Os autores gostariam de agradecer Alexei Bogdanov para a fabricação de patch-clamp fichas no CPFC, e Tran Hue, Ping Zhao e Mateus Shiu para obter ajuda com a montagem. Naweed Syed foi apoiada por um Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde (CIHR) subvenção. Collin Lucas é o destinatário da NSERC e Patrimônio Alberta Fundação de Pesquisa Médica (AHFMR) bolseiros.

1. Fabricação de chips O processo descrito em 6 resultados de uma 3 micrómetros película auto-pé de espessura, uma baixa resistência de 1 acesso Mohm e uma superfície lisa de abertura em forma de funil, que facilita uma vedação íntimo com a célula 9, ver Figura 2. As aparas são singulated e coladas em pacotes de Plexiglas com a abertura virada um furo de ligação do chip para um canal subterrâneo. A colagem é dispensado de uma maneira que minimiza a capacitância de derivação para um pF 17 nominal. Os pacotes são equipados com duas mm de diâmetro e 1,5 mm 6 tubos de vidro longas como portas fluídicos (Figura 3). <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" /> Figura 2. Micrografia eletrônica de varredura de uma secção de feixe de íons focalizados de um chip de patch-clamp NRCC mostra uma superfície lisa dióxido de silício e forma de funil, que favorece os contatos íntimos de células, e um orifício superficial que representa uma resistanc baixo acessoe. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" /> Figura 3. Um chip é colada no fundo do frasco de cultura em um pacote de Plexiglas equipado com fluidos subterrâneos e tubos de vidro. 2. Priming, esterilização e testes Os seguintes passos devem ser realizados em um gabinete de segurança de biologia para evitar a contaminação ou obstrução da abertura. <ul type="disc"><li> Esterilizar fichas em um líquido de limpeza Harrick plasma de base (www.harrickplasma.com) com uma pressão de ar 0,1-0,3 mbar residual durante 15 min à potência máxima de 18 W. Outros sistemas de ar de plasma pode ser utilizado, com a densidade de potência comparável (24 mW / cm 3) e mantendo o produto da densidade de potência e constante de tempo. O tratamento com plasma também torna os chips hidrofílico, o que facilita a escorva. </li><li> Coloque os tubos de vidro com tubos de silicone Silastic Laboratório estéril, 1mm x 2mm ID OD (Cole ParmerCat. # 96115-08), 3inch de um lado, uma polegada do outro lado. </li><li> Encha fluídica através dos tubos com esterilizada por filtração da solução tampão de padrão de fosfato (PBS), certificando-se nenhuma bolha é aprisionado. </li><li> Clip do tubo de silicone longo tempo de pressurizar o PBS a partir do lado curto, a 1 atm. Um conjunto de PBS que escoa através da abertura pode ser visível no frasco. Prenda o fornecimento pressurizado do PBS e retire o tubo de silicone curta distância que a oferta. </li><li> Encha frasco com filtrada PBS utilizando uma seringa. </li><li> Imergir um Ag / Ag: Cl eléctrodo no tubo curto e um contra-eléctrodo no frasco. Um medidor de impedância é utilizada para confirmar que a resistência de acesso é entre 300kohm e 3Mohm ea capacitância shunt é entre 10pF e 25pF. Um chip com menor resistência é provável que tenha um vazamento, e uma maior capacitância é considerado impróprio para uso, pois não pode capturar mais rápido dinâmica de eletrofisiologia da célula 6. Um chip com menor capacidadeou maior resistência é considerado conectado, embora pudesse ser simplesmente que uma bolha está preso no orifício. Alguns chips são testados novamente depois de 1H e encontrado para ter a impedância eletroquímica correta. </li><li> Lavar o canal fluídica com água desionizada estéril; esvaziar o frasco de topo e lavar com o mesmo, duas vezes. </li><li> Mergulha-se o chip de embalado, com tubos em água estéril fresco desionizada durante 30 min, em seguida, carregar com outros chips em um recipiente estéril cheio com água desionizada estéril. Isto assegura que os chips permanecem hidrófilo e protegido de contaminação. </li></ul> 3. Fichas de preparação em laboratório de biologia celular As seguintes etapas são realizadas em uma capela de fluxo laminar filtrado HEPA usando técnicas assépticas, todas as soluções utilizadas neste procedimento deve ser filtrada esterilizados antes da utilização usando um filtro de 0.22μm. <ul type="disc"><li> Abra um recipiente de chips sob uma capela de fluxo laminar filtrado HEPA e retirar as fichas de ContaINER face para baixo para evitar escavar possíveis contaminantes flutuantes em frasco superior. </li><li> Lavar parte superior do frasco de 2x chip com filtrada água estéril desionizada para remover todos os detritos residual a partir da superfície do chip. </li><li> Aspirar água desionizada estéril fora do frasco de