Os autores agradecem a Malinda Spry para assistência técnica. Agradecemos, ainda, fontes de financiamento atuais e do passado: o Instituto Nacional do Câncer (R01 CA131075, R01 CA131075-02S1), o Will Caso Cancer Research Fund Wendy, a Fundação Markey Câncer, da Criança Miracle Network ea Jennifer e David Dickens Foundation Melanoma Research.

1. Preparação de Forskolin para administração tópica de um extrato de raiz bruto da Usina Plectranthus barbatus (Cohleus forskohlii) <ol><li> Protocolos para experimentos murino seguiu as diretrizes para a conduta ética no cuidado e uso de animais e foram aprovados pelo Comitê Institucional Animal Care e Use na Universidade de Kentucky (Protocolo n 00768M2004). O extracto de raiz é composta de 40% peso / volume, em uma base dermatológica padrão de 70% de etanol, 30% de propileno glicol. </li><li> Pesar 200 g de extrato de raiz de forskolin bruto e transferi-lo para um copo. Para fazer 500 ml de uma solução a 40% (w / v), ressuspender 200 g de extracto de raiz de forscolina em bruto por adição de mais, mas não todo o volume do veículo (etanol a 70%, 30% de propileno glicol) e levar a solução a cerca de 450 ml. </li><li> Agita-se durante uma hora à temperatura ambiente. A solução será um pouco viscosa e pode necessitar de agitação manual para &quot;levantar&quot; o extracto em solução antesa barra de agitação é capaz de assumir. </li><li> Após uma hora de agitação, verter a mistura em um cilindro graduado e levar o volume a 500 ml usando veículo que tem sido usada para &quot;enxaguar&quot; a proveta que foi usada para agitar a suspensão (para maximizar a recuperação de forscolina a partir da proveta) . </li><li> Transferência da suspensão de 50 ml de tubos de centrífuga de polipropileno. Centrífuga (1.500 x g, a temperatura ambiente, 15 min), usando uma centrífuga de mesa. Neste ponto, o material insolúvel vai ser bastante compacta, permitindo-se o sobrenadante para ser facilmente vertido. </li><li> Filtrar a solução através de uma membrana de acetato de celulose de 0,22 um para remover qualquer material insolúvel residual a partir do extracto. Usamos um sistema para frascos concebido para a cultura de células, juntamente com a utilização de pré-filtros, que vêm com o aparelho, para evitar coagulação prematura da membrana a partir de componentes insolúveis do extracto de raiz. Ao fazer grandes volumes de extracto, filtrar a cerca de 100 ml de cada vez, a alteração da aposta pré-filtroween cada volume adicionado. </li><li> Quando armazenada à temperatura ambiente, o extracto mantém actividade biológica durante até um ano. </li></ol> 2. Preparação de C57Bl / 6 K14-Scf Ratos para tratamentos tópicos <ol><li> Retire a pele dorsal dos animais por corte elétrico. Resumidamente anestesiar os animais com isoflurano inalatório para facilitar corte de pele dorsal com tesouras elétricas equipadas com uma 0,25 milímetros cabeça de preparação cirúrgica (Fisher Scientific). De preferência, usar apenas um tipo de anestesia (por exemplo, cetamina / xilazina) para minimizar o risco de overdose de anestésico. A câmara de inalação saturado traz risco ocupacional quando usado fora de uma coifa e fornece quantidades desconhecidas de anestésico para animais. Idealmente, um vaporizador de precisão deve ser usado. </li><li> Para remover a palha residual cabelo, tratar os animais com um depilatório químico. Administrar anestesia para o animal com uma injecção ip de cetamina 40 mg / kg de xilazina e 4 mg / kg </li&gt; <li> Uma vez que os animais são devidamente anestesiados (a julgar pelo toe pitada), aplique uma quantidade dedo-sized de creme depilatório para a pele dorsal cortado usando um dedo de luva. Esfregue o creme na