Este método pode ser útil no desenvolvimento de cosméticos funcionais e agente de pele com atividades anti-melanógenas. Está lá para realizar e o resultado pode ser obtido rapidamente. Além disso, esse método pode ser útil para pesquisadores, que querem identificar ou investigar os efeitos ou os compostos ou investigar as atividades anti-melanoma ou promelanogênicas.
Para medir a atividade tyrosinase comece semeando Melanicidas B16-F10 a cinco vezes 10 para as quatro células por poço de uma concentração de placa de 24 poços em meio completo por 24 horas em uma incubadora de cultura celular. No dia seguinte, substitua o supernaente em cada poço por DMEM complementado com composto de teste recém-preparado e controle inibidor ou um controle negativo e devolva a placa à incubadora por mais 72 horas. No final do tratamento enxágue os poços duas vezes com 300 microliters de pbs frios por poço e coloque a placa no gelo.
Em seguida, adicione 300 microliters de tampão de lise a cada poço usando um raspador de células para coletar os lises celulares após cinco minutos. Transfira as suspensões de partículas celulares resultantes para tubos individuais de microcentrífugo de 1,5 mililitro. E homogeneize os lises três vezes por dois segundos a 14,500 rpm no gelo para liberar o Tyrosinase intercelular.
Pellule os detritos celulares por centrifugação e transfira os supernantes para tubos individuais de centrífugas de 1,5 mililitro no gelo. Aloque 70 microlitros de cada supernaente para poços individuais de uma micro placa de poliestireno clara de 96 poços e adicione 140 microlitros de solução de substrato de Tyrosinase a cada poço de supernascer. Agitando a placa suavemente para misturar o conteúdo do poço.
Em seguida, incubar a placa a 37 graus celsius por duas horas. E meça a atividade tyrosinase em 475 nanômetros em um leitor de microplato. Para medir o teor de melanina das células após a coleta do lysate das células tratadas como demonstrado.
Colete os lises por centrifugação e transfira os supernantes para novos tubos. Adicione 300 microliters de um hidróxido de sódio normal a cada pelota para uma incubação de uma hora a 60 graus Celsius. Seguido pela centrifugação das suspensões de células dissolvidas.
Em seguida, transfira 200 microliters dos supernantes para cada poço de uma placa de 96 poços. E meça o conteúdo da melanina em um leitor de microplaca a um comprimento de onda de 400 nanômetros. Para fontana-masson Staining, lave as células tratadas duas vezes com 300 microliters de pbs frios e fixe as células com 200 microliters de 10% formalina por uma hora a quatro graus Celsius.
Enxágüe as células grossas com água destilada e adicione 200 microlitros de 58 a 68 graus celsius solução de trabalho de prata ammoniacal para cada poço. Para uma hora de incubação a 37 graus Celsius ou até que as células se tornem amarelas-marrons na cor. Enxágüe as células manchadas com água destilada seguida de incubação de dois minutos em cloreto de ouro de 0,1% à temperatura ambiente.
Enxágüe as células tratadas com cloreto de ouro com água destilada e adicione 200 microliters de solução de tiossulfato de sódio às células. Depois de dois minutos enxágue as células novamente. E rotular as células com 200 microliters de vermelho nuclear rápido por poço por cinco minutos.
Em seguida, lave as células manchadas com água da torneira antes de imaginar sob um microscópio leve. Para análise de limiar, abra as imagens na imagem J e selecione imagem, ajuste e Limite de cores. Para medir a área manchada com Fontana Masson, ajuste a barra do parâmetro de brilho a zero e ajuste o brilho ao ponto em que todas as células manchadas pretas ou marrons estão incluídas.
Selecione Analisar e analisar partículas e verificar a caixa de resumo na janela Analisar partículas e clique bem para obter um resumo dos resultados e copie e cole os dados em uma planilha. O tratamento com arbutina suprime significativamente a atividade de Tyrosinase celular em comparação com as células tratadas com veículos de controle. Da mesma forma, o teor de melanina das células estimuladas com Arbutin é significativamente reduzido em comparação com os controles.
Embora as células sejam morfologicamente semelhantes entre os grupos de tratamento, a arbutina diminui a área do pigmento negro em comparação com as células tratadas de controle. Este método é útil para a triagem de atividades usando nossa biblioteca composta. Há mais de centenas de amostras para serem testadas rapidamente.
Além disso, este método também pode ser usado para investigar o mecanismo que envolve a melanogênese. Após a identificação dos compostos de candidatos bioativos, para seu testemunho do estudo de mecanismos biológicos ou aplicações comerciais.
