Una parte di questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dall&#39;Istituto per la promozione dell&#39;innovazione da Scienza e della Tecnologia-Strategic Ricerca di Base (IWT-SBO) Luce solare di progetto e le cellule Biosolar. Erik Bolder e BackKim Nguyen sono riconosciuti per il loro contributo alla ottimizzazione della procedura di battitura tallone.

1. Preparazione del campione Ci sono due protocolli alternativi per il campione preparato incluso come passi 1.1 e 1.2. Entrambi i metodi sono ugualmente adatti e danno risultati simili, ma se una quantità limitata di alghe volume di cultura è disponibile, si consiglia il metodo 1.1. NOTA: Per entrambi i protocolli, preparare due tubi branello dosatori supplementari secondo l&#39;intero protocollo ma senza aggiungere alghe per poter essere utilizzate come bianco. In questo modo, i picchi del cromatogramma GC risultante dall&#39;estrazione delle componenti di materiali utilizzati possono essere identificati e quantificati. 1.1. Preparazione del campione protocollo Opzione 1: Consigliato Quando una quantità limitata di alghe cultura è disponibile <ol><li> Determinare la concentrazione alghe peso secco (g / L) in brodo di coltura, ad esempio come descritto da Breuer et al. 1. </li><li> Trasferire un volume di brodo di coltura che contiene 5-10 mg alghe peso secco diuna provetta da centrifuga vetro. Calcolare l&#39;importo esatto della biomassa trasferiti utilizzando la concentrazione della biomassa determinata nella fase 1.1.1. </li><li> Centrifugare 5 min a 1.200 x g. </li><li> Scartare parte del surnatante, lasciare circa 0,25 ml nel tubo. </li><li> Risospendere le alghe nel supernatante residuo delicatamente pipettando pellet su e giù e trasferire il pellet cellulare completa ad un tubo battitore tallone con una pipetta 200 microlitri. </li><li> Risciacquare la pipetta provetta da centrifuga e bicchiere con acqua ± 0,15 ml MilliQ e trasferire il liquido allo stesso tubo battitore tallone. </li><li> Provette da centrifuga branello dosatori per un minuto alla massima rpm per assicurarsi che non rimangano bolle d&#39;aria nella parte inferiore dei tubi. E &#39;possibile memorizzare i tubi tallone battitore chiuso a -80 ° C. </li><li> Liofilizzare i tubi tallone dosatori contenenti il ​​campione. È possibile memorizzare i tubi branello dosatori chiusi a -80 ° C. </li></ol> 1.2. Esempio di Opzione Preparazione protocollo 2 <ol><li> Centrifugare un volume non di cultura alghe brodo e scartare il surnatante. Non è necessario per determinare la concentrazione della biomassa o per misurare il volume utilizzato. </li><li> Misurare o calcolare l&#39;osmolarità del mezzo di coltura utilizzando la concentrazione dei principali sali presenti nel terreno di coltura. </li><li> Lavare il pellet cellulare da risospendere il pellet cellulare nello stesso volume, come usato nella fase 1.2.1, di una soluzione di formiato di ammonio, che approssima l&#39;osmolarità del mezzo di coltura. Una soluzione di formiato di ammonio equiosmolar impedisce lisi delle cellule durante il lavaggio delle cellule. </li></ol> NOTA: Lavare le cellule è necessario rimuovere i sali presenti nel terreno di coltura. Questo è particolarmente importante per l&#39;analisi degli acidi grassi in microalghe marine causa delle alte concentrazioni di sale nel loro terreno di coltura. Se sali sarebbero ancora presenti, ciò causerebbe sovrastima della quantità di peso secco cellulare, che verrà determinato successivamente in til suo protocollo. Ammonio formiato è usato per lavare le cellule, perché questa soluzione sarà completamente evaporare durante la liofilizzazione e non lascia residui. <ol start="4"><li> Sospensione Centrifuga alghe e scarti surnatante. </li><li> Liofilizzare il pellet di cellule. </li><li> Pesare 5-10 mg di polvere liofilizzata di microalghe in un tubo battitore tallone. Registrare il peso esatto. </li></ol> 2. Turbativa delle cellule e dei lipidi estrazione NOTA: Questa sezione descrive una vasta procedura di distruzione cellulare. Forse, alcuni dei passaggi rottura delle cellule sono ridondanti e meno estesa distruzione cellulare potrebbe produrre gli stessi risultati di alcune specie di microalghe o per la biomassa derivata da alcune condizioni di coltivazione. Ciò avrebbe bisogno di convalida per ogni situazione specifica però. Pertanto, l&#39;ampio protocollo perturbazione proposto è raccomandato come un metodo universale adatto per tutti i materiali microalghe. <ol><li> Pesare una quantità esatta di tripentadecanoin (TRiacylglycerol contenente tre C15: 0 acidi grassi) e inserirlo di una quantità esattamente noto 4:5 (v / v) cloroformio: metanolo. In questo modo la concentrazione di tripentadecanoin è esattamente conosciuta. Puntare ad una concentrazione di 50 mg / L. Tripentadecanoin serve come standard interno per la quantificazione di acidi grassi. </li><li> Aggiungere 1 ml di cloroformio: metanolo 04:05 (v / v) contenente tripentadecanoin a ciascun tubo di mantecazione (specificato nei reagenti e apparecchiature tabella). Verificare che non vi siano perline rimanenti all&#39;interno della calotta del tubo beadbeater, questo si tradurrà in perdite dei tubi. Utilizzare una pipetta a spostamento positivo per un accurato aggiunta di solventi. </li><li> Bead battere i tubi tallone battitore 8x a 2.500 rpm per 60 secondi, ogni volta con un 120 sec interna tra ogni battito. </li><li> Trasferire la