LMW e RHK são suportados pela Escola de Pós-Graduação da UMaine de Ciências Biomédicas e Engenharia (GSBSE); RHK também foi apoiado pelo Fundo Maine &amp; Estação Experimental Forest. Financiamento adicional foi fornecido pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (NIH P20-GM103423), o Agricultural Maine &amp; Estação Experimental Florestal (Grant Número ME08004-10, JAG), a Universidade de Maine ADVANCE Rising Tide Center (NSF Grant # 1008498) e um Research Grant Iniciado em Farmacologia / Toxicologia da PhRMA fundação (JAG). Agradecemos drs. David Holowka e Barbara Baird para o antigénio e células. Somos gratos a Hina Hashmi, Alejandro Velez e Andrew Abovian ajuda com equipamentos e ordens. Este é Maine Agricultural &amp; Estação Experimental Floresta número de publicação 3311.

Em 2004, Naal et ai. Uma desenvolveu um biossensor de mastócitos para o ensaio de elevado rendimento de degranulação. É um ensaio robusto que nós adaptamos para os nossos estudos TCS e detalhado neste vídeo. Antes da Naal et ai. Ensaio 1, a desgranulação dos mastócitos foi avaliada rotineiramente através β-hexosaminidase 59-61, mas estes métodos iniciais utilizados fluorímetros no qual uma amostra foi lido ao mesmo tempo. Importante, Naal et al. concordância directa e...