topo. </li><li> Ligue uma extremidade do tubo de silastic ligado ao canal de fluídica a uma seringa pressurizada contendo água filtrada estéril desionizada. No nosso sistema, seringas preenchidas com solução são pressurizados por ligação a um reservatório de ar comprimido definido para 20psi. Para garantir a esterilidade, o ar é filtrado (filtro de 0,22 um) antes da entrada para a seringa e nosso sistema também tem uma válvula de ligar / desligar que nos permite parar ou aplicar pressão quando necessário. </li><li> Usando um hemostato, fixar a extremidade de saída da tubagem. </li><li> Abra o de ligar / desligar as válvulas para pressurizar a solução. </li><li> Para enxaguar o fluídica subterranen do chip com água estéril fresco desionizada, unclamp a extremidade de saída da tubagem. </li><li> Para parace a água para cima através da abertura, fixar a extremidade de saída da tubagem com um hemostato. </li><li> Para evitar a drenagem da água, prenda as extremidades de entrada e saída da tubulação com uma hemostats e fechar a on / off válvulas. </li><li> Separar a extremidade de entrada da tubagem a partir da seringa. </li><li> Inserir tampões de vidro em ambas as extremidades do tubo e remover os hemostats. </li><li> Preencha frasco topo com água deionizada steriled filtro. </li><li> Colocar a tampa de um prato 35 milímetros esterilizada na base de um prato 100 milímetros estéril </li><li> Chip de lugar na parte superior da tampa 35 mm, e com tampa 100 tampa prato mm. </li><li> Fichas de imagem para garantir que a membrana ea abertura das fichas são livres de detritos e / ou bolhas de ar. No nosso laboratório usamos um microscópio vertical e uma 20x objectivo de longa distância de trabalho. </li><li> Se detritos e / ou bolhas de ar, lavar repetidamente canal fluídico e frasco superior. Se os detritos e / ou bolhas de ar não pode ser removido, o chip é descartado. </li><li> Uma vez que os chips sãodigitalizado, retornar à câmara de fluxo laminar e desligue ambas as extremidades do tubo. </li><li> Anexar uma extremidade do tubo a uma seringa pressurizada contendo meios fisiológicos. </li><li> Prender a extremidade de saída da tubagem com um hemostato </li><li> Abrir a válvula de pressão, remover o hemostato a partir da extremidade de saída dos fluidos e lave o canal fluídica com meios fisiológicos </li><li> Para enxaguar o fluídica subterrâneo com meios fisiológicos, abrir a de ligar / desligar as válvulas e remover o hemostato a partir da extremidade de saída da tubagem. </li><li> Para forçar os meios fisiológicos para cima através da abertura, fixar a extremidade de saída da tubagem com um hemostato. </li><li> Prenda no lado de entrada da tubulação com uma pinça hemostática e fechar a on / off válvulas. </li><li> Remover a extremidade de entrada do tubo da seringa e ficha ambas as extremidades do tubo por meio de tampões Glas. </li><li> Remova os hemostats. </li><li> Remover a água do frasco de topo. </li><li> Encher o frasco de topo com filtros de esterilizados meios fisiológicos. </li><li>Coloque novamente o chip no prato 100 milímetros Petri. </li><li> Coloque a base de um prato 35 milímetros para o prato 100 mm e enchê-lo com água esterilizada por filtro desionizada para enriquecer humidade. </li><li> Cubra o prato até o momento para revestimento </li></ul> 4. Revestimento celular dos neurônios caracol Os chips de patch-clamp pode ser adequado para uma variedade de preparações. Estamos atualmente testando as nossas fichas com mamíferos primárias de neurônios corticais e que tenham obtido resultados preliminares com células cultivadas por 14 dias 7, o que indica que nosso protocolo de esterilização é adequada e que os chips não são citotóxicos em culturas a longo prazo. Para efeitos do presente protocolo, os neurônios de moluscos foram escolhidos porque representam um modelo simples, mas bem estabelecido para estudar a eletrofisiologia neuronal 11, e é com essas células que obtivemos os resultados mais significativos para a data de 10. Isolamento das células e procedimentos detalhados cultura têmforam descritas anteriormente 12, 13. <ul type="disc"><li> Remova a casca exterior 2-3 stagnalis meses Lymnaea velho com uma pinça sem corte e animais anestesiam em Lymnaea salina contendo Listerine 10%. Todos os passos subsequentes realizada assepticamente dentro de uma capa fluxo de ar laminar com equipamento de dissecção estéril e soluções à temperatura ambiente. </li><li> Substituir mídia fisiológicas nas fluídica com a solução de gravação apropriado usando uma pipeta Eppendorf. No caso de neurónios Lymnaea a solução contém (em mM): 50 KCl, 5 MgCl2, 5 etilenobis (oxietilenonitrilo) de ácido tetraacético (EGTA) e 5 