Une partie de ce travail a été soutenu financièrement par l&#39;Institut pour la promotion de l&#39;innovation par la science et de la technologie-recherche stratégique de base (IWT-SBO) Lumière du soleil de projet et les cellules Biosolar. Erik Bolder et BackKim Nguyen sont reconnus pour leur contribution à l&#39;optimisation de la procédure de coups de talon.

Une. Préparation de l&#39;échantillon Il existe deux protocoles alternatifs pour la préparation des échantillons inclus que les étapes 1.1 et 1.2. Ces deux méthodes conviennent également et donnent des résultats similaires, mais si une quantité limitée de volume de culture d&#39;algues est disponible, méthode 1.1 est recommandée. REMARQUE: Pour deux protocoles, préparer deux tubes perle de battage supplémentaires selon le protocole entier, mais sans ajouter les algues à eux pour être utilisé comme un vide. De cette manière, les pics dans le chromatogramme de CPG résultant de l&#39;extraction de composants à partir de matériaux utilisés peuvent être identifiées et quantifiées. 1.1. Exemple de protocole Préparation Option 1: Recommandé Quand une quantité limitée d&#39;algues Culture est disponible <ol><li> Déterminer la concentration en poids sec d&#39;algues (g / L) dans le bouillon de culture, par exemple comme décrit par Breuer et al. 1. </li><li> Transférer un volume de bouillon de culture qui contient de 5 à 10 mg de poids sec d&#39;algues àun tube de centrifugation en verre. Calculer le montant exact de la biomasse transférée en utilisant la concentration de la biomasse déterminée à l&#39;étape 1.1.1. </li><li> Centrifugeuse 5 min à 1200 x g. </li><li> Retirez la partie du surnageant, laisser environ 0,25 ml dans le tube. </li><li> Re-suspendre l&#39;algue dans le surnageant restant par pipetage doux le culot vers le haut et vers le bas et transférer le culot cellulaire complète à un tube de battage de talon en utilisant une pipette de 200 ul. </li><li> Rincer le tube de centrifugeuse et la pipette en verre avec de l&#39;eau de ± 0,15 ml et transférer le liquide dans le même tube de battage de talon. </li><li> Tubes Centrifugeuse perle de batteur pour une minute à vitesse de rotation maximale pour s&#39;assurer qu&#39;aucune bulle d&#39;air dans le fond des tubes. Il est possible de stocker des tubes perle de batteur fermés à -80 ° C. </li><li> Lyophiliser les tubes perle de batteur contenant l&#39;échantillon. Il est possible de stocker les tubes perle de batteur fermés à -80 ° C. </li></ol> 1.2. Exemple de l&#39;option Protocole Préparation 2 <ol><li> Centrifuger un volume indéterminé de bouillon de culture d&#39;algues et éliminer le surnageant. Il n&#39;est pas nécessaire de déterminer la concentration de la biomasse ou à mesurer le volume utilisé. </li><li> Mesurer ou calculer l&#39;osmolarité du milieu de culture en utilisant la concentration des principaux sels présents dans le milieu de culture. </li><li> Laver le culot cellulaire en remettant en suspension le culot cellulaire dans le même volume, tel qu&#39;il est utilisé dans l&#39;étape 1.2.1, d&#39;une solution de formiate d&#39;ammonium, qui se rapproche de l&#39;osmolarité du milieu de culture. Une solution de formiate d&#39;ammonium equiosmolar empêche lyses cellulaires au cours du lavage des cellules. </li></ol> NOTE: Le lavage des cellules est nécessaire pour éliminer les sels présents dans le milieu de culture. Ceci est particulièrement important pour l&#39;analyse des acides gras dans les micro-algues marines en raison des concentrations élevées de sel dans leur milieu de culture. Si sels seraient encore présents, cela causerait une surestimation de la quantité de poids sec des cellules qui sera déterminé plus tard dans tson protocole. formate d&#39;ammonium est utilisé pour laver les cellules car cette solution complètement s&#39;évaporer lors de la lyophilisation et ne laisse aucun résidu. <ol start="4"><li> Centrifugeuse algues suspension et éliminer le surnageant. </li><li> Lyophiliser le culot cellulaire. </li><li> Peser 5 à 10 mg de poudre lyophilisée de microalgues dans un tube de battage de talon. Noter le poids exact. </li></ol> 2. Cellule de perturbation et extraction des lipides NOTE: Cette section décrit une vaste procédure de rupture des cellules. Peut-être, certaines des mesures de perturbation de la cellule sont redondantes et moins vaste perturbation cellulaire pourrait obtenir les mêmes résultats pour certaines espèces de microalgues ou de la biomasse provenant de certaines conditions de culture. Ce devrait validation pour chaque situation spécifique cependant. Par conséquent, la vaste protocole de perturbation proposée est recommandé comme une méthode universelle convient à tout le matériel de micro-algues. <ol><li> Peser une quantité exacte de tripentadecanoin (triacylglycerol contenant trois C15: 0 acides gras) et l&#39;ajouter à une quantité exactement connue 4:5 (v / v) de chloroforme: méthanol. De cette façon, la concentration de tripentadecanoin est exactement connue. Objectif pour une concentration de 50 mg / L. Tripentadecanoin sert d&#39;étalon interne pour la quantification des acides gras. </li><li> Ajouter 1 ml de chloroforme: méthanol 04:05 (v / v) contenant tripentadecanoin à chaque tube de battage (spécifié dans les réactifs et tableau des équipements). Vérifiez qu&#39;il n&#39;y a pas de perles restantes à l&#39;intérieur du capuchon du tube de BeadBeater, cela se traduira par une fuite des tubes. Utiliser une pipette volumétrique pour