Os mastócitos são altamente granulado células imunes efetoras que servem como mediadores importantes na asma, alergias, parasitas defesa e carcinogênese 13-16. Eles residem em quase todos os tecidos vascularizados 15, onde armazenar com segurança os mediadores inflamatórios e alérgicos em grânulos citoplasmáticos até ser ativado para desgranulam. Degranulação é a exocitose de grânulos à membrana, o que resulta na liberação de mediadores farmacologicamente ativos, tais como a histamina, triptase, leucotrienos e 15. Este processo resulta na iniciação de reacções de hipersensibilidade do tipo I, que são críticas para a montagem de defesa contra parasitas bem como o início de reacções alérgicas, asma, e 15 cancerígenas. Os mastócitos e basófilos, FceRI expressam receptores, os receptores de alta afinidade para a imunoglobulina E (IgE) 17. A exposição a um alergénio ou antigénio provoca a agregação de múltiplos receptores de IgE FceRI ligados 17, e é este so-chamada &quot;reticulação&quot; de receptores Fc de IgE ligadas, que inicia o processo de desgranulação: uma cascata de acontecimentos de fosforilação de tirosina, a activação de fosfolipase C, o efluxo de cálcio das reservas internas, e influxo de cálcio para dentro da célula 18. Este influxo de cálcio é necessária para a desgranulação e, ainda, sinaliza a fusão com a membrana dos grânulos antes de causar a exocitose de grânulos 15. Experimentalmente, um ionóforo de cálcio pode ser utilizada para transporte de cálcio directamente através da membrana da célula 19, o que evita essencialmente todas as etapas de transdução de sinal, antes da etapa 20 do influxo de cálcio, permitindo a identificação de um alvo por via de um tóxico como estando a montante ou a jusante de cálcio de sinalização 20. Degranulação pode ser medido de forma rápida e eficaz, o controlo da libertação de β-hexosaminidase no sobrenadante de células, que é libertada a partir dos grânulos de forma linear juntamente com a histamina 6, mas ié muito mais fácil de detectar utilizando uma reacção enzima-substrato simples e um leitor de microplacas para análise do produto fluorescente. Este ensaio de microplacas, como descrito na secção do protocolo, baseia-se num método robusto originalmente desenvolvida por Naal et ai. 1, que quantifica a clivagem do substrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-N-acetil--D-β glucosaminide por β- hexosaminidase. Nós modificamos o ensaio para efeitos de teste de drogas e substâncias tóxicas, com triclosan destaque aqui. Este método quantifica fiável desgranulação, é uma alternativa de baixo custo para, por exemplo, o fluxo de métodos de detecção baseados em citometria de 21, e tem o potencial de se prestar bem para rastreio de alto rendimento de uma grande variedade de fármacos anti-alérgicos, assim como imunotóxicas ou substâncias químicas alergênicas. Este último ponto é particularmente importante, tendo em conta o relatório do Conselho Nacional de Pesquisa 2007 &quot;Ensaios de Toxicidade no Século 21: Uma visão e uma StratEGY &quot;( <a href="http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970">http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970</a> ), que preconiza para o desenvolvimento de testes de toxicologia de alto rendimento que utilizam a cultura de células para reduzir a utilização dispendiosa de animais tradicionais, tais como ratinhos de laboratório. O protocolo desenvolvido pela desgranulação Naal et ai. 1, e modificada por nós 2, utiliza a linha de células RBL-2H3, que é um modelo bem aceite homóloga aos mastócitos das mucosas humanas ou basófilos 3-5. (Métodos para a cultura de células RBL-2H3 estão detalhados em Hutchinson et al. 22). Este ensaio poderia provavelmente ser adaptado a qualquer tipo de célula mastro em anexo. Triclosan (TCS) é um antimicrobiano de amplo espectro que tem sido utilizado por mais de 30 anos em hospitais, produtos de cuidados pessoais e de bens de consumo 23,24. O modo de ação para a característica antimicrobiana da TCS é a inibição da biossíntese de ácidos graxos, provavelmente inibindo enoil-acilproteína transportadora reductase 25,26. É encontrado em todo o mundo em uma ampla gama de produtos de consumo, tais como gel de banho, loção para as mãos, creme dental, enxaguatório bucal, e na mão sabonetes em concentrações de até 0,3% ou 10 mM 24. O uso generalizado de TCS resultou em níveis detectáveis ​​em humanos 27-29 e em rios e córregos 30. Um estudo feito pela Allmyr et al. 27 demonstraram que a TCS e seus metabólitos estão presentes tanto no plasma e no leite de mães que amamentam. Importante, a TCS é facilmente absorvido pela pele 31-37. Queckenberg et ai. Encontrado 37 ~ 10% a absorção de um ~ 70 mM TCS creme na pele humana, dentro de 12 horas, resultando em uma concentração significativa na pele, onde residem os mastócitos. SCT foi demonstrado clinicamente para controlar a doença alérgica da pele humana 7-11, mas o mecanismo pelo qual a TCS alivia as doenças alérgicas de pele tem sido desconhecido 38. Usando o ensaio de fluorescência de microplacas detailed neste vídeo, demonstramos recentemente que a TCS, a concentrações tão baixas quanto 2 uM, atenua significativamente a função de mastócitos e desgranulação, proporcionando uma potencial explicação para estes dados clínicos 2. Além de proporcionar uma explicação para estes dados clínicos, os nossos resultados em Palmer et al. 2 sugerem que a TCS de sinalização tem como alvo a jusante das moléculas do influxo de cálcio. Devido à importância da sinalização de cálcio em muitos outros processos imunológicos e biológicos, a TCS poderia ter efeitos adversos sobre uma ampla variedade de processos biológicos necessários. Na verdade, Udoji et al. 39 mostrou que TCS suprime a atividade das células natural killer humano lítico, outra função imune inato importante. Para além do seu potencial como uma ajuda terapêutica na doença alérgica da pele (ou, inversamente, como um immunotoxicant), TCS também pode ser um disruptor endócrino 40-49. Assim, um procedimento claro de como preparar este produto químico em solução is de interesse para os toxicologistas. Porque SCT é uma pequena molécula hidrófoba, os veículos orgânicos são muitas vezes utilizados para torná-lo mais solúvel em água. Na maioria dos estudos de toxicidade em que a TCS foi testado, a preparação envolveu a dissolução em água com o auxílio de um solvente orgânico tal como etanol, acetona, ou óleo 2,50,51. No entanto, muitas vezes esses solventes são biologicamente ativa-se, complicando assim a interpretação da substância em estudo de dados 51. Na verdade, de acordo com Rufli et al. 52 e outros 53, recomenda-se que as soluções de ensaio para ensaios de toxicidade aquática são preparadas utilizando métodos físicos sobre os métodos químicos, devido ao potencial de solventes químicos para criar artefactos de toxicidade. Nós mostramos anteriormente que a TCS dissolvido em 0,24% de etanol / água (v / v) e sonicado por 30 min amortece RBL degranulação dos mastócitos 2. O etanol em concentrações mais elevadas do que 0,24% foi mostrado para amortecer degradação mastócitoscanulação 54,55, exemplos dos efeitos potencialmente de confusão de solventes orgânicos em estudos de toxicidade. Não só é importante ter em conta o efeito de solventes no organismo ou células utilizadas para o estudo, mas também é importante para monitorizar o efeito de um solvente sobre o próprio produto químico de teste. Por exemplo, Skaare et ai. Dissolvendo 51 descobriram que a TCS em polietileno-glicol (normalmente encontrados nos dentífricos e bochechos) atenuou os efeitos anti-bacterianos e anti-placa em mulheres saudáveis ​​do sexo feminino durante a dissolução em óleos provocou uma perda completa de função. Portanto, a capacidade de diferentes solventes para modular tóxico e de drogas, incluindo TCS, efeitos devem ser considerados no desenho do ensaio. A utilização de óleos ou aditivos de sabor pode interferir com os efeitos de TCS em vários produtos 50,51. Num esforço para eliminar a necessidade de utilizar solventes orgânicos, que melhorado para o nosso método de dissolução TCS 2, eliminando o uso de um sol orgânicadesabafar. No presente protocolo, dissolver TCS grânulos diretamente em tampão aquoso com o calor (≤ 50 ° C) e, em seguida, verificar a concentração desse estoque TCS por espectrofotometria de UV-Vis. Estas melhorias são possíveis porque SCT é solúvel em água até 40 uM ( <a href="http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf">http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf</a> ) e tem sido demonstrado que resistem à degradação quando aquecido a 50 ° C ( <a href="http://oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf">http:// / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf</a> ) 56,57. Também tem a vantagem de espectrofotometria de UV-Vis, como TCS também é conhecido por absorvem fortemente a 280 nm, com um 58 coeficiente de extinção molar de 4,200 L / mol / cm 12. Este protocolo oferece uma maneira simples, mas eficaz para dissolver TCS grânulos para um tampão, sem o auxílio de um solvente orgânico, incluindo o baixo custo e rápida verificaçãode concentração e descreve um ensaio de microplaca fluorescente poderoso para monitorar os efeitos químicos sobre a degranulação dos mastócitos.