soluzione dai tubi tallone battitore per un ambiente pulito 15 ml provetta di vetro resistente al calore con inserti in teflon tappi a vite. Accertarsi di trasferire tutte le perline dal tubo battitore tallone pure. </li><li> Per statoh il tubo battitore tallone, aggiungere 1 ml di cloroformio: metanolo 04:05 (v / v) contenente tripentadecanoin nel tubo battitore tallone, vicino tappo e mescolare e trasferire questa soluzione per lo stesso tubo di vetro dal punto 2.4. Lavare il tubo per tre volte (in totale 4 ml di cloroformio: metanolo 04:05 (v / v) contenente tripentadecanoin viene utilizzato per campione - 1 ml aggiunti nel passaggio 2.2 e 3 ml per 3 fasi di lavaggio). </li><li> Agitare vetro per 5 sec e ultrasuoni in un bagno di sonicazione per 10 min. </li><li> Aggiungere 2,5 ml di acqua MilliQ, contenente 50 mM 2-ammino-2-idrossimetil-propan-1 ,3-diolo (Tris) e 1 M NaCl, che è impostato a pH 7 con una soluzione di HCl. Questo provocherà una separazione di fase tra cloroformio e metanolo: acqua. 1 M NaCl è utilizzato per migliorare l&#39;equilibrio dei lipidi verso la fase cloroformio. </li><li> Vortex per 5 secondi e poi con ultrasuoni per 10 min. </li><li> Centrifugare per 5 minuti a 1200 x g. </li><li> Trasferire l&#39;intera fase di cloroformio (fase inferiore) in una provetta di vetro pulita tramite pipett Pasteur di vetroe. Assicurarsi di non trasferire qualsiasi interfase o fase superiore. </li><li> Estrarre nuovamente il campione aggiungendo 1 ml di cloroformio al vecchio tubo (contenente il metanolo: soluzione acquosa). </li><li> Vortex per 5 secondi e poi con ultrasuoni per 10 min. </li><li> Centrifugare per 5 minuti a 1200 x g. </li><li> Raccogliere la fase cloroformio (fase inferiore) con una pipetta Pasteur di vetro e la piscina con la prima frazione di cloroformio dal punto 2.10. </li><li> In caso di difficoltà sono esperti nel raccogliere tutta la frazione di cloroformio nel passaggio precedente, ripetere i passaggi 2,11-2,14. Altrimenti procedere con il passo 2.16. </li><li> Si evapora il cloroformio dal tubo in una corrente di gas azoto. Dopo questo passo campioni possono essere conservati a -20 ° C sotto atmosfera di azoto gassoso. </li></ol> 3. Transesterificazione di esteri metilici degli acidi grassi <ol><li> Aggiungere 3 ml di metanolo contenente 5% (v / v) di acido solforico al tubo contenente i lipidi estratti secchi (tubo originariamente contenenti la frazione cloroformio) echiudere ermeticamente la provetta. </li><li> Vortex per 5 sec. </li><li> Incubare campioni per 3 ore a 70 ° C in una stufa blocco o bagnomaria. Periodicamente (ogni ± 30 min) garantire che i campioni non sono bollente (causato da un coperchio in modo improprio chiuso) e tubi vortex. Durante questa reazione acidi grassi sono metilate a loro esteri metilici di acidi grassi (FAME). </li><li> Campioni raffreddare a temperatura ambiente e aggiungere 3 ml di acqua MilliQ e 3 ml di n-esano. </li><li> Vortex per 5 sec e miscelare per 15 minuti con un rotatore provetta. </li><li> Centrifugare per 5 minuti a 1200 x g. </li><li> Raccogliere 2 ml della fase di esano (in alto) e mettere in tubo di vetro fresco con una pipetta Pasteur di vetro. </li><li> Aggiungere 2 ml di acqua MilliQ alla fase esano raccolto per lavarlo. </li><li> Vortex per 5 secondi e centrifugare per 5 minuti a 1200 x g. Dopo questa fase è possibile conservare i campioni a -20 ° C sotto atmosfera di azoto gassoso (separazione di fase non necessario). </li></ol> 4. Quantificazione del FAMEs Ucantare gascromatografia <ol><li> Riempire fiale GC con la fase di esano (fase superiore) con una pipetta Pasteur di vetro. </li><li> Posizionare i tappi sulle fiale GC. Assicurarsi che i tappi sono completamente sigillati, e non possono essere attivati, per evitare l&#39;evaporazione dal flaconcino. </li><li> Riempire i solventi di lavaggio GC (esano), svuotare le fiale dei rifiuti, e mettere vial di campioni in auto-campionatore. Prima di eseguire i campioni reali sul GC, prima esecuzione 2 spazi vuoti che contengono solo esano sul GC. </li><li> Eseguire i campioni su un GC-FID con una colonna Nukol (30 mx 0,53 millimetri x 1,0 micron). Utilizzare temperatura di ingresso di 250 ° C e utilizzando elio come gas di trasporto, pressione di 81,7 kPa e rapporto di divisione di 0,1:1, portata totale: 20 ml / min. FID temperatura del rivelatore di 270 ° C con H 2 velocità di flusso di 40 ml / min, portata d&#39;aria di 400 ml / min ed Egli portata di 9,3 ml / min. Impostare volume di iniezione di 1 ml / campione. Iniettore pre e post lavaggio con n-esano. Temperatura iniziale del forno è impostato a 90 ° C per 0,5 minuti e poi sollevato spiritoh 20 ° C / min fino a una temperatura del forno di 200 ° C viene raggiunto. La temperatura del forno viene quindi mantenuta a 200 ° C per 39 min. Tempo di esecuzione totale è di 45 min. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il metodo descritto può essere utilizzato per determinare il contenuto e la composizione degli acidi grassi totali presenti nella biomassa microalgali. Acidi grassi ottenuti da tutte le classi di lipidi e stoccaggio (TAG) e lipidi di membrana (fosfolipidi e glicolipidi), vengono rilevati. Tutte le lunghezze di catene di acidi grassi e gradi di saturazione che sono presenti nel microalghe possono essere rilevati e distinti. Il metodo si basa sulla rottura meccanica delle cellule, estrazione dei lipidi solvente, transest...