plus précise de solvants. </li><li> Perle battre les tubes perle de batteur 8x à 2500 tours par minute pendant 60 secondes, chaque fois avec un 120 sec interne entre chaque battement. </li><li> Transférer la solution des tubes perle de batteur à 15 ml tube de centrifugation en verre résistant à la chaleur propre avec insert en Téflon capsules à vis. Assurez-vous de transférer toutes les perles du tube de battage de perles ainsi. </li><li> Pour n&#39;étaith le tube de battage de talon, ajouter 1 ml de chloroforme: methanol 04:05 (v / v) contenant tripentadecanoin dans le tube de battage de talon, à proximité capuchon et mélanger, et transférer cette solution sur le même tube de verre provenant de l&#39;étape 2.4. Laver le tube trois fois (au total 4 ml de chloroforme: méthanol 04:05 (v / v) contenant tripentadecanoin est utilisé par échantillon - 1 ml ajoutés à l&#39;étape 2.2 et 3 ml pour 3 étapes de lavage). </li><li> Vortex les tubes en verre pour 5 s et de traitement par ultrasons dans un bain de sonication pendant 10 min. </li><li> Ajouter 2,5 ml d&#39;eau MilliQ, contenant 50 mM de 2-amino-2-hydroxyméthyl-propane-1 ,3-diol (Tris) et 1 M de NaCl, qui est réglée à un pH de 7 en utilisant une solution de HCl. Cela entraînera une séparation de phases entre du chloroforme et de méthanol: eau. 1 M de NaCl est utilisé pour améliorer l&#39;équilibre des lipides vers la phase de chloroforme. </li><li> Vortex pendant 5 secondes, puis sonication pendant 10 min. </li><li> Centrifuger pendant 5 minutes à 1200 x g. </li><li> Transférer la phase chloroformique à l&#39;(phase inférieure) dans un tube en verre propre en utilisant un pipett Pasteur en verree. Assurez-vous de ne pas transférer tout ou interphase phase supérieure. </li><li> Ré-extraire l&#39;échantillon en ajoutant 1 ml de chloroforme à ancien tube (contenant le méthanol: solution d&#39;eau). </li><li> Vortex pendant 5 secondes, puis sonication pendant 10 min. </li><li> Centrifuger pendant 5 minutes à 1200 x g. </li><li> Recueillir la phase de chloroforme (phase inférieure) en utilisant une pipette Pasteur et la piscine de verre avec la première fraction chloroformique de l&#39;étape 2.10. </li><li> Si des difficultés sont expérimentés dans la collecte de la fraction chloroforme ensemble à l&#39;étape précédente, répétez les étapes 2.11 à 2.14. Sinon, passez à l&#39;étape 2.16. </li><li> On évapore le chloroforme à partir du tube dans un courant d&#39;azote gazeux. Après cette étape, les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C sous une atmosphère d&#39;azote gazeux. </li></ol> 3. Transestérification pour esters méthyliques d&#39;acides gras <ol><li> Ajouter 3 ml de methanol contenant 5% (v / v) d&#39;acide sulfurique dans le tube contenant les lipides extraits secs (tubes contenant l&#39;origine de la fraction chloroforme) etfermer hermétiquement le tube. </li><li> Vortex pendant 5 sec. </li><li> Incuber les échantillons pendant 3 heures à 70 ° C dans un bloc chauffant ou un bain d&#39;eau. Périodiquement (tous les ± 30 min) veiller à ce que les échantillons ne sont pas en ébullition (causée par un couvercle mal fermé) et les tubes vortex. Au cours de cette réaction sont des acides gras méthylés de leurs esters méthyliques d&#39;acides gras (FAME). </li><li> Échantillons refroidir à température ambiante et ajouter 3 ml eau MilliQ et 3 ml de n-hexane. </li><li> Vortex pendant 5 secondes et on mélange pendant 15 min avec un rotateur pour tubes à essais. </li><li> Centrifuger pendant 5 minutes à 1200 x g. </li><li> Recueillir 2 ml de la phase hexane (en haut) et mettre dans un tube de verre frais en utilisant une pipette Pasteur en verre. </li><li> Ajouter l&#39;eau de 2 ml de la phase d&#39;hexane recueillies à laver. </li><li> Vortex pendant 5 secondes et centrifuger pendant 5 min à 1200 x g. Après cette étape, il est possible de conserver les échantillons à -20 ° C sous atmosphère d&#39;azote gazeux (de séparation de phase n&#39;est pas nécessaire). </li></ol> 4. Quantification des FAMEs Uchantent chromatographie en phase gazeuse <ol><li> Remplir des flacons en GC de la phase d&#39;hexane (phase supérieure) à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur en verre. </li><li> Placez les bouchons sur les flacons de GC. Assurez-vous que les bouchons sont complètement scellés, et ne peuvent pas être transformés, pour éviter l&#39;évaporation de la fiole. </li><li> Remplir les solvants de lavage de GC (hexane), vider les flacons de déchets, et de mettre en flacons d&#39;échantillon échantillonneur automatique. Avant d&#39;exécuter les échantillons réels sur le GC, première manche 2 blancs ne contenant que de l&#39;hexane sur le GC. </li><li> Analyser les échantillons avec un GC-FID avec une colonne Nukol (30 mx 0,53 mm x 1,0 um). Utilisez la température d&#39;entrée de 250 ° C et utiliser de l&#39;hélium comme gaz porteur, la pression de 81,7 kPa et rapport de division de 0,1:1, débit total: 20 ml / min. Température du détecteur FID à 270 ° C avec H 2 débit de 40 ml / min, débit de 400 ml / min de débit d&#39;air et il taux de 9,3 ml / min de débit. Régler le volume d&#39;injection de 1 pl / échantillon. Avant et après lavage injecteur avec du n-hexane. Température initiale du four est réglé à 90 ° C pendant 0,5 min et ensuite soulevé l&#39;esprith 20 ° C / min jusqu&#39;à une température de four de 200 ° C soit atteinte. La température du four est ensuite maintenue à 200 ° C pendant 39 min. Une durée totale est de 45 min. </li></ol>