pele por 30-60 seg ou até que os cabelos podem ser claramente visto no creme como está sendo movimentados. Deixar o creme apenas para a quantidade de tempo mínima necessária para a remoção do cabelo como a exposição prolongada conduz a queima química da pele, desagregação epidérmica e morte causados ​​pela perda de integridade da epiderme. </li><li> Limpe a pele dorsal com compressas de gaze embebida em água repetidamente até que todos creme foi removido. Animais seque com toalhas de papel macio, e permitir-lhes recuperar em um local quente isolada (por exemplo, limpar gaiolas colocadas em uma almofada de aquecimento). Depilar os animais um a um e acompanhar de perto todo o procedimento. </li></ol> 3. A administração tópica de Forskolin ou controle do veículo <ol><li> Os animais devem ser tratados um de cada vez. Resumidamente anestesiar com inspiraçãod isoflurano, colocando o mouse em cima de um filtro permeável ao ar nylon equipados de forma sob a qual foi colocada uma toalha de papel saturado de isoflurano em uma jarra de vidro com tampa clara saturado de isoflurano em uma coifa. Exponha o mouse para isoflurano durante o tempo suficiente como para suprimir movimentos musculares voluntários, mas para preservar a respiração espontânea (tipicamente 10-20 seg.) Deixar o animal em isoflurano muito tempo irá resultar em supressão respiratória e morte. É melhor errar do lado da &quot;luz vai&quot; e ter de voltar a expor o mouse rapidamente para mais isoflurano, em vez de sobre-expor o animal à morte de drogas e risco. </li><li> Retire o animal da câmara de isoflurano e coloque em uma almofada banco absorvente limpo. </li><li> Usando uma micropipeta de 1000 ul equipado com uma ponta descartável de polipropileno, chamar-se 400 ul de 40% de extracto de forscolina em bruto (animais de controlo de veículo irá receber 70% de etanol, 30% de propileno glicol por si só). </li><li> Transferir o extracto sobre odorso do animal por gotejamento que sobre a pele e, em seguida, utilizando-se o lado da ponta da pipeta, manchar o extracto sobre a pele dorsal até que toda a pele tenha sido coberta. Não há necessidade de apagar a pele após a aplicação. </li><li> Retorne o mouse para sua jaula, e observar cuidadosamente até que ele se recupera da anestesia. </li><li> A fim de que os efeitos não-cAMP pigmento não deve confundir experimentos de sensibilidade de UV, interromper todos os tratamentos tópicos 2 dias anteriores à exposição à radiação UV (pigmento de efeito dura vários dias além último tratamento tópico). </li></ol> 4. Pele de medição de cor por Reflective Colorimetria <ol><li> Resumidamente anestesiar o mouse com isoflurano inalado (veja acima). </li><li> Calibrar um colorímetro Minolta, colocando a cabeça móvel sobre a superfície branca normalizadas fornecidas com o colorímetro. </li><li> Coloque a cabeça de medição portátil do colorímetro nivelada com a pele dorsal do animal garantindo que a rodada Apertur um centímetro 2e está completamente pressionado sobre a pele. Tome pelo menos três medidas distintas em diferentes áreas da pele dorsal. </li><li> Calcular média L pontuação * ± SD por animal e por grupo de tratamento. Colorimetria reflexiva pode ser feito em qualquer ponto do experimento. </li></ol> 5. Determinação da Sensibilidade UV por Cálculo de &quot;Minimal eritematosa Dose&quot; (MED) <ol><li> Use animais que tenham sido pré-tratados com veículo ou forscolina como descrito acima. Anestesiar os animais com injecção intraperitoneal de uma mistura padrão de cetamina e xilazina (ver acima). </li><li> Prepare um pedaço de fita UV-oclusiva para o teste MED. Para gerar furos na fita, use um furador pesados ​​com um 1 cm 2 recorte circular (Figuras 2A e B). Ter furos de um tamanho definido e disposição simétrica na fita facilita o reconhecimento de alterações na pele após a irradiação. Sobre cada buraco na fita, aplique um pedaço pequeno, mas facilmente destacável<html> da fita que podem ser removidos em períodos definidos durante a exposição aos raios ultravioleta para permitir a administração de doses de UV diferentes. </li><li> Uma vez que os animais são adequadamente sedado, coloque a fita na superfície dorsal. Lubrificante ocular devem ser sempre utilizados sob anestesia. </li><li> Ligue a fonte de UV consistindo de dois Westinghouse F15T8UV-B lâmpadas com uma potência máxima de 313 nm e uma gama de 280-370 nm. Permita que a lâmpada atingir a uma saída de UV constante medida por um fotômetro UV com um sensor de UVB (geralmente leva alguns minutos para que as lâmpadas para aquecer). </li><li> Com base na taxa de transmissão de UV tal como medido pelo fotómetro UV, calcular o tempo de exposição à radiação UV, para cada dose desejada. Por exemplo, medidas de UVB saída do nosso lâmpada de 2,4 mW / cm 2. Portanto, para administrar 5 kJ / m 2, a pele que necessita de ser exposta a 208 segundos (o que é de 3 min e 28 seg) da radiação UVB, como calculado abaixo: upload/50670/50670eq1.jpg &quot;/&gt; </li><li> Coloque os animais sedados (cada um com fita oclusivo no local) ventral superfície para baixo para garantir a exposição ainda UV. Para administrar as doses escolhidas de radiação UV, remover sequencialmente as pequenas fitas oclusivas que cobrem os orifícios para expor áreas de 1 cm2 de pele para as doses correctas de radiação. Assim, utilizando o exemplo acima, se 40 kJ / m 2 é a maior dose na experiência, então o animal estaria sob a lâmpada de 27 min e 47 seg total e a pele no estado de 40 kJ / m 2 não teria sobrepondo-se a fita o tempo todo. Entretanto, a fita se sobrepõe à condição 5 kJ / m 2 seria removido quando não é de 208 seg restante da exposição. O tempo de remoção de fita deve ser feito para que cada condição termina simultaneamente. </li><li> Após a exposição UV, descolar a fita da pele dorsal com cuidado, tomando cuidado para não rasgar a pele com movimentos bruscos ou excessivamente fortes. Coloque os animais em um lugar calmo quente para permitirrecuperação da anestesia. </li><li> Monitorar ratinhos durante 24-48 horas a olhar para zonas discretas de eritema (vermelhidão) ou edema (inchaço) correspondente para os locais anatómicos expostos a uma dose específica de irradiação UV. Documente achados cutâneos fotograficamente. </li><li> MED valor corresponde à dose mínima de UV, que provoca a inflamação, tal como definido por eritema e / ou edema de todo o círculo de pele exposta. Note-se que a pigmentação da pele pode desafiar a determinação do MED, no entanto, eritema e edema ainda pode geralmente ser avaliada com precisão, graças em parte à forma definida das aberturas na fita durante a exposição UV. </li></ol> 6. Análise Estatística Analisar dados entre grupos de ratos por um way ANOVA com pós-teste de Bonferroni (Graph Pad PRISM). Valores de p &lt;0,05 são considerados estatisticamente significativos.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Usando um modelo animal do ser humano de pele clara, nós achamos que a aplicação tópica de um extrato bruto da raiz rica em forskolin robustamente escurece a epiderme, estimulando a produção de melanina na pele. Epidermal melanização é dependente da expressão do factor de células estaminais na epiderme basal, como ocorre na pele humana, mas não na pele de rato não modificado geneticamente. A pele dorsal de ratinhos geneticamente não modificada não tem um número suficiente de melanócitos interfoliculares...

