall structure of terrestrial microbial communities. PLFA profiling has been extensively used in a range of ecosystems as a biological index of overall soil quality, and as a quantitative indicator of soil response to land management and other environmental stressors.
The standard method presented here outlines four key steps: 1. lipid extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, 2. fractionation using solid phase extraction columns to isolate phospholipids from other extracted lipids, 3. methanolysis of phospholipids to produce fatty acid methyl esters (FAMEs), and 4. FAME analysis by capillary gas chromatography using a flame ionization detector (GC-FID). Two standards are used, including 1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC(19:0/19:0)) to assess the overall recovery of the extraction method, and methyl decanoate (MeC10:0) as an internal standard (ISTD) for the GC analysis.

Phospholipid fatty acids provide information about the structure of soil microbial communities. We present methods for extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, fractionation of extracted lipids using solid phase extraction columns, and methanolysis to produce fatty acid methyl esters, which are analyzed by capillary gas chromatography.

Extracción y análisis de ácidos grasos de fosfolípidos microbiana en suelos

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Composition and Properties of Aquafaba: Water Recovered from Commercially Canned Chickpeas

Chickpea and other pulses are commonly sold as canned products packed in a thick solution or a brine. This solution has recently been shown to produce stable foams and emulsions, and can act as a thickener. Recently interest in this product has been enhanced through the internet where it is proposed that this solution, now called aquafaba by a growing community, can be used a replacement for egg and milk protein. As aquafaba is both new and being developed by an internet based community little is known of its composition or properties. Aquafaba was recovered from 10 commercial canned chickpea products and correlations among aquafaba composition, density, viscosity and foaming properties were investigated. Proton NMR was used to characterize aquafaba composition before and after ultrafiltration through membranes with different molecular weight cut offs (MWCOs of 3, 10, or 50 kDa). A protocol for electrophoresis, and peptide mass fingerprinting is also presented. Those methods provided valuable information regarding components responsible for aquafaba functional properties. This information will allow the development of practices to produce standard commercial aquafaba products and may help consumers select products of superior or consistent utility.

Aquafaba is a viscous juice from canned chickpea that, when stirred vigorously, produces a relatively stable white froth or foam. The primary research goal is to identify the components of aquafaba that contribute viscosifying/thickening properties using nuclear magnetic resonance (NMR), ultrafiltration, electrophoresis, and peptide mass fingerprinting.

Composición y propiedades de Aquafaba: agua recuperados de garbanzos enlatados comercialmente

Chickpea and other pulses are commonly sold as canned products packed in a thick solution or a brine. This solution has recently been shown to produce ...

The Calibration and Use of Capacitance Sensors to Monitor Stem Water Content in Trees

Water transport and storage through the soil-plant-atmosphere continuum is critical to the terrestrial water cycle, and has become a major research focus area. Biomass capacitance plays an integral role in the avoidance of hydraulic impairment to transpiration. However, high temporal resolution measurements of dynamic changes in the hydraulic capacitance of large trees are rare. Here, we present procedures for the calibration and use of capacitance sensors, typically used to monitor soil water content, to measure the volumetric water content in trees in the field. Frequency domain reflectometry-style observations are sensitive to the density of the media being studied. Therefore, it is necessary to perform species-specific calibrations to convert from the sensor-reported values of dielectric permittivity to volumetric water content. Calibration is performed on a harvested branch or stem cut into segments that are dried or re-hydrated to produce a full range of water contents used to generate a best-fit regression with sensor observations. Sensors are inserted into calibration segments or installed in trees after pre-drilling holes to a tolerance fit using a fabricated template to ensure proper drill alignment. Special care is taken to ensure that sensor tines make good contact with the surrounding media, while allowing them to be inserted without excessive force. Volumetric water content dynamics observed via the presented methodology align with sap flow measurements recorded using thermal dissipation techniques and environmental forcing data. Biomass water content data can be used to observe the onset of water stress, drought response and recovery, and has the potential to be applied to the calibration and evaluation of new plant-level hydrodynamics models, as well as to the partitioning of remotely sensed moisture products into above- and belowground components.

The hydraulic capacitance of biomass is a key component of the vegetation water budget, which serves as a buffer against short and long-term drought stresses. Here, we present a protocol for the calibration and use of soil moisture capacitance sensors to monitor water content in the stems of large trees.

La calibración y uso de sensores de capacitancia para monitorear el contenido de agua del tallo en árboles

Water transport and storage through the soil-plant-atmosphere continuum is critical to the terrestrial water cycle, and has become a major research focus ...

Combining Eye-tracking Data with an Analysis of Video Content from Free-viewing a Video of a Walk in an Urban Park Environment

As individuals increasingly live in cities, methods to study their everyday movements and the data that can be collected becomes important and valuable. Eye-tracking informatics are known to connect to a range of feelings, health conditions, mental states and actions. But because vision is the result of constant eye-movements, teasing out what is important from what is noise is complex and data intensive. Furthermore, a significant challenge is controlling for what people look at compared to what is presented to them.
The following presents a methodology for combining and analyzing eye-tracking on a video of a natural and complex scene with a machine learning technique for analyzing the content of the video. In the protocol we focus on analyzing data from filmed videos, how a video can be best used to record participants&#39; eye-tracking data, and importantly how the content of the video can be analyzed and combined with the eye-tracking data. We present a brief summary of the results and a discussion of the potential of the method for further studies in complex environments.