<ol>
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Les auteurs ont rien à révéler.

Le procédé décrit peut être utilisé pour déterminer le contenu ainsi que la composition des acides gras totaux présents dans la biomasse de micro-algues. Les acides gras dérivés de toutes les classes de lipides, y compris le stockage (TAG), ainsi que des lipides membranaires (phospholipides et glycolipides), sont détectés. Toutes les longueurs de chaîne d&#39;acides gras et les degrés de saturation qui sont présentes dans les micro-algues peuvent être détectées et distinguées. La méthode est basée su...

Les acides gras sont un des principaux constituants de la biomasse de microalgues et de faire généralement entre 5-50% du poids sec des cellules 1-3. Ils sont principalement présents sous la forme de glycérolipides. Ces glycérolipides à son tour principalement constitués de phospholipides, des glycolipides et triglycérides (TAG). En particulier, les acides gras présents dans le TAG sont d&#39;intérêt commercial, car ils peuvent être utilisés comme une ressource pour la production de carburants de transport, les produits chimiques en vrac, des nutraceutiques (ω-3 acides gras), et les produits alimentaires 3-6. Microalgues peuvent croître dans des milieux de culture à base d&#39;eau de mer, peut avoir une productivité de surface beaucoup plus élevé que les plantes terrestres, et peut être cultivé dans des photobioréacteurs à des endroits qui sont impropres à l&#39;agriculture, peut-être même à l&#39;étranger. Pour ces raisons, les microalgues sont souvent considérés comme une alternative prometteuse pour les plantes terrestres pour la production de biodiesel et d&#39;autres produits en vrac 3-6. Potentiellement pas l agricoleet ou d&#39;eau douce (lorsqu&#39;elles sont cultivées dans des photobioréacteurs fermés ou quand microalgues marines sont utilisés) est nécessaire pour leur production. Par conséquent, les biocarburants dérivés de microalgues sont considérées comme 3 ème génération de biocarburants. Le contenu cellulaire total en acides gras (% du poids sec), la composition de la classe de lipides, ainsi que la longueur de l&#39;acide gras et le degré de saturation sont très variables selon les espèces de microalgues. En outre, ces propriétés varient avec les conditions de culture telles que la disponibilité des nutriments, la température, le pH, l&#39;intensité lumineuse et 1,2. Par exemple, lorsqu&#39;ils sont exposés à la privation d&#39;azote, de micro-algues peuvent accumuler de grandes quantités de TAG. Dans des conditions de croissance optimales TAG constitue généralement moins de 2% du poids sec, mais lorsqu&#39;ils sont exposés à la famine azote contenu de TAG peut augmenter jusqu&#39;à 40% du poids sec des microalgues 1. Les microalgues produisent principalement des acides gras à chaîne longue de 16 à 18atomes de carbone, mais certaines espèces peuvent apporter des acides gras allant jusqu&#39;à 24 atomes de carbone en longueur. Les deux saturé ainsi que les acides gras hautement insaturés sont produits par des micro-algues. Ces derniers comprennent les acides gras avec des avantages nutritionnels (ω-3 acides gras) comme C20: 5 (acide eicosapentaénoïque, EPA) et C22: 6 (acide docosahexaénoïque, DHA) pour lesquels aucune solution de rechange végétales existent 1,2,4,7. Le (la distribution de) l&#39;acide gras de longueur de chaîne et du degré de saturation détermine également les propriétés et la qualité des biocarburants d&#39;algues dérivés et les huiles comestibles 4,8. Pour développer des applications commerciales de microalgues dérivés des acides gras, des méthodes d&#39;analyse fiables pour la quantification de la teneur en acides gras et la composition sont nécessaires. Comme l&#39;a également souligné Ryckebosch et al. 9, l&#39;analyse des acides gras dans les microalgues se distingue des autres substrats (par exemple l&#39;huile végétale, les produits alimentaires, les tissus d&#39;animaux, etc) êtreprovoquer 1) microalgues sont des cellules individuelles entourées de parois cellulaires rigides, ce qui complique l&#39;extraction des lipides; 2) microalgues contiennent une grande variété de classes de lipides et la distribution de la classe de lipides est très variable 7. Ces différentes classes de lipides ont une grande variété dans la structure chimique et des propriétés telles que la polarité. En outre, les classes de lipides autres que les lipides acyle sont produites, 3) contient des micro-algues d&#39;une grande variété d&#39;acides gras, variant de 12 à 24 atomes de carbone de longueur et contenant à la fois saturés ainsi que des acides gras hautement insaturés. Par conséquent, les méthodes mises au point pour analyser les acides gras dans les substrats autres que les micro-algues, pourrait ne pas être approprié pour analyser les acides gras dans les microalgues. Comme examiné par Ryckebosch et al. 9, la principale différence entre les procédures d&#39;extraction des lipides couramment utilisés dans les solvants est-systèmes qui sont utilisés. En raison de la grande variété de classes de lipides présents dans les microalgues, chacun variant de polarité, la extraitla quantité de lipides peut varier selon les solvants utilisés 10 à 12. Cela conduit à des incohérences dans le contenu lipidique et la composition présentée dans la littérature 9,10. En fonction du système de solvants utilisé, les méthodes basées sur l&#39;extraction par solvant, sans rupture des cellules par le biais, par exemple, les battements de bourrelet ou sonication, risquent de ne pas extraire l&#39;ensemble des lipides en raison de la structure rigide de certaines espèces de microalgues 9,13. Dans le cas de l&#39;extraction des lipides incomplète, l&#39;efficacité de l&#39;extraction des différentes classes de lipides peut varier 14. Cela peut aussi avoir un effet sur ​​la composition en acides gras mesurée, car la composition en acides gras est variable entre les classes de lipides 7. Notre procédé est basé sur une séquence de rupture mécanique des cellules, l&#39;extraction par solvant à base de lipide, la transestérification des acides gras en esters gras méthyliques d&#39;acide (FAME), et la quantification et l&#39;identification de FAME à l&#39;aide de Chromatographie en phase gazeuse en combinaison avec une ionisation de flammedétecteur de tion (GC-FID). Un étalon interne sous la forme d&#39;un triacylglycérol (tripentadecanoin) est ajouté avant le procédé d&#39;analyse. Les pertes éventuelles lors de l&#39;extraction et de transestérification incomplète peuvent alors être corrigées pour. La méthode peut être utilisée pour déterminer le contenu ainsi que la composition des acides gras présents dans la biomasse de micro-algues. Tous les acides gras présents dans les différentes classes d&#39;acyl-lipide, y compris le stockage (TAG), ainsi que des lipides membranaires (les glycolipides, phospholipides), sont détectés, identifiés et quantifiés avec précision et de façon reproductible par ce procédé en utilisant uniquement des petites quantités d&#39;échantillon (5 mg) . Cette méthode ne fournit pas d&#39;informations sur l&#39;abondance relative des différentes classes de lipides. Cependant, le procédé peut être étendu à séparer les classes de lipides de l&#39;autre 1. La composition des différentes classes de lipides et de la concentration de l&#39;acide gras peut ensuite être déterminée individuellement. Dans la littérature plusieurs autres méthodes sontdécrit à analyser les lipides dans les microalgues. Certaines méthodes sont axées sur le total des composants lipophiles 15, alors que d&#39;autres méthodes sont axées sur les acides gras totaux 9,16. Ces solutions comprennent détermination gravimétrique des lipides totaux extraits, trans-estérification directe des acides gras combinés à la quantification en utilisant la Chromatographie, et cellules présentant une coloration avec des colorants fluorescents lipophiles. Une solution couramment utilisée pour la quantification des acides gras par chromatographie est la quantification des lipides en utilisant une détermination gravimétrique 17,18. Avantages d&#39;une détermination gravimétrique sont l&#39;absence d&#39;exigences pour l&#39;équipement de pointe et coûteux comme un chromatographe en phase gazeuse; facilité à mettre en place la procédure, en raison de la disponibilité de l&#39;équipement analytique standardisée (par exemple Soxhlet), et une détermination gravimétrique est moins de temps que Chromatographie méthodes fondées. L&#39;avantage majeur de l&#39;utilisation des méthodes de chromatographie sur la base de l&#39;OTHer main est que, dans un tel procédé que les acides gras sont mesurés. Dans une détermination gravimétrique de l&#39;acide non gras contenant des lipides, comme des pigments ou des stéroïdes, sont également inclus dans la détermination. Ces acides gras non-contenant des lipides peuvent constituer une part importante (&gt; 50%) des lipides totaux. Si l&#39;on ne s&#39;intéresse qu&#39;à la teneur en acide gras (par exemple pour des applications de biodiesel), il sera surestimée quand une détermination gravimétrique est utilisé. En outre, dans une détermination gravimétrique de la précision de la balance analytique utilisée pour peser les lipides extraits détermine la taille de l&#39;échantillon qui doit être utilisé. Cette quantité est généralement beaucoup plus que la quantité nécessaire lorsque la Chromatographie est utilisée. Enfin, un autre avantage de l&#39;utilisation de la Chromatographie sur détermination gravimétrique est que la Chromatographie fournit des informations sur la composition en acides gras. Une autre alternative à notre méthode présentée est 16,19,20 de transestérification directe.Dans ce procédé, l&#39;extraction des lipides et la transestérification des acides gras à FAMEs sont combinées en une seule étape. Cette méthode est plus rapide que l&#39;extraction d&#39;une étape séparée et la transestérification, mais la combinaison de ces étapes limite les solvants qui peuvent être utilisés pour l&#39;extraction. Cela pourrait influencer négativement l&#39;efficacité de l&#39;extraction. Un autre avantage d&#39;une extraction des lipides et la transestérification étape séparée est qu&#39;il permet une séparation des classes de lipides supplémentaire entre les étapes 1. Ceci n&#39;est pas possible lorsque la transestérification directe est utilisé. D&#39;autres méthodes couramment utilisées pour déterminer la teneur en lipides des microalgues sont coloration de la biomasse avec des taches fluorescentes lipophiles tels que le Nil rouge ou BODIPY et mesurer le signal de fluorescence 21,22. Un avantage de ces méthodes est qu&#39;elles sont moins laborieux que les procédés alternatifs. Un inconvénient de ces méthodes est que la réponse fluorescente est, pour diverses raisons, variable entre spécies, les conditions de culture, les classes de lipides, et des procédures analytiques. A titre d&#39;exemple, plusieurs de ces variations sont causées par des différences dans l&#39;absorption du colorant par les micro-algues. L&#39;étalonnage en utilisant une autre méthode quantitative est donc nécessaire, de préférence effectuée pour toutes les différentes conditions de culture et les stades de croissance. Enfin, cette méthode ne fournit pas d&#39;informations sur la composition en acides gras et est moins précise et reproductible que les méthodes de chromatographie en fonction. La méthode présentée est basée sur la méthode décrite par Lamers et al. 23 et Santos et al. 24 et a également été appliquée par d&#39;autres auteurs 1,25-27. Également d&#39;autres méthodes sont disponibles qui sont basés sur les mêmes principes et pourraient fournir des résultats similaires 9,28.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Reagent and equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>tripentadecanoin (C15:0 TAG)</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>T4257</td>
 <td>CAS Number 7370-46-9</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample</td>
 <td>Sigma Aldrich </td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample</td>
 <td>Lipidox</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample</td>
 <td>Larodan</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Beadbeater</td>
 <td>Bertin Technologies</td>
 <td>Precellys 24</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>beadbeater tubes</td>
 <td>MP Biomedicals</td>
 <td>Lysing matrix E 
 116914500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GC-FID</td>
 <td>Hewlett-Packer</td>
 <td>HP6871</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GC column</td>
 <td>Supelco</td>
 <td>Nukol 25357</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Positive displacement pipette 100-1000&mu;l</td>
 <td>Mettler Toledo</td>
 <td>MR-1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Positive displacement pipet tips C-1000</td>
 <td>Mettler Toledo</td>
 <td>C-1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml</td>
 <td>VWR</td>
 <td>612-1925</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>glass tubes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>SCERE5100160011G1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000</td>
 <td>VWR</td>
 <td>SCERE5100160011G1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Teflon coated screw-caps</td>
 <td>VWR</td>
 <td>SCERKSSR15415BY10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator</td>
 <td>VWR</td>
 <td>445-2101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heated Evaporator/Concentrator</td>
 <td>Cole-Parmer</td>
 <td>YO-28690-25</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