A incidência de melanoma, a forma mais letal de câncer de pele, aumentou dramaticamente ao longo das últimas décadas nos Estados Unidos, principalmente entre os indivíduos de pele clara. Evidência molecular e epidemiológica forte implica radiação UV como um grande causador fator ambiental 2-5. O aumento da exposição aos raios UV na forma de exposição ao sol e uso de bronzeamento artificial é provável que seja responsável por grande parte do aumento na incidência de melanoma 6-7. O risco de melanoma parece particularmente ligada com queimaduras 8, especialmente aqueles no início da vida 9-10. Risco de queimadura solar está ligado não só com a dose e a intensidade de exposição à radiação UV, mas também por factores que influenciam a resposta herdadas cutânea à radiação UV. A pigmentação da pele é um dos mais importantes determinantes da sensibilidade UV, risco de queimaduras e risco de câncer. Melanoma ocorre cerca de vinte vezes mais freqüentemente em pessoas de pele clara em relação a individua pele escurals 11-13. A melanina, um pigmento produzido por melanócitos na epiderme, é o principal determinante da tez da pele. Melanina vem em duas variedades principais: (1) eumelanina, um marrom / preta pigmento escuro eficaz em absorver a energia da radiação UV, e (2) feomelanina, um avermelhado / louro pigmento menos eficaz na prevenção da penetração de fótons ultravioleta na pele. A cor da pele, sensibilidade à UV e risco de melanoma são em grande parte determinado pelo conteúdo epidérmico eumelanin 14-15. O mais eumelanina na epiderme, os menos fotões UV pode penetrar na pele. Por causa de baixos níveis inatas de eumelanina, indivíduos de pele clara são muito mais propensos a efeitos agudos e crônicos da radiação UV 16-18. A pigmentação da pele, risco de melanoma e a capacidade de &quot;bronzear&quot; após exposição UV todos correlaciona com a capacidade de sinalização do receptor de melanocortina 1 (Mc1r), um G s acoplados a sete transmembranar sreceptor urface em melanócitos 19-22. Quando se liga Mc1r seu cognato ligando de alta afinidade, a hormona estimulante de melanócitos α-(α-MSH), que é a activação da adenilil-ciclase e a produção do segundo mensageiro AMPc 23. A resposta fisiológica normal da pele após a exposição aos raios UV inclui a produção epidérmica de α-MSH por queratinócitos 24-29. Nós e outros supor que derivado de queratinócito α-MSH liga-se a Mc1r em melanócitos epidérmicos, iniciando a produção a jusante do segundo mensageiro AMPc através de activação de adenililciclase 30. os níveis de cAMP controlar vários aspectos da diferenciação dos melanócitos, incluindo as vias de sobrevivência, reparo do DNA e síntese de pigmentos. Sinalização Mc1r e Camp induzir claramente os níveis de enzimas de pigmentos e produção eumelanin. Quando sinalização Mc1r está intacto e os níveis de cAMP melanocíticos são robustos, eumelanin é produzida ea pele escurece. No entanto, se a sinalização Mc1r está com defeito eos níveis de cAMP citoplasmáticos permanecem baixas, pheomelanin é produzido em vez de 1. Síntese Eumelanin pode ser estimulada farmacologicamente por agentes que aumentam os níveis de AMPc 1,14,31-35. Uma vez que a proteína Mc1r é um grande regulador do risco de melanoma em humanos 36-46, estamos interessados ​​em mecanismos pelos quais Mc1r protege melanócitos contra carcinogênese induzida por UV. Como base para os nossos estudos, geramos um modelo murino Mc1r variante transgênica em um C57BL / 6 genética fundo puro 1. Neste modelo, o factor de células estaminais (SCF) é constitutivamente expressa na epiderme basal e melanócitos epidérmicos interfoliculares são retidos na pele ao longo da vida 47, em contraste com os ratinhos não transgénicos, em que os melanócitos localizar a derme nos folículos do cabelo. Com o transgene K14-SCF incorporada, a epiderme fica pigmentado com a característica particular de pigmentos de melanina do pigmentoestirpe do animal 1. camundongos K14-SCF no fundo C57BL / 6 genética com tipo selvagem sinalização Mc1r ter pele de azeviche caracterizada por níveis muito altos de eumelanina pigmento. Não surpreendentemente, esses animais são altamente resistentes UV-. Em contraste, geneticamente compatíveis K14-SCF animais C57BL / 6 que abrigam um mutante inactivo Mc1r não têm quase nenhuma eumelanina na epiderme. Em vez disso, esses animais &quot;extensão&quot; (Mc1r E / E) têm uma tez da pele justo causada pela deposição de pigmento feomelanina (Figura 1A) e são muito mais sensíveis ao UV 48-49. Compostos farmacológicos com propriedades químicas que permitem a penetração na pele têm sido mostrados para induzir potencialmente eumelanina na extensão (Mc1r E / E) modelo animal K14-SCF por manipulação directa dos níveis de cAMP nos melanócitos epidérmicos da pele. Upregulation melanina neste modelo foi reported através da activação da adenililciclase 1, bem como a inibição da fosfodiesterase 4 35. Neste artigo, vamos demonstrar a preparação e aplicação tópica de forskolin em extensão (Mc1r e / e) animais K14-SCF qual o modelo que o ser humano sensível ao UV de pele clara. Mostra-se que a aplicação duas vezes por dia do medicamento promove melanização acelerado, que o escurecimento da pele é devido à deposição de melanina epidérmica e pigmento melanina epidérmica induzida que protege contra as queimaduras solares induzidas por UV por meio de medição de &quot;dose eritematosa mínima&quot; (MED) de 48.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Coleus Forskoli extract 20%</td>
			<td>Buckton Scott USA Inc. </td>
			<td>n/a</td>
			<td>Princeton, NJ</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isothesia, Isoflurane , USP</td>
			<td>Butler Schein</td>
			<td>NCD 11695-6776-1</td>
			<td>Dublin, OH, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Anased Injection</td>
			<td>LA04612</td>
			<td>Shenandoah, Iowa, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ketamine HCl, USP</td>
			<td>Putney</td>
			<td>NDC 26637-411-01</td>
			<td>St. Joseph, MO, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs.</td>
			<td>2705</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Propylene glycol</td>
			<td>Adesco</td>
			<td>05751L</td>
			<td>Solon, OH, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Depilatory cream, Nair</td>
			<td>Church &amp; Dwight</td>
			<td>JF-11 4381322</td>
			<td>Priceton, NJ</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Germicidal Hg Lamp UV-B</td>
			<td>Westinghouse</td>
			<td>F15T8UV-B</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Radiometer photometer</td>
			<td>International light</td>
			<td>1LT400A</td>
			<td>Peabody, MA,USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chromameter</td>
			<td>Konica Minolta</td>
			<td>CR-400</td>
			<td>Ramsey, NJ, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Data Processor for 	Chromameter CR-400</td>
			<td>Konica Monilta</td>
			<td>DR-400</td>
			<td>Ramsey, NJ, USA</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