Gli acidi grassi sono uno dei maggiori costituenti della biomassa microalgali e tipicamente costituiscono tra 5-50% del peso secco cellulare 1-3. Essi sono principalmente presenti nella forma di glycerolipids. Questi glycerolipids a loro volta costituiti principalmente da fosfolipidi, glicolipidi e trigliceridi (TAG). In particolare gli acidi grassi presenti nel TAG sono di interesse commerciale, in quanto possono essere utilizzati come una risorsa per la produzione di carburanti per il trasporto, prodotti chimici di base, nutraceutici (acidi grassi ω-3), e prodotti alimentari 3-6. Le microalghe possono crescere in mezzi di coltura di mare a base di acqua, può avere una produttività areale molto più alta rispetto alle piante terrestri, e può essere coltivata in fotobioreattori in luoghi che non sono adatti per l&#39;agricoltura, forse anche in mare aperto. Per queste ragioni, microalghe sono spesso considerati una promettente alternativa alle piante terrestri per la produzione di biodiesel e altri prodotti sfusi 3-6. Potenzialmente non l agricolae o acqua fresca (quando coltivati ​​in fotobioreattori chiusi o quando si utilizzano microalghe marine) è necessario per la loro produzione. Pertanto, i biocarburanti derivati ​​da microalghe sono considerati biocarburanti di 3 ° generazione. Il contenuto cellulare totale di acidi grassi (% del peso secco), la composizione di classe dei lipidi, come pure la lunghezza degli acidi grassi e grado di saturazione sono altamente variabile tra le specie di microalghe. Inoltre, queste proprietà variano a seconda delle condizioni di coltura, quali la disponibilità di nutrienti, temperatura, pH, e l&#39;intensità della luce 1,2. Ad esempio, se esposti a fame di azoto, le microalghe possono accumulare grandi quantità di TAG. In condizioni di crescita ottimali TAG costituisce tipicamente meno del 2% del peso secco, ma quando esposti ad azoto fame contenuto TAG può aumentare fino al 40% del peso secco microalghe 1. Le microalghe producono principalmente acidi grassi con lunghezze di catena di 16 e 18atomi di carbonio, ma alcune specie possono rendere acidi grassi fino a 24 atomi di carbonio di lunghezza. Sia saturo sia di acidi grassi altamente insaturi sono prodotte da microalghe. Questi ultimi comprendono acidi grassi con benefici nutrizionali (acidi grassi ω-3) come C20: 5 (acido eicosapentaenoico, EPA) e C22: 6 (acido docosaesaenoico, DHA), per cui non esistono alternative vegetali 1,2,4,7. L&#39;(distribuzione di) acidi grassi lunghezza della catena e grado di saturazione determina anche le caratteristiche e la qualità dei biocarburanti derivanti dalle alghe e oli commestibili 4,8. Per sviluppare applicazioni commerciali di acidi grassi microalghe derivato, sono necessari metodi analitici affidabili per la quantificazione del contenuto di acidi grassi e composizione. Come anche sottolineato da Ryckebosch et al. 9, l&#39;analisi degli acidi grassi a microalghe si distingue da altri substrati (ad esempio olio vegetale, prodotti alimentari, tessuti animali, ecc) BEcausare 1) microalghe unicellulari sono circondate da pareti cellulari rigide, complicando estrazione dei lipidi; 2) microalghe contengono un&#39;ampia varietà di classi di lipidi e la distribuzione classe di lipidi è altamente variabile 7. Queste diverse classi di lipidi hanno una grande varietà nella struttura e proprietà come polarità chimica. Inoltre, classi di lipidi diversi dai lipidi acilici sono prodotte; 3) microalghe contengono un&#39;ampia varietà di acidi grassi, che vanno 12-24 atomi di carbonio di lunghezza e contenente sia saturo sia di acidi grassi altamente insaturi. Pertanto, i metodi sviluppati per analizzare acidi grassi in substrati diversi microalghe, potrebbero non essere adatto per analizzare acidi grassi in microalghe. Come recensito da Ryckebosch et al. 9, la differenza principale tra procedure di estrazione dei lipidi comunemente utilizzati sia nel solvente sistemi che vengono utilizzati. A causa della grande varietà di classi di lipidi presenti in microalghe, ognuna diversa polarità, l&#39;estrattoquantità di lipidi varia con solventi utilizzati 10-12. Questo porta a incongruenze nel contenuto lipidico e gli allestimenti presentati in letteratura 9,10. A seconda del sistema solvente usato, metodi basati sulla estrazione con solvente senza distruzione cellulare attraverso, per esempio, branello battitura o sonicazione, potrebbero non estrarre tutti i lipidi a causa della struttura rigida di alcune specie di microalghe 9,13. Nel caso di estrazione dei lipidi incompleta, l&#39;efficienza di estrazione delle varie classi di lipidi può variare 14. Questo può anche avere un effetto sulla composizione in acidi grassi misurato, perché la composizione in acidi grassi è variabile tra classi di lipidi 7. Il nostro metodo si basa su una sequenza di rottura meccanica delle cellule, estrazione dei lipidi solvente, transesterificazione di acidi grassi ad esteri metilici di acidi grassi (FAME), e quantificare e identificare FAMEs mediante gascromatografia in combinazione con una ionizzazione di fiammaRivelatore zione (GC-FID). Uno standard interno nella forma di un triacilglicerolo (tripentadecanoin) è aggiunto prima della procedura analitica. Possibili perdite durante l&#39;estrazione e la transesterificazione incomplete possono essere corretti per. Il metodo può essere utilizzato per determinare il contenuto e la composizione degli acidi grassi presenti nelle biomasse microalgali grassi. Tutti gli acidi presenti nelle diverse classi acil-lipidico e stoccaggio (TAG) e lipidi di membrana (glicolipidi, fosfolipidi), vengono rilevati, identificati e quantificati accurato e riproducibile con questo metodo utilizzando solo piccole quantità di campione (5 mg) di grassi . Questo metodo non fornisce informazioni sulla abbondanza relativa delle diverse classi di lipidi. Tuttavia, il metodo può essere esteso per separare classi di lipidi tra loro 1. La composizione