analysis of fatty acid content and composition in microalgae

Procédé pour déterminer la teneur et la composition des acides gras totaux présents dans les micro-algues est décrit. Les acides gras sont un constituant majeur de la biomasse de microalgues. Ces acides gras peuvent être présents dans différentes classes d&#39;acyl-lipide. En particulier, les acides gras présents dans triacylglycérols (TAG) sont d&#39;un intérêt commercial, car ils peuvent être utilisés pour la production de carburants de transport, les produits chimiques en vrac, des nutraceutiques (ω-3 acides gras), et les produits alimentaires. Pour développer des applications commerciales, les méthodes analytiques permettant la quantification de la teneur en acide gras et de la composition sont nécessaires. Les microalgues sont des cellules individuelles entourées par une paroi cellulaire rigide. Procédé d&#39;analyse d&#39;acide gras doit fournir suffisamment de rupture des cellules pour libérer tous les lipides d&#39;acyle et la procédure d&#39;extraction utilisée doit être capable d&#39;extraire toutes les classes de lipides acyle. Avec la méthode présentée ici tous les acides gras présents dans les microalgues peuvent être précise et reproductible idenTIFIÉ et quantifiés à l&#39;aide de petites quantités d&#39;échantillon (5 mg), indépendamment de leur longueur de chaîne, le degré d&#39;insaturation, ou la classe de lipides, ils font partie. Ce procédé ne fournit pas d&#39;informations sur l&#39;abondance relative des différentes classes de lipides, mais peut être étendu à séparer les classes de lipides de l&#39;autre. La méthode est basée sur une séquence de rupture mécanique des cellules, l&#39;extraction par solvant à base de lipide, la transestérification des acides gras en esters gras méthyliques d&#39;acide (FAME), et la quantification et l&#39;identification de FAME à l&#39;aide de Chromatographie en phase gazeuse (GC-FID). Un étalon interne de TAG (tripentadecanoin) est ajouté avant le procédé d&#39;analyse pour corriger les pertes au cours de l&#39;extraction et de transestérification incomplète.

Un chromatogramme typique que l&#39;on obtient via ce procédé est présenté sur la figure 1. FAME sont séparés par taille et le degré de saturation par la colonne de GC et le protocole utilisé. Plus courtes longueurs d&#39;acides gras à chaîne et d&#39;acides gras saturés (plus moins de doubles liaisons) ont des temps de rétention. La colonne de CPG utilisée protocole et n&#39;ont pas l&#39;intention de séparer les isomères d&#39;acides gras (même longueur de chaîne et le degré de satur...

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Analysis of Fatty Acid Content and Composition in Microalgae

Procédé pour la détermination de la teneur en acides gras et de la composition en micro-algues sur la base de la rupture mécanique des cellules, le solvant d&#39;extraction à base de lipide, de transestérification, et la quantification et l&#39;identification des acides gras par chromatographie en phase gazeuse est décrit. Un étalon interne tripentadecanoin est utilisé pour compenser les pertes possibles lors de l&#39;extraction et de transestérification incomplète.

Analyse de la teneur en acide gras et de la composition en microalgues

A method to determine the content and composition of total fatty acids present in microalgae is described. Fatty acids are a major constituent of ...