pharmacologic induction of epidermal melanin and protection against sunburn in a humanized mouse model

Equidade de pele, a sensibilidade de UV e o risco de cancro da pele em correlação com a função fisiológica do receptor de melanocortina 1, uma proteína de sinalização G s acoplados a encontrada na superfície de melanócitos. Mc1r estimula a adenilil-ciclase e a produção de cAMP, que, por sua vez, se regula a produção melanocítico da melanina na pele. Para estudar os mecanismos pelos quais a sinalização Mc1r protege a pele contra os danos UV, este estudo se baseia em um modelo de rato com &quot;pele humanizado&quot;, baseado na expressão epidérmico do fator de células-tronco (SCF). Camundongos transgênicos K14-SCF reter melanócitos na epiderme e, por conseguinte, ter a capacidade de depósito de melanina na epiderme. Neste modelo animal, de tipo selvagem resulta num estado Mc1r de deposição robusta de pigmento eumelanina preta e um fenótipo UV-protegido. Em contraste, os animais K14-SCF com defeito sinalização Mc1r capacidade apresentam uma pigmentação vermelha / louro, muito pouco eumelanin na pele eum fenótipo sensível aos raios UV. Raciocínio que a deposição de eumelanina pode ser reforçada por agentes tópicos que imitam sinalização Mc1r, descobrimos que a aplicação direta do extrato forskolin na pele de camundongos de pele clara Mc1r-defeituoso resultou na indução eumelanin robusto e proteção UV 1. Aqui nós descrevemos a metodologia de elaboração e aplicação de um extrato de raiz natural, contendo forskolin para K14-SCF camundongos de pele clara e relatar um método para medir a sensibilidade UV determinando a dose eritematosa mínima (DEM). Usando este modelo animal, é possível estudar como indução epidérmica cAMP e melanização da pele afetam respostas fisiológicas à exposição UV.