in acidi grassi e la concentrazione delle varie classi di lipidi può essere determinata individualmente. In letteratura molti altri metodi sonodescritto analizzare lipidi in microalghe. Alcuni metodi si concentrano su un totale di componenti lipofile 15, mentre gli altri metodi si concentrano sugli acidi grassi totali 9,16. Tali alternative includono la determinazione gravimetrica del totale dei lipidi estratti, trans-esterificazione diretta di acidi grassi combinati con quantificazione mediante cromatografia, e le cellule colorazione con coloranti fluorescenti lipofile. Un&#39;alternativa comunemente usato per la quantificazione di acidi grassi mediante cromatografia è quantificazione dei lipidi utilizzando una determinazione gravimetrica 17,18. I vantaggi di una determinazione gravimetrica sono la mancanza di requisiti di avanzate e costose apparecchiature come un gascromatografo, facilità di impostare la procedura, a causa della disponibilità di attrezzature analitiche standardizzate (ad es Soxhlet), ed una determinazione gravimetrica è meno dispendio di tempo rispetto cromatografia metodi basati. Il principale vantaggio di utilizzare metodi di cromatografia basata sulla OTHer mano è che in un tale metodo solo gli acidi grassi vengono misurate. In una determinazione gravimetrica l&#39;acido non grasso contenenti lipidi, come i pigmenti o steroidi, sono inclusi anche nella determinazione. Questi lipidi acidi non grassi contenenti può fare una grande percentuale (&gt; 50%) dei lipidi totali. Se si è interessati solo al contenuto di acidi grassi (ad esempio per applicazioni biodiesel), sarà sovrastimato quando si utilizza una determinazione gravimetrica. Inoltre, in una determinazione gravimetrica la precisione della bilancia analitica utilizzata per pesare i lipidi estratti determina la dimensione del campione che deve essere utilizzato. Questa quantità è in genere molto più che la quantità necessaria quando si utilizza la cromatografia. Infine, un altro vantaggio di usare cromatografia su determinazione gravimetrica è che cromatografia fornisce informazioni sulla composizione in acidi grassi. Un&#39;altra alternativa per il nostro metodo presentato è 16,19,20 transesterificazione diretta.In questo metodo di estrazione dei lipidi e transesterificazione di acidi grassi a FAMEs sono combinati in un unico passaggio. Questo metodo è più veloce di una fase di estrazione e transesterificazione separato, ma combinando seguente procedura limita i solventi che possono essere utilizzati per l&#39;estrazione. Ciò potrebbe influenzare negativamente l&#39;efficienza di estrazione. Un altro vantaggio di una fase di estrazione dei lipidi e transesterificazione separata è che permette una separazione classe di lipidi aggiuntivo tra questi passaggi 1. Questo non è possibile se si utilizza transesterificazione diretta. Altri metodi comunemente usati per determinare il contenuto di lipidi microalghe includono la colorazione della biomassa con macchie fluorescenti lipofile come il Nilo rosso o BODIPY e misurando il segnale di fluorescenza 21,22. Un vantaggio di questi metodi è che sono meno laborioso rispetto ai metodi alternativi. Uno svantaggio di questi metodi è che la risposta fluorescente è, per vari motivi, variabile tra species, condizioni di coltivazione, classi di lipidi, e le procedure analitiche. Come esempio, molti di queste variazioni sono causate da differenze nella diffusione del colorante dal microalghe. È quindi necessaria la calibrazione utilizzando un altro metodo quantitativo, preferibilmente eseguita per tutte le diverse condizioni di coltivazione e le fasi di crescita. Infine, questo metodo non fornisce informazioni sulla composizione in acidi grassi ed è meno preciso e riproducibile di metodi di cromatografia base. Il metodo proposto si basa sul metodo descritto da Lamers et al. 23 e Santos et al. 24 ed è stata applicata anche da vari altri autori 1,25-27. Anche altri metodi sono disponibili che si basano sugli stessi principi e potrebbe fornire risultati simili 9,28.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Reagent and equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>tripentadecanoin (C15:0 TAG)</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>T4257</td>
 <td>CAS Number 7370-46-9</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample</td>
 <td>Sigma Aldrich </td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample</td>
 <td>Lipidox</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample</td>
 <td>Larodan</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Beadbeater</td>
 <td>Bertin Technologies</td>
 <td>Precellys 24</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>beadbeater tubes</td>
 <td>MP Biomedicals</td>
 <td>Lysing matrix E 
 116914500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GC-FID</td>
 <td>Hewlett-Packer</td>
 <td>HP6871</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GC column</td>
 <td>Supelco</td>
 <td>Nukol 25357</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Positive displacement pipette 100-1000&mu;l</td>
 <td>Mettler Toledo</td>
 <td>MR-1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Positive displacement pipet tips C-1000</td>
 <td>Mettler Toledo</td>
 <td>C-1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml</td>
 <td>VWR</td>
 <td>612-1925</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>glass tubes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>SCERE5100160011G1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000</td>
 <td>VWR</td>
 <td>SCERE5100160011G1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Teflon coated screw-caps</td>
 <td>VWR</td>
 <td>SCERKSSR15415BY10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator</td>
 <td>VWR</td>
 <td>445-2101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heated Evaporator/Concentrator</td>
 <td>Cole-Parmer</td>
 <td>YO-28690-25</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