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Research

JoVE Journal

Environment

59.4K vues.  Wageningen University and Research Center.  Procédé pour la détermination de la teneur en acides gras et de la composition en micro-algues sur la base de la rupture mécanique des cellules, le solvant d'extraction à base de lipide, de transestérification, et la quantification et l'identification des acides gras par chromatographie en phase gazeuse est décrit. Un étalon interne tripentadecanoin est utilisé pour compenser les pertes possibles lors de l'extraction et de transestérification incomp...

Vidéo: Analysis of Fatty Acid Content and Composition in Microalgae

Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently than plants3, but also synthesize advanced biofuels2-4. Generally, atmospheric CO2 is not a sufficient source for supporting maximal algal growth5. On the other hand, the high concentrations of CO2 in industrial exhaust gases have adverse effects on algal physiology. Consequently, both cultivation conditions (such as nutrients and light) and the control of the flue gas flow into the photo-bioreactors are important to develop an efficient &ldquo;flue gas to algae&rdquo; system. Researchers have proposed different photobioreactor configurations4,6 and cultivation strategies7,8 with flue gas. Here, we present a protocol that demonstrates how to use models to predict the microalgal growth in response to flue gas settings. We perform both experimental illustration and model simulations to determine the favorable conditions for algal growth with flue gas. We develop a Monod-based model coupled with mass transfer and light intensity equations to simulate the microalgal growth in a homogenous photo-bioreactor. The model simulation compares algal growth and flue gas consumptions under different flue-gas settings. The model illustrates: 1) how algal growth is influenced by different volumetric mass transfer coefficients of CO2; 2) how we can find optimal CO2 concentration for algal growth via the dynamic optimization approach (DOA); 3) how we can design a rectangular on-off flue gas pulse to promote algal biomass growth and to reduce the usage of flue gas. On the experimental side, we present a protocol for growing Chlorella under the flue gas (generated by natural gas combustion). The experimental results qualitatively validate the model predictions that the high frequency flue gas pulses can significantly improve algal cultivation.

Flue gas from power plants is a cheap CO2 source for algal growth. We have built prototype &#34;flue gas to algal cultivation&#34; systems and described how to scale up the algal cultivation process. We have demonstrated the use of a mass-transfer bio-reaction model to simulate and to design the optimal operation of flue gas for the growth of Chlorella sp. in algal photo-bioreactors.

Optimiser les réglages des gaz de combustion pour la promotion de la croissance des microalgues en photobioréacteurs via des simulations informatiques

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

Recherche

Environnement

Quantification of Heavy Metals and Other Inorganic Contaminants on the Productivity of Microalgae

Increasing demand for renewable fuels has researchers investigating the feasibility of alternative feedstocks, such as microalgae. Inherent advantages include high potential yield, use of non-arable land and integration with waste streams. The nutrient requirements of a large-scale microalgae production system will require the coupling of cultivation systems with industrial waste resources, such as carbon dioxide from flue gas and nutrients from wastewater. Inorganic contaminants present in these wastes can potentially lead to bioaccumulation in microalgal biomass negatively impact productivity and limiting end use. This study focuses on the experimental evaluation of the impact and the fate of 14 inorganic contaminants (As, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V and Zn) on Nannochloropsis salina growth. Microalgae were cultivated in photobioreactors illuminated at 984 &#181;mol m-2 sec-1 and maintained at pH 7 in a growth media polluted with inorganic contaminants at levels expected based on the composition found in commercial coal flue gas systems. Contaminants present in the biomass and the medium at the end of a 7 day growth period were analytically quantified through cold vapor atomic absorption spectrometry for Hg and through inductively coupled plasma mass spectrometry for As, Cd, Co, Cr, Cu, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V and Zn. Results show N. salina is a sensitive strain to the multi-metal environment with a statistical decrease in biomass yieldwith the introduction of these contaminants. The techniques presented here are adequate for quantifying algal growth and determining the fate of inorganic contaminants.

Integration of microalgal cultivation with industrial flue gas will ultimately introduce heavy metals and other inorganic compounds into the growth media. This study presents a procedure used to determine the end fate and impact of heavy metals and inorganic contaminants on the growth of Nannochloropsis salina grown in photobioreactors.

Quantification des métaux lourds et d&#39;autres contaminants inorganiques sur la productivité des microalgues

Increasing demand for renewable fuels has researchers investigating the feasibility of alternative feedstocks, such as microalgae. Inherent advantages ...

Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content

Outdoor aerosol research commonly uses particulate matter sampled on filters. This procedure enables various characterizations of the collected particles to be performed in parallel. The purpose of the method presented here is to obtain a highly accurate and reliable analysis of the endotoxin and DNA content of bio-aerosols extracted from filters. The extraction of high molecular weight organic molecules, such as lipopolysaccharides, from sampled filters involves shaking the sample in a pyrogen-free water-based medium. The subsequent analysis is based on an enzymatic reaction that can be detected using a turbidimetric measurement. As a result of the high organic content on the sampled filters, the extraction of DNA from the samples is performed using a commercial DNA extraction kit that was originally designed for soils and modified to improve the DNA yield. The detection and quantification of specific microbial species using quantitative polymerase chain reaction (q-PCR) analysis are described and compared with other available methods.

Two complementary analyses of atmospheric biological particles from air sampled filters are described herein: the extraction and detection of endotoxin, and of DNA.