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfónico (HEPES, pH 7,4 ; 130 mOsm) 14 </li><li> Pino os caracóis em um prato Sylgard preenchido com solução salina e Lymnaea remover cérebro inteiro, como descrito anteriormente 13 </li><li> Trate o isolacérebros ed em meio definido (MS) de enzima tripsina (solução a 0,2%, Sigma, catálogo # T-9201) durante 18 minutos, seguido por tratamento em DM e inibidor de tripsina (Sigma, soja, Catalog # T-9003) durante 15 minutos. </li><li> Fixar os cérebros em um prato Sylgard pequeno enchido com alta osmolaridade definido mídia (HODM - DM com glicose adicionado; 750 uL de solução de glicose 1M a 20 mL de MS). </li><li> Usando fórceps finos e tesouras de dissecação, remover o invólucro exterior e interior dos gânglios de interesse, expondo os neurónios. </li><li> Usando uma pipeta de vidro polido fogo preenchido com HODM e ligada a uma microsseringa, aplicar sucção suave perto da célula de interesse (dorsal pedal esquerdo 1) até que o neurónio destaca a partir do cérebro e é suspenso na pipeta. </li><li> A pipeta de vidro é então movido e mergulhado neurochips individuais quando o afastamento suave a partir do micro-permite que os neurónios a ser suavemente empurrada para fora da pipeta e colocado no topo dos furos de patch individuais sobre as fichas.</li><li> Permitir que as células se sentar sem ser perturbado por um mínimo de 2 horas à temperatura ambiente para promover a sua fixação à superfície do chip em torno da abertura. </li></ul> 5. Gravações eletrofisiológicas Para ligar as fichas para o amplificador (no nosso caso de um amplificador Multiclamp 700B, Molecular Devices, Foster City, CA, EUA) <ul type="disc"><li> Substituir a solução no fluídica subterrânea e no frasco de chip com as soluções de gravação adequado. No caso de neurónios Lymnaea, as câmaras de cultura superiores são preenchidos com Lymnaea salina (em mM: NaCl 51,3, 1,7 KCl, 4 CaCl2, e 1,5 MgCl2) tamponado a pH 7,9 com HEPES 14. </li><li> Para a estabilidade, chip cola o numa lâmina de vidro e colocá-lo sob um microscópio. </li><li> Para ligar o chip para o amplificador (no nosso caso de um amplificador Multiclamp 700B, Molecular Devices, Foster City, CA, EUA), cortar uma das extremidades do tubo e inserir uma Silver fio que está ligado à cabeça fase. </li><li> Coloque o eléctrodo de referência no frasco parte superior do chip. </li><li> O chip está agora pronto para a gravação. </li><li> Aplicar um passo mV 5 com o amplificador para medir a resistência total (R t) e determinar a configuração dos neurónios: célula-inscritos (R t&gt; 1 GΩ); célula inteira (Rt = 50-100 transientes mohms mais capacitivo, indicativa de ruptura da membrana sobre a abertura); ou nenhuma vedação (R t &lt;5 mohms). No nosso último conjunto de experiências 10, 58 por cento% das células teve alta resistência selos e, destes, 80% das células mostraram respostas excitáveis. </li></ul> 6. Os resultados representativos <ul type="disc"><li> Aplicar despolarizante impulsos de corrente (20 incremento pA) para o neurónio (neste caso LPeD1). </li><li> Segure o neurônio em Vm próximo do seu potencial de repouso (~ - 60 mV). </li><li> Observe as respostas a estes pulsos despolarizantes. Potenciais de ação ultrapassagem deveser observado se o neurônio é viável. </li><li> A Figura 4 mostra um resultado representativo, que é discutida em detalhe em 14, 15. </li></ul><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig4.jpg" /> Figura 4. Respostas Tensão (superior) de um neurônio LPeD1 a série graduada de intracelulares pulsos de corrente (abaixo). Os impulsos de corrente foram aplicados em Vm = - 60mV. Solução de problemas <ul type="disc"><li> Antes do plaqueamento, os chips de imagem para determinar se membrana ea abertura são livres de detritos e adequado para o plaqueamento. Nós usamos um microscópio vertical e um 20x objetivo de longa distância de trabalho. Em nosso último conjunto de experimentos 1, 67% por cento dos chips foram preparadas com sucesso dessa forma. </li><li> Se detritos e / ou bolhas de ar estão presentes descartar chip e tentar outro. </li><li> Diversos tratamentos de superfície (plasma) ou revestimento (PDL, PEI, etc) pode ser tentado, mas o sucesso pode ser altamente dependente tipo de célulausado. </li><li> A composição da solução de fluídica (&quot;pipeta&quot;) em crítica para a formação do giga-seal e toda a célula. Ajuste a solução, prestando atenção ao pH da osmolaridade, e maquiagem iônica. </li><li> Para a cultura de longo prazo, começar com a mídia em canais microfluídicos, em seguida, mudar para pipetar solução antes da gravação através de suave perfusão gravidade alimentado (~ 0,5 ml / min). </li></ul>