C57BL / 6 machos foram gerados em fundos eumelanotic, pheomelanotic ou amelanóticos incorporando o transgene K14-SCF como descrito (Figura 1A). Coortes de extensão de pele clara (Mc1r E / E, Tyr + / +) os ratos foram tratados topicamente com duas doses diárias de veículo (etanol a 70%, 30% de propileno glicol) ou 40% de extracto de raiz de Coleus forskohlii bruto (80 uM por a dose), durante 5 dias (Figura 2B). Efeitos dos tratamentos tópicos ...

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Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model

Melanina epidérmica é induzida pela aplicação tópica de forscolina em um modelo murino da humano sensível aos raios UV de pele clara. Manipulação farmacológica de níveis de cAMP na pele e escurecimento da epiderme proteger fortemente contra a inflamação mediada por UV (queimadura solar), como medido pela dose eritematosa mínima (DEM) de ensaio.

A indução farmacológica de melanina epidérmica e proteção contra queimaduras solares em um modelo humanizado Rato

Fairness of skin, UV sensitivity and skin cancer  risk all correlate with the physiologic function of the melanocortin 1  receptor, a Gs-coupled signaling ...

pharmacologic-induction-epidermal-melanin-protection-against-sunburn

Research

JoVE Journal

Medicine

18.0K visualizações.  University of Kentucky College of Medicine.  Melanina epidérmica é induzida pela aplicação tópica de forscolina em um modelo murino da humano sensível aos raios UV de pele clara. Manipulação farmacológica de níveis de cAMP na pele e escurecimento da epiderme proteger fortemente contra a inflamação mediada por UV (queimadura solar), como medido pela dose eritematosa mínima (DEM) de ensaio. 

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A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

Um modelo do rato de No Utero Transplante

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Medicina

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotão imagem de invasão das células tumorais em um modelo de camundongo ortotópico de carcinoma epidermóide oral

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been shown to effectively induce humoral and cellular responses at systemic and mucosal sites, namely the lungs and urogenital tract. Sublingual vaccination can promote protection against infections at the lower and upper respiratory tract; it can also promote tolerance to allergens and ameliorate asthma symptoms. Modulation of lung&#8217;s immune response by sublingual immunotherapy (SLIT) is safer than direct administration of formulations by intranasal route because it does not require delivery of potentially harmful molecules directly into the airways. In contrast to intranasal delivery, side effects involving brain toxicity or facial paralysis are not promoted by SLIT. The immune mechanisms underlying SLIT remain elusive and its use for the treatment of acute lung infections has not yet been explored. Thus, development of appropriate animal models of SLIT is needed to further explore its potential advantages. 
This work shows how to perform sublingual administration of therapeutic agents in mice to evaluate their ability to protect against acute pneumococcal pneumonia. Technical aspects of mouse handling during sublingual inoculation, precise identification of sublingual mucosa, draining lymph nodes and isolation of tissues, bronchoalveolar lavage and lungs are illustrated. Protocols for single cell suspension preparation for FACS analysis are described in detail. Other downstream applications for the analysis of the immune response are discussed. Technical aspects of the preparation of Streptococcus pneumoniae inoculum and intranasal challenge of mice are also explained.
SLIT is a simple technique that allows screening of candidate molecules to modulate lungs&#8217; immune response. Parameters affecting the success of SLIT are related to molecular size, susceptibility to degradation and stability of highly concentrated formulations.

The present work illustrates the convenience of using sublingual immunotherapy to boost the innate immune response in the lungs and confer protection against acute pneumococcal pneumonia in mouse.

Imunoterapia sublingual como uma alternativa para induzir protecção contra Infecções Respiratórias Agudas

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been ...

Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. Females are disproportionately afflicted by UTI: 50% of all women will have a UTI in their lifetime. Additionally, 20-40% of these women who have an initial UTI will suffer a recurrence with some suffering frequent recurrences with serious deterioration in the quality of life, pain and discomfort, disruption of daily activities, increased healthcare costs, and few treatment options other than long-term antibiotic prophylaxis. Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) is the primary causative agent of community acquired UTI. Catheter-associated UTI (CAUTI) is the most common hospital acquired infection accounting for a million occurrences in the US annually and dramatic healthcare costs. While UPEC is also the primary cause of CAUTI, other causative agents are of increased significance including Enterococcus faecalis. Here we utilize two well-established mouse models that recapitulate many of the clinical characteristics of these human diseases. For UTI, a C3H/HeN model recapitulates many of the features of UPEC virulence observed in humans including host responses, IBC formation and filamentation. For CAUTI, a model using C57BL/6 mice, which retain catheter bladder implants, has been shown to be susceptible to E. faecalis bladder infection. These representative models are being used to gain striking new insights into the pathogenesis of UTI disease, which is leading to the development of novel therapeutics and management or prevention strategies.

The ability to model urinary tract infections (UTI) is crucial in order to be able to understand bacterial pathogenesis and spawn the development of novel therapeutics. This work&#8217;s goal is to demonstrate mouse models of experimental UTI and catheter associated UTI that recapitulate and predict findings seen in humans.

Criação e Caracterização da UTI e CAUTI em um modelo de rato

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. ...

Stem-cell Based Engineered Immunity Against HIV Infection in the Humanized Mouse Model

With the rapid development of stem cell-based gene therapies against HIV, there is pressing requirement for an animal model to study the hematopoietic differentiation and immune function of the genetically modified cells. The humanized Bone-marrow/Liver/Thymus (BLT) mouse model allows for full reconstitution of a human immune system in the periphery, which includes T cells, B cells, NK cells and monocytes. The human thymic implant also allows for thymic selection of T cells in autologous thymic tissue. In addition to the study of HIV infection, the model stands as a powerful tool to study differentiation, development and functionality of cells derived from hematopoietic stem cells (HSCs). Here we outline the construction of humanized non-obese diabetic (NOD)-severe combined immunodeficient (SCID)-common gamma chain knockout (c&#947;-/-)-Bone-marrow/Liver/Thymus (NSG-BLT) mice with HSCs transduced with CD4 chimeric antigen receptor (CD4CAR) lentivirus vector. We show that the CD4CAR HSCs can successfully differentiate into multiple lineages and have anti-HIV activity. The goal of the study is to demonstrate the use of NSG-BLT mouse model as an in vivo model for engineered immunity against HIV. It is worth noting that, because lentivirus and human tissue is used, experiments and surgeries should be performed in a Class II biosafety cabinet in a Biosafety Level 2 (BSL2) with special precautions (BSL2+) facility.

This protocol describes the methods in constructing a humanized bone-marrow/liver/thymus mouse model with stem cell-based engineered immunity against HIV infection.

De células-tronco Baseado Imunidade Engineered contra infecção por HIV no modelo humanizado mouse

With the rapid development of stem cell-based gene therapies against HIV, there is pressing requirement for an animal model to study the hematopoietic ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in which the liver has been repopulated with functional human hepatocytes, could serve as a useful tool for investigating human hepatic cell biology, drug metabolism, and other preclinical applications. One of the key factors required for successful transplantation of human hepatocytes into mice is the elimination of the endogenous hepatocytes to prevent competition with the human cells and provide a suitable space and microenvironment for promoting human donor cell expansion and differentiation. To date, two major liver injury mouse models utilizing fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) and uroplasminogen activator (uPA) mice have been established. However, Fah mice are used mainly with mature hepatocytes and the application of the uPA model is limited by decreased breeding. To overcome these limitations, Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice were used for in vivo differentiation of immature human hepatocytes and humanized liver generation. Human hepatic stem cells (HpSCs) successfully repopulated the livers of Alb-TRECK/SCID mice that had developed lethal fulminant hepatic failure following diphtheria toxin (DT) treatment. This model of a humanized liver in Alb-TRECK/SCID mice will have functional applications in studies involving drug metabolism and drug-drug interactions and will promote other in vivo and in vitro studies.

Here, we present a novel humanized mouse liver model generated in Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice following the transplantation of immature and expandable human hepatic stem cells.