L&#39;analyse du filtre à air dans l&#39;échantillon d&#39;endotoxines et de l&#39;ADN contenu

Outdoor aerosol research commonly uses particulate matter sampled on filters. This procedure enables various characterizations of the collected particles ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about the overall structure of terrestrial microbial communities. PLFA profiling has been extensively used in a range of ecosystems as a biological index of overall soil quality, and as a quantitative indicator of soil response to land management and other environmental stressors.
The standard method presented here outlines four key steps: 1. lipid extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, 2. fractionation using solid phase extraction columns to isolate phospholipids from other extracted lipids, 3. methanolysis of phospholipids to produce fatty acid methyl esters (FAMEs), and 4. FAME analysis by capillary gas chromatography using a flame ionization detector (GC-FID). Two standards are used, including 1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC(19:0/19:0)) to assess the overall recovery of the extraction method, and methyl decanoate (MeC10:0) as an internal standard (ISTD) for the GC analysis.

Phospholipid fatty acids provide information about the structure of soil microbial communities. We present methods for extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, fractionation of extracted lipids using solid phase extraction columns, and methanolysis to produce fatty acid methyl esters, which are analyzed by capillary gas chromatography.

Extraction et analyse des acides gras des phospholipides microbiens dans les sols

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Composition and Properties of Aquafaba: Water Recovered from Commercially Canned Chickpeas

Chickpea and other pulses are commonly sold as canned products packed in a thick solution or a brine. This solution has recently been shown to produce stable foams and emulsions, and can act as a thickener. Recently interest in this product has been enhanced through the internet where it is proposed that this solution, now called aquafaba by a growing community, can be used a replacement for egg and milk protein. As aquafaba is both new and being developed by an internet based community little is known of its composition or properties. Aquafaba was recovered from 10 commercial canned chickpea products and correlations among aquafaba composition, density, viscosity and foaming properties were investigated. Proton NMR was used to characterize aquafaba composition before and after ultrafiltration through membranes with different molecular weight cut offs (MWCOs of 3, 10, or 50 kDa). A protocol for electrophoresis, and peptide mass fingerprinting is also presented. Those methods provided valuable information regarding components responsible for aquafaba functional properties. This information will allow the development of practices to produce standard commercial aquafaba products and may help consumers select products of superior or consistent utility.

Aquafaba is a viscous juice from canned chickpea that, when stirred vigorously, produces a relatively stable white froth or foam. The primary research goal is to identify the components of aquafaba that contribute viscosifying/thickening properties using nuclear magnetic resonance (NMR), ultrafiltration, electrophoresis, and peptide mass fingerprinting.

Composition et caractéristiques des Aquafaba : l’eau extraite des pois chiches commercialement en conserve

Chickpea and other pulses are commonly sold as canned products packed in a thick solution or a brine. This solution has recently been shown to produce ...

The Calibration and Use of Capacitance Sensors to Monitor Stem Water Content in Trees

Water transport and storage through the soil-plant-atmosphere continuum is critical to the terrestrial water cycle, and has become a major research focus area. Biomass capacitance plays an integral role in the avoidance of hydraulic impairment to transpiration. However, high temporal resolution measurements of dynamic changes in the hydraulic capacitance of large trees are rare. Here, we present procedures for the calibration and use of capacitance sensors, typically used to monitor soil water content, to measure the volumetric water content in trees in the field. Frequency domain reflectometry-style observations are sensitive to the density of the media being studied. Therefore, it is necessary to perform species-specific calibrations to convert from the sensor-reported values of dielectric permittivity to volumetric water content. Calibration is performed on a harvested branch or stem cut into segments that are dried or re-hydrated to produce a full range of water contents used to generate a best-fit regression with sensor observations. Sensors are inserted into calibration segments or installed in trees after pre-drilling holes to a tolerance fit using a fabricated template to ensure proper drill alignment. Special care is taken to ensure that sensor tines make good contact with the surrounding media, while allowing them to be inserted without excessive force. Volumetric water content dynamics observed via the presented methodology align with sap flow measurements recorded using thermal dissipation techniques and environmental forcing data. Biomass water content data can be used to observe the onset of water stress, drought response and recovery, and has the potential to be applied to the calibration and evaluation of new plant-level hydrodynamics models, as well as to the partitioning of remotely sensed moisture products into above- and belowground components.

The hydraulic capacitance of biomass is a key component of the vegetation water budget, which serves as a buffer against short and long-term drought stresses. Here, we present a protocol for the calibration and use of soil moisture capacitance sensors to monitor water content in the stems of large trees.

L’étalonnage et l’utilisation de Capacitance capteurs pour surveiller la teneur en eau tige dans les arbres

Water transport and storage through the soil-plant-atmosphere continuum is critical to the terrestrial water cycle, and has become a major research focus ...

Combining Eye-tracking Data with an Analysis of Video Content from Free-viewing a Video of a Walk in an Urban Park Environment

As individuals increasingly live in cities, methods to study their everyday movements and the data that can be collected becomes important and valuable. Eye-tracking informatics are known to connect to a range of feelings, health conditions, mental states and actions. But because vision is the result of constant eye-movements, teasing out what is important from what is noise is complex and data intensive. Furthermore, a significant challenge is controlling for what people look at compared to what is presented to them.
The following presents a methodology for combining and analyzing eye-tracking on a video of a natural and complex scene with a machine learning technique for analyzing the content of the video. In the protocol we focus on analyzing data from filmed videos, how a video can be best used to record participants&#39; eye-tracking data, and importantly how the content of the video can be analyzed and combined with the eye-tracking data. We present a brief summary of the results and a discussion of the potential of the method for further studies in complex environments.