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Não há conflitos de interesse declarados.

Patch-clamp NRCC da plataforma interrogatório chip é uma ferramenta potencialmente poderosa para os testes de conteúdo de informação de alta farmacêuticas e investigar modelos in vitro de doença. As suas vantagens em comparação com pipetas de vidro são uma resistência de acesso de baixo, que é uma vantagem para sondar células grandes, e apesar de uma capacitância um pouco maior irá resultar em dinâmica comparáveis ​​para as células mais pequenas. Célula espontânea para selos de abertura foram rotineiramente obtidos, e entrada de célula inteira foi observado para ser 14 espontânea. Uma clara diferença entre chips e pelo método da pipeta de vidro é o facto de que a sonda é parte do prato de cultura de células e não é manualmente posto em contacto com a membrana celular. Cultura de células, possivelmente parte de redes funcionais, resulta em modelos mais biologicamente relevantes, como modelos de doenças, e um mecanismo diferente para garantir alta de células para sondar selos 16. No entanto, em contraste com as suspensões de células, a aspiração cannot ser usado para posicionar uma célula na sonda. Neurónios Snail, como outras células grandes, são passíveis de posicionamento manual na parte superior da sonda. Para as células mais pequenas que requerem tempos mais longos de cultura, temos obviado a necessidade de qualquer manipulação e manter uma alta probabilidade de obtenção de uma vedação por polipéptidos de adesão de modelação em cima das sondas para colocar as células em cima das sondas, e demonstraram a colocação de células na sonda 17,18. NRCC também está a desenvolver um chip de poliimida de patch-clamp microfluídico 19 com uma capacitância comparável ao do vidro pipeta. O objetivo final desse projeto é um múltiplo de sondas chip de patch-clamp que permite o monitoramento simultâneo da atividade eletrofisiológica dos neurônios envolvidos em várias comportamento da rede para a resolução dos canais iônicos individuais 14. Este método é um método de resolução alta complementar para matrizes de multi-eléctrodo 20.