analysis of fatty acid content and composition in microalgae

Un metodo per determinare il contenuto e la composizione degli acidi grassi totali presenti in microalghe è descritto. Gli acidi grassi sono un costituente importante della biomassa microalgale. Questi acidi grassi possono essere presenti in diverse classi acil-lipidico. Soprattutto acidi grassi presenti nel trigliceridi (TAG) grassi sono di interesse commerciale, perché possono essere utilizzate per la produzione di carburanti per il trasporto, prodotti chimici di base, nutraceutici (acidi grassi ω-3), e materie prime alimentari. Per sviluppare applicazioni commerciali, sono necessari metodi analitici affidabili per la quantificazione del contenuto di acidi grassi e composizione. Le microalghe sono singole cellule circondate da una parete cellulare rigida. Un metodo di analisi degli acidi grassi dovrebbe fornire rottura delle cellule sufficiente per togliere tutti i lipidi acilici e il procedimento di estrazione utilizzato deve essere in grado di estrarre tutte le classi acil lipidi. Con il metodo qui presentato tutti gli acidi grassi presenti in microalghe possono essere accurato e riproducibile indivitificata e quantificato utilizzando piccole quantità di campione (5 mg) indipendentemente dalla loro lunghezza di catena, grado di insaturazione, o la classe di lipidi fanno parte. Questo metodo non fornisce informazioni sulla relativa abbondanza di differenti classi di lipidi, ma può essere estesa per separare classi di lipidi tra loro. Il metodo si basa su una sequenza di rottura meccanica delle cellule, estrazione dei lipidi solvente, transesterificazione di acidi grassi ad esteri metilici di acidi grassi (FAME), e quantificare e identificare FAMEs mediante gascromatografia (GC-FID). Uno standard interno TAG (tripentadecanoin) è aggiunto prima della procedura analitica per correggere le perdite durante l&#39;estrazione e la transesterificazione incomplete.

Un tipico cromatogramma che viene ottenuta tramite questo processo è mostrato nella Figura 1. FAMEs sono separati da dimensioni e grado di saturazione della colonna GC e protocollo utilizzato. Gli acidi grassi a catena più brevi di lunghezza e più acidi grassi saturi (meno legami matrimoniali) hanno tempi di ritenzione brevi. La colonna GC utilizzato e il protocollo non intendono separare isomeri degli acidi grassi (stessa catena di lunghezza e grado di saturazione, ma diverse posizioni di doppi lega...

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Analysis of Fatty Acid Content and Composition in Microalgae

Procedimento per la determinazione del contenuto di acidi grassi e la composizione in microalghe basato su rottura meccanica delle cellule, estrazione dei lipidi solvente, transesterificazione, e quantificazione e identificazione di acidi grassi mediante gascromatografia è descritto. Uno standard interno tripentadecanoin viene utilizzato per compensare le eventuali perdite durante l&#39;estrazione e transesterificazione incompleta.

Analisi di acido grasso contenuto e la composizione in microalghe

A method to determine the content and composition of total fatty acids present in microalgae is described. Fatty acids are a major constituent of ...

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Research

JoVE Journal

Environment

59.4K Views.  Wageningen University and Research Center.  Procedimento per la determinazione del contenuto di acidi grassi e la composizione in microalghe basato su rottura meccanica delle cellule, estrazione dei lipidi solvente, transesterificazione, e quantificazione e identificazione di acidi grassi mediante gascromatografia è descritto. Uno standard interno tripentadecanoin viene utilizzato per compensare le eventuali perdite durante l'estrazione e transesterificazione incompleta. 