The objective of the protocol is to detail how to collect video data for use in the laboratory; how to record eye-tracking data of participants looking at the data and how to efficiently analyze the content of the videos that they were looking at using a machine learning technique.

Combiner les données de suivi des yeux avec une analyse du contenu vidéo à partir de Free-visualisation d’une vidéo d’une promenade dans un environnement de parc urbain

As individuals increasingly live in cities, methods to study their everyday movements and the data that can be collected becomes important and valuable. ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, we described a protocol for multiple analyses of the biological compositions in environmental PM. Five experiments are presented: (1) PM number monitoring by using a laser particle counter; (2) PM collection by using a cyclonic aerosol sampler; (3) PM collection by using a high-volume air sampler with filters; (4) culturable microbes collection by the Andersen six-stage sampler; and (5) detection of biological composition of environmental PM by bacterial 16SrDNA and fungal ITS region sequencing. We selected hazy days and a livestock farm as two typical examples of the application in this protocol. In this study, these two sampling methods, cyclonic aerosol sampler and filter sampler, showed different sampling efficiency. The cyclonic aerosol sampler performed much better in terms of collecting bacteria, while these two methods showed the same efficiency in collecting fungi. Filter samplers can work under low temperature conditions while cyclonic aerosol samplers have a sampling limitation for temperature. A solid impacting sampler, such as an Andersen six-stage sampler, can be used to sample bioaerosols directly into the culture medium, which increases the survival rate of culturable microorganisms. However, this method mainly relies on culture while more than 99% of microbes cannot be cultured. DNA extracted from the culturable bacteria collected by the Andersen six-stage sampler and samples collected by cyclonic aerosol sampler and filter sampler were detected by bacterial 16S rDNA and fungal ITS region sequencing.All the methods above may have wide application in many fields of study, such as environmental monitoring and airborne pathogen detection. From these results, we can conclude that these methods can be used under different conditions and may help other researchers further explore the health impacts of environmental bioaerosols.

Understanding the biological composition of environmental particulate matter is important for the study of its significant impacts on human health and disease spread. Here, we used three types of bioaerosol sampling methods and a biological analysis of airborne microbes to better explore airborne microbial communities under different environmental conditions.

Composition et analyse de la Distribution des bioaérosols sous différentes Conditions environnementales

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the treatment of wastes. As most new research efforts begin at laboratory scale, there is a need for cost-effective methods for culturing microalgae in a reproducible manner. Here, we communicate an effective approach to culture microalgae in laboratory-scale photobioreactors, and to measure the growth and neutral lipid content of that algae. Instructions are also included on how to set up the photobioreactor system. Although the example organisms are species of Chlorella and Auxenochlorella, this system can be adapted to cultivate a wide range of microalgae, including co-cultures of algae with non-algae species. Stock cultures are first grown in bottles to produce inoculum for the photobioreactor system. Algae inoculum is concentrated and transferred to photobioreactors for cultivation in batch mode. Samples are collected daily for the optical density readings. At the end of the batch culture, cells are harvested by centrifuge, washed, and freeze dried to obtain a final dry weight concentration. The final dry weight concentration is used to create a correlation between the optical density and the dry weight concentration. A modified Folch method is subsequently used to extract total lipids from the freeze-dried biomass and the extract is assayed for its neutral lipid content using a microplate assay. This assay has been published previously but protocol steps were included here to highlight critical steps in the procedure where errors frequently occur. The bioreactor system described here fills a niche between simple flask cultivation and fully-controlled commercial bioreactors. Even with only 3-4 biological replicates per treatment, our approach to culturing algae leads to tight standard deviations in the growth and lipid assays.

Here, we present a protocol to construct lab-scale bubble column photobioreactors and use them to culture microalgae. It also provides a method for the determination of the culture growth rate and neutral lipid content.

Culture de microalgues vertes en bulle colonne photobioréacteurs et un dosage des lipides neutres

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...

Manufacturing Simple and Inexpensive Soil Surface Temperature and Gravimetric Water Content Sensors

Quantifying temperature and moisture at the soil surface is essential for understanding how soil surface biota respond to changes in the environment. However, at the soil surface these variables are highly dynamic and standard sensors do not explicitly measure temperature or moisture in the upper few millimeters of the soil profile. This paper describes methods for manufacturing simple, inexpensive sensors that simultaneously measure the temperature and moisture of the upper 5 mm of the soil surface. In addition to sensor construction, steps for quality control, as well as for calibration for various substrates, are explained. The sensors incorporate a Type E thermocouple to measure temperature and assess soil moisture by measuring the resistance between two gold-plated metal probes at the end of the sensor at a depth of 5 mm. The methods presented here can be altered to customize probes for different depths or substrates. These sensors have been effective in a variety of environments and have endured months of heavy rains in tropical forests as well as intense solar radiation in deserts of the southwestern U.S. Results demonstrate the effectiveness of these sensors for evaluating warming, drying, and freezing of the soil surface in a global change experiment.

Accurately measuring temperature and water content of the upper 5 mm of the soil surface can improve our understanding of environmental controls on biological, chemical, and physical processes. Here we describe a protocol for manufacturing, calibrating, and conducting measurements with soil surface temperature and moisture sensors.

Fabrication de capteurs de température de surface du sol simples et peu coûteux et de contenu gravimétrique de l'eau

Quantifying temperature and moisture at the soil surface is essential for understanding how soil surface biota respond to changes in the environment. ...