culturing and electrophysiology of cells on nrcc patch-clamp chips

Devido à sua extraordinária sensibilidade ea capacidade de monitorar e controlar células individuais a nível dos canais iônicos, patch de aperto é o padrão ouro de eletrofisiologia aplicada a modelos de doenças e telas farmacêuticas tanto 1. O método envolve, tradicionalmente, suavemente contactando uma célula com uma pipeta de vidro cheio de uma solução fisiológica a fim de isolar um pedaço de membrana sob o seu ápice 2. Um eléctrodo inserido na pipeta captura do canal de íon actividade dentro do remendo de membrana ou, quando há ruptura, por toda a célula. Na última década, de patch-clamp fichas têm sido propostos como uma alternativa 3, 4: uma película suspensa separa o meio fisiológico a partir do meio de cultura, e uma abertura microfabricados no filme substitui o vértice da pipeta. Patch-clamp fichas foram integrados em sistemas automatizados e comercializado para high-throughput screening 5. Para incrfacilidade de transferência, que incluem a entrega fluídica de células de suspensão, o seu posicionamento sobre a abertura por sucção, e rotinas de automatizados para detectar células de sonda-selos e entra em modo de célula inteira. Nós relatamos na fabricação de um chip de silício de patch-clamp com impedância otimizada e forma do orifício que permite a gravação de alta qualidade de potenciais de ação em neurônios cultivados caracol 6; recentemente, temos também relataram progressos no sentido de interrogar os neurônios de mamíferos 7. Os nossos de patch-clamp fichas são fabricados no Canadian Photonics Fabrication Centro 8, uma fundição comercial, e estão disponíveis em grandes séries. Estamos ansiosos para participar de colaborações com eletrofisiologistas para validar o uso da tecnologia NRCC em diferentes modelos. As fichas são utilizados de acordo com o esquema geral representado na Figura 1: o chip de silício está na parte inferior de um frasco de cultura Plexiglas e parte de trás da abertura é ligado a um Chann subterrâneael equipado com tubos em cada extremidade da embalagem. As células são cultivadas no frasco ea célula na parte superior da sonda é monitorizada por um eléctrodo de medição inserido no duas channel.The fora dos portos fluídicos facilitar a troca de solução com perturbação mínima para a célula, o que é uma vantagem em comparação com pipetas de vidro para intracelular perfusão. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" /> Figura 1. Princípio de medição usando o chip de patch-clamp NRCC Nós detalhe aqui os protocolos para esterilizar e escorvar os chips, carregá-los com placa de suporte, os com células e, finalmente, utilizá-los para gravações electrofisiológicos.

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Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Nós mostramos como planar de patch-clamp fichas fabricado no National Research Council of Canada são esterilizados, preparado, carregado com médio, revestida com as células, e usado para gravações eletrofisiológicas.

Cultura e Eletrofisiologia de células em NRCC patch-clamp-Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

culturing-and-electrophysiology-of-cells-on-nrcc-patch-clamp-chips

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.6K visualizações.  National Research Council of Canada. Nós mostramos como planar de patch-clamp fichas fabricado no National Research Council of Canada são esterilizados, preparado, carregado com médio, revestida com as células, e usado para gravações eletrofisiológicas.

Vídeo: Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

Gravações patch clamp em células ciliadas da orelha interna Isolado de Zebrafish

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Neurociência

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

Todo patch clamp celular para investigar os mecanismos de estimulação neural Infrared

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Isolamento de neurônios sensoriais de<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Para Remendo Recordings Grampo de Correntes glutamatérgicos

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

Grampo patch Gravações de Embryonic Cells Zebrafish Mauthner

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most well-established method for recording electrical activity from individual neurons or their subcellular compartments. Nevertheless, achieving stable recordings, even from individual cells, remains a time-consuming procedure of considerable complexity. Automation of many steps in conjunction with efficient information display can greatly assist experimentalists in performing a larger number of recordings with greater reliability and in less time. In order to achieve large-scale recordings we concluded the most efficient approach is not to fully automatize the process but to simplify the experimental steps and reduce the chances of human error while efficiently incorporating the experimenter's experience and visual feedback. With these goals in mind we developed a computer-assisted system which centralizes all the controls necessary for a multi-electrode patch-clamp experiment in a single interface, a commercially available wireless gamepad, while displaying experiment related information and guidance cues on the computer screen. Here we describe the different components of the system which allowed us to reduce the time required for achieving the recording configuration and substantially increase the chances of successfully recording large numbers of neurons simultaneously.

Multi-electrode patch-clamp recordings constitute a complex task. Here we show how, by automating of many of the experimental steps, it is possible to accelerate the process leading to qualitative improvement in performance and number of recordings.

A Multi-eletrodo Sistema patch-clamp assistida por computador

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Whole-cell Recordings patch-clamp de Morphologically- e identificados Neuroquimicamente hipocampo Interneurônios

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Gravações de células inteiras de patch-clamp em Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subcelulares Gravações patch-clamp do domínio somatodendrítico da substância negra dopamina Neurônios

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic network, electrophysiological recordings are frequently used to study connections among individual neurons. We have optimized a flat-mount preparation for patch clamp recording of genetically marked neurons in both GCL (ganglion cell layer) and INL (inner nuclear layer) of mouse retinas. Recording INL neurons in flat-mounts is favored over slices because both vertical and lateral connections are preserved in the former configuration, allowing retinal circuits with large lateral components to be studied. We have used this procedure to compare responses of mirror-partnered neurons in retinas such as the cholinergic starburst amacrine cells (SACs).

This protocol demonstrates how to perform whole-cell patch clamp recording on retinal neurons from a flat-mount preparation.

Patch-clamp gravação de células Starburst Amácrinas em um monte de Luxo Preparação de Deafferentated mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.