Este protocolo é a porta de entrada para a matriz extracelular. É a complexidade e sua estrutura até a escala de sub-micron. Assim, a principal vantagem deste método é que ele possibilita a obtenção de uma matriz extracelular que mantenha sua integridade estrutural, abrindo assim o caminho para a análise bioquímica e anatômica.
Demonstrando o procedimento serão, Alejandro Mayorca Gilani, Raphael Reuten e Maria Rafaeva, atualmente em meu laboratório e Chris Madsen e que estava em meu laboratório e continuou o trabalho na Universidade de Lund. Comece raspando o tórax, abdômen e parte de trás do rato eutanizado com um cortador de cabelo. Desinfetar a área com 70% de etanol.
Em seguida, fixe o mouse em uma bandeja de poliestireno, estendendo seus quatro membros traseiros finais, bem como sua cabeça e cauda. Coloque-o sob o microscópio de microcirurgia. Usando uma tesoura de padrão reto mayo, faça uma incisão cutânea que vai da região sub mandibular até o abdômen inferior e disseque subcutânea para expor a parede torácica e o peritônio.
Em seguida, use uma tesoura microcirúrgica para cortar os músculos peitoralis maiores e peitoral ao longo do sexto espaço intercostal em ambos os lados da parede torácica. Corte o esterno ao longo das incisões anteriores com uma tesoura de padrão reto. Em seguida, complete uma esternotomia cortando o esterno ao longo de seu longo eixo.
Elevar e fixar, ambos os lados da parede torácica para expor o complexo cardiopulmonar. Use micro fórceps redondos para extirpor o timo e o tecido adiposo circundante, retirando-os delicadamente de seus acessórios. E corte o esôfago com micro tesoura.
Separe as veias braquiocelicas e a artéria braquiocefálica com micro fórceps afiados. Em seguida, separe as artérias subcláusicas comuns e esquerdas esquerdas do tecido subjacente para facilitar a ligadura e a cauterização. Use um suporte de microagulha e micro fórceps afiados e uma sutura de nove oh para colocar pontos acima do surgimento do braquiocefálico esquerdo comum e artérias subclávias esquerdas, cauterizar as veias braquiocefálicas.
Usando micro tesoura, abra uma entrada seccionando o ligamento. Introduza um cateter de calibre 27 na traqueia e empurre delicadamente até que a traqueia se esvai nos brônquios, tomando cuidado para não interromper os brônquios. Usando uma sutura de seis O, coloque três pontos ao redor da traqueia para fixar o cateter.
Seção o rato na altura da 12ª vértebra torácica, a aorta descendente corre anteriormente para a coluna vertebral e deve ser seccionada aqui junto com a coluna vertebral. Cateterize retrógradamente a Aorta e empurre o cateterismo até atingir o arco aórtico. Usando uma sutura, coloque quatro pontos ao redor da Aorta, começando cinco milímetros abaixo da ponta do cateter.
Conecte o mouse a um sistema de bomba usando tubos de silicone e conectores inferiores. Perfum com água desionizada a 200 microliters por minuto durante 15 minutos. Em seguida, mude o agente de perfusão para 0,5% DOC, diluído em água deionizada e perfuuse durante a noite.
No dia seguinte, mude o agente de perfusão para 0,1%SDS diluído em água deionizada, e perfuuse por oito horas. Em seguida, perfuse com água deionizada por 24 horas para lavar o SDS e DOC. Ressectar o coração e pulmões descelularizados, seccionando seus anexos ao tórax.
Armazene o tecido em um tubo criogênico estéril em água deionizada com estreptomicina de penicilina de 1% e 0,3 azida de sódio micromolar a quatro graus Celsius. Para realizar a coloração imuno, bloqueie a amostra incubando-a em um tubo criogênico contendo 6% de soro de burro e 3% de BSA durante a noite. Em seguida, incubar com anticorpo primário em 3% de soro de burro na PBS por 24 horas.
Após a incubação lave a amostra cinco vezes em PBST durante uma hora por lavagem. Incubar a amostra com anticorpo secundário conjugado fluorescente em soro de burro de 3% em PBS por 24 horas. Em seguida, repita as lavagens em PBST.
Adicione a água ionizada e armazene a amostra a quatro graus Celsius longe da luz direta. Para imaginar a amostra, coloque-a em um prato de fundo de vidro e umidifice-a com duas gotículas de solução de armazenamento. Defina o objetivo e inspecione a amostra usando luz de fluorescência.
Mude para o controle do computador, ligue lasers e ajuste a intensidade do laser, abertura do pinhole, detectores de comprimento de onda, ganho, resolução e zoom. Defina o número e o tamanho do passo para a pilha Z e comece a aquisição. Extirbe um lobo pulmonar de um rato eutanizado e coloque-o em um molde criogeno de 10 por 10 por cinco milímetros.
Cubra-o com aproximadamente 500 milhas de microliters de composto OCT e congele-o em gelo seco. Mantenha a amostra a essa temperatura. Extirpo um lobo pulmonar descelularizado de um rato processado, coloque-o em um molde criogeno com a maior área de superfície para baixo e cubra-o com composto OCT.
Congele a amostra em gelo seco e mantenha-a a essa temperatura até que seja necessária. A amostra pode ser armazenada por pelo menos 12 semanas. Use um criostat para seção de blocos de tecido congelados em cinco seções de micrômetros a menos 20 graus Celsius.
E coloque as seções em lâminas de vidro adesivo. Transfira os slides para a temperatura ambiente até que o ar seque. Mergulhe brevemente os slides em PBS, seguido de 4% de paraformaldeído em PBS por 15 minutos.
Lave uma vez na PBS, depois duas vezes em água destilada por cinco minutos por lavagem. Mergulhe os slides na solução de hematoxilina de Myer por 10 minutos. Em seguida, lave os slides em um frasco de Copeland sob água destilada por 10 minutos e mergulhe na solução de eosina por sete minutos.
Mergulhe em xileno várias vezes. Aplique algumas gotas de meio de montagem DPX e coloque um deslizamento de tampa de vidro. Deixe os slides secarem durante a noite sob um capô químico e depois escaneie-os em um scanner de slides.
Depois de completar com sucesso o protocolo, o coração e os pulmões e o tecido NX estarão livres de células. A descelularização pode ser validada pela coloração de eosina hematoxilina dos andaimes ECM. Os andaimes retêm as dimensões de órgãos frescos e sua estrutura ECM insoável está intacta.
Os andaimes ECM apresentaram aumento da permeabilidade e penetrabilidade da luz. O uso deste protocolo com um estágio de microscópio motorizado permite imagens tridimensionais de azulejos de amostras de montagem inteiras em resolução de sub-micron. É essencial evitar o fluxo em direção aos órgãos de interesse para alcançar a completa descelurização uniforme.
A dissecação microcirúrgica e a ligadura dos vasos devem ser eficazes. E, ao mesmo tempo, respeite os tecidos alvo para manter a estrutura nativa do VCM. Após este procedimento, os andaimes serão enriquecidos para proteínas estruturais de ECM e podem ser usados para espectrometria de massa ou engenharia de tecidos.
Esta técnica abre caminho para o mapeamento de alta resolução da matriz extracelular.