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Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently than plants3, but also synthesize advanced biofuels2-4. Generally, atmospheric CO2 is not a sufficient source for supporting maximal algal growth5. On the other hand, the high concentrations of CO2 in industrial exhaust gases have adverse effects on algal physiology. Consequently, both cultivation conditions (such as nutrients and light) and the control of the flue gas flow into the photo-bioreactors are important to develop an efficient &ldquo;flue gas to algae&rdquo; system. Researchers have proposed different photobioreactor configurations4,6 and cultivation strategies7,8 with flue gas. Here, we present a protocol that demonstrates how to use models to predict the microalgal growth in response to flue gas settings. We perform both experimental illustration and model simulations to determine the favorable conditions for algal growth with flue gas. We develop a Monod-based model coupled with mass transfer and light intensity equations to simulate the microalgal growth in a homogenous photo-bioreactor. The model simulation compares algal growth and flue gas consumptions under different flue-gas settings. The model illustrates: 1) how algal growth is influenced by different volumetric mass transfer coefficients of CO2; 2) how we can find optimal CO2 concentration for algal growth via the dynamic optimization approach (DOA); 3) how we can design a rectangular on-off flue gas pulse to promote algal biomass growth and to reduce the usage of flue gas. On the experimental side, we present a protocol for growing Chlorella under the flue gas (generated by natural gas combustion). The experimental results qualitatively validate the model predictions that the high frequency flue gas pulses can significantly improve algal cultivation.

Flue gas from power plants is a cheap CO2 source for algal growth. We have built prototype &#34;flue gas to algal cultivation&#34; systems and described how to scale up the algal cultivation process. We have demonstrated the use of a mass-transfer bio-reaction model to simulate and to design the optimal operation of flue gas for the growth of Chlorella sp. in algal photo-bioreactors.

Ottimizzare le impostazioni dei gas di scarico per promuovere la crescita di microalghe in fotobioreattori tramite simulazioni al computer

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

Ricerca

Ambiente

Quantification of Heavy Metals and Other Inorganic Contaminants on the Productivity of Microalgae

Increasing demand for renewable fuels has researchers investigating the feasibility of alternative feedstocks, such as microalgae. Inherent advantages include high potential yield, use of non-arable land and integration with waste streams. The nutrient requirements of a large-scale microalgae production system will require the coupling of cultivation systems with industrial waste resources, such as carbon dioxide from flue gas and nutrients from wastewater. Inorganic contaminants present in these wastes can potentially lead to bioaccumulation in microalgal biomass negatively impact productivity and limiting end use. This study focuses on the experimental evaluation of the impact and the fate of 14 inorganic contaminants (As, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V and Zn) on Nannochloropsis salina growth. Microalgae were cultivated in photobioreactors illuminated at 984 &#181;mol m-2 sec-1 and maintained at pH 7 in a growth media polluted with inorganic contaminants at levels expected based on the composition found in commercial coal flue gas systems. Contaminants present in the biomass and the medium at the end of a 7 day growth period were analytically quantified through cold vapor atomic absorption spectrometry for Hg and through inductively coupled plasma mass spectrometry for As, Cd, Co, Cr, Cu, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V and Zn. Results show N. salina is a sensitive strain to the multi-metal environment with a statistical decrease in biomass yieldwith the introduction of these contaminants. The techniques presented here are adequate for quantifying algal growth and determining the fate of inorganic contaminants.

Integration of microalgal cultivation with industrial flue gas will ultimately introduce heavy metals and other inorganic compounds into the growth media. This study presents a procedure used to determine the end fate and impact of heavy metals and inorganic contaminants on the growth of Nannochloropsis salina grown in photobioreactors.

Quantificazione dei metalli pesanti e altri contaminanti inorganici sulla produttività delle microalghe

Increasing demand for renewable fuels has researchers investigating the feasibility of alternative feedstocks, such as microalgae. Inherent advantages ...

Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content

Outdoor aerosol research commonly uses particulate matter sampled on filters. This procedure enables various characterizations of the collected particles to be performed in parallel. The purpose of the method presented here is to obtain a highly accurate and reliable analysis of the endotoxin and DNA content of bio-aerosols extracted from filters. The extraction of high molecular weight organic molecules, such as lipopolysaccharides, from sampled filters involves shaking the sample in a pyrogen-free water-based medium. The subsequent analysis is based on an enzymatic reaction that can be detected using a turbidimetric measurement. As a result of the high organic content on the sampled filters, the extraction of DNA from the samples is performed using a commercial DNA extraction kit that was originally designed for soils and modified to improve the DNA yield. The detection and quantification of specific microbial species using quantitative polymerase chain reaction (q-PCR) analysis are described and compared with other available methods.

Two complementary analyses of atmospheric biological particles from air sampled filters are described herein: the extraction and detection of endotoxin, and of DNA.

