A reprogramação direta para gerar melanócitos foi relatada. No entanto, vários fatores de transcrição são utilizados em diferentes estudos. Neste protocolo, validamos e reduzimos o número do fator de transcrição ainda com maior eficiência de reprogramação.
Estabelecemos um sistema de reprogramação direta para gerar melanócitos usando apenas três fatores de transcrição, Mitf, Sox10 e PAX3, e modificamos o sistema de cultura para torná-lo mais estável e robusto. Como regenerar melanócitos funcionais é uma questão significativa que pode ajudar a lidar com limitações terapêuticas para doenças despigmentação como o vitiligo. A reprogramação certa proporciona uma potencial Nossa técnica tem as características de conveniência, forte operabilidade e estabilidade, o que é mais fácil de promover e repetir.
Para iniciar a produção do lentivírus concentrado, a placa 1,5 vezes 10 para as 6 células HEK-293T em um prato de 60 milímetros, e cultivar as células com meio normal a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono. Após 24 horas de incubação, quando as células HEK-293T atingirem 80 a 90% de confluência, substitua o meio por 3,5 mL de DMEM e incuba as células a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono por duas horas. Depois de remover as células da incubadora, substitua o meio por DMEM contendo 2% de FBS e adicione a mistura de complexo de transfecção recém-preparada às células de forma drop-wise.
Misture a mistura líquida suavemente. Ao completar oito horas, troque o meio celular com 3,5 mL de meio normal. Colete o vírus supernante em 24 e 48 horas.
Em seguida, misture os supernacantes do vírus coletados em dois pontos de tempo diferentes e centrifugar a mistura a 200 xg por cinco minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, passe o supernante coletado através de filtros de 0,45 mícrons para coletar o filtrado em um tubo cônico estéril de 50 mL. Concentre o vírus filtrado supernacido por centrifugação a 6.000 xg a quatro graus Celsius durante a noite.
Uma vez feito, certifique-se de que a pelota do vírus é visível na parte inferior do tubo cônico. Despeje o supernatante lentamente. Para dissolver a pelota do vírus no meio normal com um por 100º volume do vírus supernante.
Use uma micropipette P1000 para pipeta para cima e para baixo suavemente até que uma mistura homogênea de vírus concentrado de 100x seja obtida. Divida o vírus concentrado nos tubos de microcentrifuuagem para armazenar a 80 graus Celsius. Placa 1 vezes 10 para a 5ª célula HEK-293T em um poço de uma placa de seis poços.
Cultuam essas células com o meio normal a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono. Após 24 horas, adicione 0,1 a 0,2 microlitres do vírus concentrado fluorescente de 100x a cada poço. Seguido pela adição de quatro nanogramas por microliters do reagente de transfecção policrórica cônica a cada poço.
Cerca de oito a doze horas após a infecção pelo vírus, substitua o meio pelo meio normal. Às 48 horas após a infecção, lave o prato com 1 mL de PBS estéril para remover as células mortas. Em seguida, tentepsinizar as células usando 250 microlitres de 0,05% trypsin-EDTA solução por poço de uma placa de seis poços à temperatura ambiente.
Centrifugar a placa a 200 xg por cinco minutos a quatro graus Celsius. Depois de remover o supernasce, suspenda a pelota celular em um mL de PBS e adicione a suspensão celular a um tubo de fundo redondo de poliestireno de cinco mL. Em seguida, coloque o tubo no citômetro de fluxo para analisar a amostra.
Para reprogramação direta de fibroblastos, cubra um poço de uma placa de cultura celular de seis poços com 1 mL de solução de gelatina de 0,1% à temperatura ambiente. Após 15 a 30 minutos, quando o poço estiver completamente coberto com a gelatina, aspirar solução de gelatina de 0,1%. Em seguida, chapa 5 vezes 10 para o 4º camundongo fibroblastos embrionários, ou MEFs, em um poço de uma placa de seis poços revestida com 0,1% de gelatina, e cultura as células durante a noite com o meio normal a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono.
Após 24 horas, quando os MEFs atingirem 40 a 50% de confluência, substitua o meio pelo meio normal. Em seguida, derreta o vírus congelado e concentrado no gelo. Calcule o volume do vírus a ser adicionado usando a equação e, em seguida, adicione o vírus concentrado para os seis fatores de transcrição a cada poço, de acordo com o volume calculado.
Adicione quatro microgramas por mL do agente de transfecção polimérica cônica ao poço. Considere-o como o dia zero da infecção por lentivírus. No primeiro dia, após 8 a 12 horas de infecção, substitua o meio contendo o vírus pelo meio normal fresco, ao mesmo tempo em que adiciona 0,5 microgramas por mL puramicina para tela de linhas celulares infectadas estáveis.
No segundo dia, 48 horas após a infecção, substitua gradualmente o meio supernante pelo meio de reprogramação. Altere um quarto do volume médio total antes de adicionar três micromolar CHIR99021. Do terceiro ao sétimo dia, dependendo da condição das células, altere o meio substituindo-o gradualmente por uma maior proporção de meio de reprogramação para mudar para o meio de reprogramação completo dentro de cinco dias.
Em seguida, desprendem as células com 500 microlitrais de enzima digestiva 0,05% trypsin-EDTA por três minutos à temperatura ambiente. Quando aproximadamente sessenta por cento das células flutuarem, pare a digestão adicionando o meio normal, duas vezes o volume da enzima digestiva. Colete a suspensão celular em um tubo cônico estéril de 15 mL para centrífuga a 200 xg por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Remova o supernatante antes de suspender a pelota celular com o meio de reprogramação. Quando terminar, emplaque as células re-suspensas em um prato estéril de 60 milímetros. Cultume as células a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada de 5% de dióxido de carbono.
Após quarenta e oito horas de infecção por lentivírus em células HEK-293T, o sucesso da produção concentrada de lentivírus foi avaliado observando a intensidade de fluorescência do GFP ou por citometria de fluxo. O título do vírus concentrado foi encontrado alto em 10 a 8 tu/mL. Durante a reprogramação direta dos fibroblastos, a morfologia celular mudou gradualmente para sinapse celular alongada e núcleos celulares aumentados.
No entanto, as células envelhecem progressivamente após o dia 20. A remoção dos fatores de transcrição, Mitf, Pax3 ou Sox10, resultou no silenciamento da expressão de genes melanócticos, Tyr, Tyrp1 e Mlana, indicando o maior impacto na conversão do fibroblasto para melanócitos. Assim, a expressão de genes melanóciticos induzidos pela programação direta com três fatores de transcrição foi maior quando comparada com seis fatores de transcrição.
Para identificar melanócitos induzidos pelo MEF, ou iMels, a expressão de marcadores melanócticos, TYRP1 e DCT foi detectada usando manchas imunofluorescentes. Além disso, os métodos de coloração específicos de melanina, como dopa e coloração de Masson-Fontana, apresentaram resultados positivos. As células 293T devem ser distribuídas uniformemente.
Além disso, a adição de mistura de transfecção às células deve ser feita suavemente para evitar que as células flutuam. O protocolo é estável e prático e pode ser usado para reprogramar outros tipos de células. Espera fornecer uma referência e uma estratégia para a reprogramação direta in vivo na regeneração de melanócitos na medicina futura.