Geração de um humanizado rato Liver Usando células-tronco hepáticas humanas

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. Moreover, by rupture of the defective vascular wall, atherosclerosis induces occlusive thrombus formation, which represents the main cause of myocardial infarction or stroke and the most frequent cause of death. Despite the advances in the cardiovascular field, many questions remain unanswered, and additional basic research is essential to improve our understanding of the molecular mechanisms during atherosclerosis and its effects. Due to limited clinical studies, there is a need for representative animal models recreating atherosclerotic conditions such as neointima formation after stent implantation, balloon angioplasty, or endarterectomy. Since the mouse presents many advantages and is the most frequently used model for studying molecular processes, the current study proposes an invasive procedure of endothelial denudation, also known as the wire-injury model, which is representative of the human condition of neointima formation in arteries after revascularization procedures.

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The &quot;Wire-Injury&quot; Model

This study describes an invasive procedure for the induction of accelerated atherosclerosis in mice. In comparison to other methods using electric- or cryo-induced injury, mechanical-induced injury mimics the human condition of restenosis after revascularization therapies and is ideal for the study of the molecular mechanisms involved.

Indução de Aterosclerose Acelerada em Camundongos: O Modelo de "Lesão por Fio"

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Intravital Microscopy and Thrombus Induction in the Earlobe of a Hairless Mouse

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions between cellular and non-cellular blood components during thrombus formation, reliable studies of the physiology and pathophysiology of thrombosis can only be performed in vivo. Therefore, this article presents an ear model in hairless mice and focuses on the in vivo analysis of microcirculation, thrombus formation, and thrombus evolution. By using intravital fluorescence microscopy and the intravenous (iv) application of the respective fluorescent dyes, a repetitive analysis of microcirculation in the auricle can easily be performed, without the need for surgical preparation. Furthermore, this model can be adapted for in vivo studies of different issues, including wound healing, reperfusion injury, or angiogenesis. In summary, the ear of hairless mice is an ideal model for the in vivo study of skin microcirculation in physiological or pathophysiological conditions and for the evaluation of its reaction to different systemic or topical treatments.

The ear model of the hairless SKH1-Hrhr mouse enables intravital fluorescence microscopy of microcirculation and phototoxic thrombus induction without prior surgical preparation in the examined microvascular bed. Therefore, the ear of the hairless mouse is an excellent in vivo model to study the complex interactions during microvascular thrombus formation, thrombus evolution, and thrombolysis.

Intravital Microscopia e trombo Indução no lóbulo da orelha de um rato calvo

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions ...

Induction and Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Model

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have been established by tamoxifen induced deletion of Ccm genes in postnatal animals. These mouse models provide invaluable tools to investigate molecular mechanism and therapeutic approaches for CCM disease. An accurate and quantitative method to assess lesion burden and progression is essential to harness the full value of these animal models. Here, we demonstrate the induction of CCM disease in a mouse model and the use of the contrast enhanced X-ray micro computed tomography (micro-CT) method to measure CCM lesion burden in mouse brains. At postnatal day 1 (P1), we used 4-hydroxytamoxifen (4HT) to activate Cre recombinase activity from the Cdh5-CreErt2 transgene to cleave the floxed allele of Ccm2. CCM lesions in mouse brains were analyzed at P8. For micro-CT, iodine based Lugol&#39;s solution was used to enhance contrast in brain tissue. We have optimized the scan parameters and utilized a voxel dimension of 9.5 &#181;m, which lead to a minimum feature size of approximately 25 &#181;m. This resolution is sufficient to measure CCM lesion volume and number globally and accurately, and provide high-quality 3-D mapping of CCM lesions in mouse brains. This method enhances the value of the established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for CCM and other cerebrovascular diseases.

This protocol demonstrates the induction of cerebral cavernous malformation disease in a mouse model and uses contrast enhanced micro computed tomography to measure lesion burden. This method enhances the value of established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for cerebral cavernous malformation and other cerebrovascular diseases.

Indução e Micro-CT Imaging de malformações cavernosas cerebrais no modelo de Mouse

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Medição de contratilidade isométrica da artéria mesentérica Mouse usando fio miografia

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...