Filtro Analisi aria-campionato per endotossine e contenuto di DNA

Outdoor aerosol research commonly uses particulate matter sampled on filters. This procedure enables various characterizations of the collected particles ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about the overall structure of terrestrial microbial communities. PLFA profiling has been extensively used in a range of ecosystems as a biological index of overall soil quality, and as a quantitative indicator of soil response to land management and other environmental stressors.
The standard method presented here outlines four key steps: 1. lipid extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, 2. fractionation using solid phase extraction columns to isolate phospholipids from other extracted lipids, 3. methanolysis of phospholipids to produce fatty acid methyl esters (FAMEs), and 4. FAME analysis by capillary gas chromatography using a flame ionization detector (GC-FID). Two standards are used, including 1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC(19:0/19:0)) to assess the overall recovery of the extraction method, and methyl decanoate (MeC10:0) as an internal standard (ISTD) for the GC analysis.

Phospholipid fatty acids provide information about the structure of soil microbial communities. We present methods for extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, fractionation of extracted lipids using solid phase extraction columns, and methanolysis to produce fatty acid methyl esters, which are analyzed by capillary gas chromatography.

Estrazione e l&#39;analisi delle microbica fosfolipidi acidi grassi nei terreni

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Composition and Properties of Aquafaba: Water Recovered from Commercially Canned Chickpeas

Chickpea and other pulses are commonly sold as canned products packed in a thick solution or a brine. This solution has recently been shown to produce stable foams and emulsions, and can act as a thickener. Recently interest in this product has been enhanced through the internet where it is proposed that this solution, now called aquafaba by a growing community, can be used a replacement for egg and milk protein. As aquafaba is both new and being developed by an internet based community little is known of its composition or properties. Aquafaba was recovered from 10 commercial canned chickpea products and correlations among aquafaba composition, density, viscosity and foaming properties were investigated. Proton NMR was used to characterize aquafaba composition before and after ultrafiltration through membranes with different molecular weight cut offs (MWCOs of 3, 10, or 50 kDa). A protocol for electrophoresis, and peptide mass fingerprinting is also presented. Those methods provided valuable information regarding components responsible for aquafaba functional properties. This information will allow the development of practices to produce standard commercial aquafaba products and may help consumers select products of superior or consistent utility.

Aquafaba is a viscous juice from canned chickpea that, when stirred vigorously, produces a relatively stable white froth or foam. The primary research goal is to identify the components of aquafaba that contribute viscosifying/thickening properties using nuclear magnetic resonance (NMR), ultrafiltration, electrophoresis, and peptide mass fingerprinting.

Composizione e proprietà dei Aquafaba: acqua recuperata da ceci commercialmente in scatola

Chickpea and other pulses are commonly sold as canned products packed in a thick solution or a brine. This solution has recently been shown to produce ...

The Calibration and Use of Capacitance Sensors to Monitor Stem Water Content in Trees

Water transport and storage through the soil-plant-atmosphere continuum is critical to the terrestrial water cycle, and has become a major research focus area. Biomass capacitance plays an integral role in the avoidance of hydraulic impairment to transpiration. However, high temporal resolution measurements of dynamic changes in the hydraulic capacitance of large trees are rare. Here, we present procedures for the calibration and use of capacitance sensors, typically used to monitor soil water content, to measure the volumetric water content in trees in the field. Frequency domain reflectometry-style observations are sensitive to the density of the media being studied. Therefore, it is necessary to perform species-specific calibrations to convert from the sensor-reported values of dielectric permittivity to volumetric water content. Calibration is performed on a harvested branch or stem cut into segments that are dried or re-hydrated to produce a full range of water contents used to generate a best-fit regression with sensor observations. Sensors are inserted into calibration segments or installed in trees after pre-drilling holes to a tolerance fit using a fabricated template to ensure proper drill alignment. Special care is taken to ensure that sensor tines make good contact with the surrounding media, while allowing them to be inserted without excessive force. Volumetric water content dynamics observed via the presented methodology align with sap flow measurements recorded using thermal dissipation techniques and environmental forcing data. Biomass water content data can be used to observe the onset of water stress, drought response and recovery, and has the potential to be applied to the calibration and evaluation of new plant-level hydrodynamics models, as well as to the partitioning of remotely sensed moisture products into above- and belowground components.

The hydraulic capacitance of biomass is a key component of the vegetation water budget, which serves as a buffer against short and long-term drought stresses. Here, we present a protocol for the calibration and use of soil moisture capacitance sensors to monitor water content in the stems of large trees.

La calibrazione e l'uso di capacitanza sensori per monitorare il contenuto di acqua di staminali in alberi

Water transport and storage through the soil-plant-atmosphere continuum is critical to the terrestrial water cycle, and has become a major research focus ...

Combining Eye-tracking Data with an Analysis of Video Content from Free-viewing a Video of a Walk in an Urban Park Environment

As individuals increasingly live in cities, methods to study their everyday movements and the data that can be collected becomes important and valuable. Eye-tracking informatics are known to connect to a range of feelings, health conditions, mental states and actions. But because vision is the result of constant eye-movements, teasing out what is important from what is noise is complex and data intensive. Furthermore, a significant challenge is controlling for what people look at compared to what is presented to them.
The following presents a methodology for combining and analyzing eye-tracking on a video of a natural and complex scene with a machine learning technique for analyzing the content of the video. In the protocol we focus on analyzing data from filmed videos, how a video can be best used to record participants&#39; eye-tracking data, and importantly how the content of the video can be analyzed and combined with the eye-tracking data. We present a brief summary of the results and a discussion of the potential of the method for further studies in complex environments.