The objective of the protocol is to detail how to collect video data for use in the laboratory; how to record eye-tracking data of participants looking at the data and how to efficiently analyze the content of the videos that they were looking at using a machine learning technique.

Combinando los datos de seguimiento ocular con un análisis de contenido de vídeo de la visualización gratuita de un vídeo de un paseo en un entorno de parque urbano

As individuals increasingly live in cities, methods to study their everyday movements and the data that can be collected becomes important and valuable. ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, we described a protocol for multiple analyses of the biological compositions in environmental PM. Five experiments are presented: (1) PM number monitoring by using a laser particle counter; (2) PM collection by using a cyclonic aerosol sampler; (3) PM collection by using a high-volume air sampler with filters; (4) culturable microbes collection by the Andersen six-stage sampler; and (5) detection of biological composition of environmental PM by bacterial 16SrDNA and fungal ITS region sequencing. We selected hazy days and a livestock farm as two typical examples of the application in this protocol. In this study, these two sampling methods, cyclonic aerosol sampler and filter sampler, showed different sampling efficiency. The cyclonic aerosol sampler performed much better in terms of collecting bacteria, while these two methods showed the same efficiency in collecting fungi. Filter samplers can work under low temperature conditions while cyclonic aerosol samplers have a sampling limitation for temperature. A solid impacting sampler, such as an Andersen six-stage sampler, can be used to sample bioaerosols directly into the culture medium, which increases the survival rate of culturable microorganisms. However, this method mainly relies on culture while more than 99% of microbes cannot be cultured. DNA extracted from the culturable bacteria collected by the Andersen six-stage sampler and samples collected by cyclonic aerosol sampler and filter sampler were detected by bacterial 16S rDNA and fungal ITS region sequencing.All the methods above may have wide application in many fields of study, such as environmental monitoring and airborne pathogen detection. From these results, we can conclude that these methods can be used under different conditions and may help other researchers further explore the health impacts of environmental bioaerosols.

Understanding the biological composition of environmental particulate matter is important for the study of its significant impacts on human health and disease spread. Here, we used three types of bioaerosol sampling methods and a biological analysis of airborne microbes to better explore airborne microbial communities under different environmental conditions.

Composición y análisis de la distribución de bioaerosoles bajo diferentes condiciones ambientales

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the treatment of wastes. As most new research efforts begin at laboratory scale, there is a need for cost-effective methods for culturing microalgae in a reproducible manner. Here, we communicate an effective approach to culture microalgae in laboratory-scale photobioreactors, and to measure the growth and neutral lipid content of that algae. Instructions are also included on how to set up the photobioreactor system. Although the example organisms are species of Chlorella and Auxenochlorella, this system can be adapted to cultivate a wide range of microalgae, including co-cultures of algae with non-algae species. Stock cultures are first grown in bottles to produce inoculum for the photobioreactor system. Algae inoculum is concentrated and transferred to photobioreactors for cultivation in batch mode. Samples are collected daily for the optical density readings. At the end of the batch culture, cells are harvested by centrifuge, washed, and freeze dried to obtain a final dry weight concentration. The final dry weight concentration is used to create a correlation between the optical density and the dry weight concentration. A modified Folch method is subsequently used to extract total lipids from the freeze-dried biomass and the extract is assayed for its neutral lipid content using a microplate assay. This assay has been published previously but protocol steps were included here to highlight critical steps in the procedure where errors frequently occur. The bioreactor system described here fills a niche between simple flask cultivation and fully-controlled commercial bioreactors. Even with only 3-4 biological replicates per treatment, our approach to culturing algae leads to tight standard deviations in the growth and lipid assays.

Here, we present a protocol to construct lab-scale bubble column photobioreactors and use them to culture microalgae. It also provides a method for the determination of the culture growth rate and neutral lipid content.

Cultivo de microalgas verdes en fotobiorreactores de columna de burbuja y un análisis de lípidos neutros

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...

Manufacturing Simple and Inexpensive Soil Surface Temperature and Gravimetric Water Content Sensors

Quantifying temperature and moisture at the soil surface is essential for understanding how soil surface biota respond to changes in the environment. However, at the soil surface these variables are highly dynamic and standard sensors do not explicitly measure temperature or moisture in the upper few millimeters of the soil profile. This paper describes methods for manufacturing simple, inexpensive sensors that simultaneously measure the temperature and moisture of the upper 5 mm of the soil surface. In addition to sensor construction, steps for quality control, as well as for calibration for various substrates, are explained. The sensors incorporate a Type E thermocouple to measure temperature and assess soil moisture by measuring the resistance between two gold-plated metal probes at the end of the sensor at a depth of 5 mm. The methods presented here can be altered to customize probes for different depths or substrates. These sensors have been effective in a variety of environments and have endured months of heavy rains in tropical forests as well as intense solar radiation in deserts of the southwestern U.S. Results demonstrate the effectiveness of these sensors for evaluating warming, drying, and freezing of the soil surface in a global change experiment.

Accurately measuring temperature and water content of the upper 5 mm of the soil surface can improve our understanding of environmental controls on biological, chemical, and physical processes. Here we describe a protocol for manufacturing, calibrating, and conducting measurements with soil surface temperature and moisture sensors.

Fabricación de sensores de temperatura de superficie del suelo y de contenido de agua gravimétrica simples y económicos

Quantifying temperature and moisture at the soil surface is essential for understanding how soil surface biota respond to changes in the environment. ...