The objective of the protocol is to detail how to collect video data for use in the laboratory; how to record eye-tracking data of participants looking at the data and how to efficiently analyze the content of the videos that they were looking at using a machine learning technique.

Combinare i dati di tracciamento degli occhi con un'analisi dei contenuti video da Free-visualizzazione di un video di una passeggiata in un ambiente parco urbano

As individuals increasingly live in cities, methods to study their everyday movements and the data that can be collected becomes important and valuable. ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, we described a protocol for multiple analyses of the biological compositions in environmental PM. Five experiments are presented: (1) PM number monitoring by using a laser particle counter; (2) PM collection by using a cyclonic aerosol sampler; (3) PM collection by using a high-volume air sampler with filters; (4) culturable microbes collection by the Andersen six-stage sampler; and (5) detection of biological composition of environmental PM by bacterial 16SrDNA and fungal ITS region sequencing. We selected hazy days and a livestock farm as two typical examples of the application in this protocol. In this study, these two sampling methods, cyclonic aerosol sampler and filter sampler, showed different sampling efficiency. The cyclonic aerosol sampler performed much better in terms of collecting bacteria, while these two methods showed the same efficiency in collecting fungi. Filter samplers can work under low temperature conditions while cyclonic aerosol samplers have a sampling limitation for temperature. A solid impacting sampler, such as an Andersen six-stage sampler, can be used to sample bioaerosols directly into the culture medium, which increases the survival rate of culturable microorganisms. However, this method mainly relies on culture while more than 99% of microbes cannot be cultured. DNA extracted from the culturable bacteria collected by the Andersen six-stage sampler and samples collected by cyclonic aerosol sampler and filter sampler were detected by bacterial 16S rDNA and fungal ITS region sequencing.All the methods above may have wide application in many fields of study, such as environmental monitoring and airborne pathogen detection. From these results, we can conclude that these methods can be used under different conditions and may help other researchers further explore the health impacts of environmental bioaerosols.

Understanding the biological composition of environmental particulate matter is important for the study of its significant impacts on human health and disease spread. Here, we used three types of bioaerosol sampling methods and a biological analysis of airborne microbes to better explore airborne microbial communities under different environmental conditions.

Composizione e analisi della distribuzione di Bioaerosols in diverse condizioni ambientali

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the treatment of wastes. As most new research efforts begin at laboratory scale, there is a need for cost-effective methods for culturing microalgae in a reproducible manner. Here, we communicate an effective approach to culture microalgae in laboratory-scale photobioreactors, and to measure the growth and neutral lipid content of that algae. Instructions are also included on how to set up the photobioreactor system. Although the example organisms are species of Chlorella and Auxenochlorella, this system can be adapted to cultivate a wide range of microalgae, including co-cultures of algae with non-algae species. Stock cultures are first grown in bottles to produce inoculum for the photobioreactor system. Algae inoculum is concentrated and transferred to photobioreactors for cultivation in batch mode. Samples are collected daily for the optical density readings. At the end of the batch culture, cells are harvested by centrifuge, washed, and freeze dried to obtain a final dry weight concentration. The final dry weight concentration is used to create a correlation between the optical density and the dry weight concentration. A modified Folch method is subsequently used to extract total lipids from the freeze-dried biomass and the extract is assayed for its neutral lipid content using a microplate assay. This assay has been published previously but protocol steps were included here to highlight critical steps in the procedure where errors frequently occur. The bioreactor system described here fills a niche between simple flask cultivation and fully-controlled commercial bioreactors. Even with only 3-4 biological replicates per treatment, our approach to culturing algae leads to tight standard deviations in the growth and lipid assays.

Here, we present a protocol to construct lab-scale bubble column photobioreactors and use them to culture microalgae. It also provides a method for the determination of the culture growth rate and neutral lipid content.

Coltivazione di microalghe verdi in bolla colonna fotobioreattori e un saggio di lipidi neutri

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...

Manufacturing Simple and Inexpensive Soil Surface Temperature and Gravimetric Water Content Sensors

Quantifying temperature and moisture at the soil surface is essential for understanding how soil surface biota respond to changes in the environment. However, at the soil surface these variables are highly dynamic and standard sensors do not explicitly measure temperature or moisture in the upper few millimeters of the soil profile. This paper describes methods for manufacturing simple, inexpensive sensors that simultaneously measure the temperature and moisture of the upper 5 mm of the soil surface. In addition to sensor construction, steps for quality control, as well as for calibration for various substrates, are explained. The sensors incorporate a Type E thermocouple to measure temperature and assess soil moisture by measuring the resistance between two gold-plated metal probes at the end of the sensor at a depth of 5 mm. The methods presented here can be altered to customize probes for different depths or substrates. These sensors have been effective in a variety of environments and have endured months of heavy rains in tropical forests as well as intense solar radiation in deserts of the southwestern U.S. Results demonstrate the effectiveness of these sensors for evaluating warming, drying, and freezing of the soil surface in a global change experiment.

Accurately measuring temperature and water content of the upper 5 mm of the soil surface can improve our understanding of environmental controls on biological, chemical, and physical processes. Here we describe a protocol for manufacturing, calibrating, and conducting measurements with soil surface temperature and moisture sensors.

Produzione di sensori di temperatura del suolo e contenuto idrico semplice e poco costoso

Quantifying temperature and moisture at the soil surface is essential for understanding how soil surface biota respond to changes in the environment. ...