a microplate assay to assess chemical effects on rbl-2h3 mast cell degranulation: effects of triclosan without use of an organic solvent

Os mastócitos desempenham um papel importante na doença alérgica e de defesa imunológica contra parasitas. Uma vez activado (por exemplo, por um alérgeno), eles desgranulam, um processo que resulta na exocitose de mediadores alérgicos. Modulação da desgranulação dos mastócitos por drogas e substâncias tóxicas podem ter efeitos positivos ou negativos sobre a saúde humana. Função de mastócitos foi dissecada em pormenor com a utilização de mastócitos de leucemia basófilas de rato (RBL-2H3), um modelo amplamente aceito de mastócitos das mucosas humanas 3-5. Componente de mastro de células granulares e o mediador alérgica β-hexosaminidase, que é libertado de forma linear em conjunto com a histamina dos mastócitos 6, pode ser facilmente e confiantemente ser medido por meio de reacção com um substrato f luorogénico, obtendo-se a intensidade de fluorescência mensurável num ensaio de microplacas que é passível de estudos de alto rendimento 1. Originalmente publicado por Naal et al. 1, que se adaptaram este ensaio degranulação para a triagem of drogas e substâncias tóxicas e demonstrar seu uso aqui. Triclosan é um agente antibacteriano de largo espectro, que está presente em muitos produtos de consumo e foi encontrado ser uma ajuda terapêutica na doença alérgica da pele humana 7-11, embora o mecanismo deste efeito é desconhecido. Aqui demonstramos um ensaio para o efeito do triclosan sobre a desgranulação de mastócitos. Mostramos recentemente que triclosan afeta fortemente a função dos mastócitos 2. Em um esforço para evitar a utilização de um solvente orgânico, o triclosan é dissolvida directamente em tampão aquoso com calor e agitação, e a concentração resultante é confirmado por espectrofotometria de UV-Vis (usando ε 280 = 4,200 L / M / cm) 12. Este protocolo tem o potencial para ser usado com uma variedade de produtos químicos para determinar os seus efeitos sobre a desgranulação de mastócitos e, mais genericamente, o seu potencial alérgico.

Quando aquecida a 50 ° C durante 90 min, o espectro de absorção de UV-Vis de SCT produz uma curva forte, suave entre ~ 260 e 300 nm, com pico a 280 nm, como mostrado na Figura 1. Espectrofotometria de UV-Vis, portanto, é uma importante ferramenta que pode ser utilizada para calcular a concentração, uma vez que o coeficiente de absorção molar publicada a 280 nm é de 4.200 L / mol / cm 12. Nós descobrimos que a TCS não cai para fora da solução durante o período de tempo de todo o experimento desgranul...

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A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Degranulação dos mastócitos, a liberação de mediadores alérgicos, é importante para alergia, asma e defesa do parasita. Aqui demonstramos uma técnicas para a avaliação dos efeitos de drogas e de substâncias tóxicas em desgranulação, a metodologia utilizada recentemente para expor o efeito inibidor potente do agente antibacteriano triclosano 2.

Um Ensaio de microplacas para avaliar os efeitos químicos de RBL-2H3 degranulação dos mastócitos: Efeitos do Triclosan, sem utilização de solventes orgânicos

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

39.8K visualizações.  University of Maine, Orono.  Degranulação dos mastócitos, a liberação de mediadores alérgicos, é importante para alergia, asma e defesa do parasita. Aqui demonstramos uma técnicas para a avaliação dos efeitos de drogas e de substâncias tóxicas em desgranulação, a metodologia utilizada recentemente para expor o efeito inibidor potente do agente antibacteriano triclosano 2. 

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Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Dilated cardiomyopathy (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1. Although genetic disposition and exposition to toxic substances are known causes for this disease in about one third of the patients, the origin of DCM remains largely unclear. In a substantial number of these patients, autoantibodies against cardiac epitopes have been detected and are suspected to play a pivotal role in the onset and progression of the disease2,3. The importance of cardiac autoantibodies is underlined by a hemodynamic improvement observed in DCM patients after elimination of autoantibodies by immunoadsorption3-5. A variety of specific antigens have already been identified2,3 and antibodies against these targets may be detected by immunoassays. However, these assays cannot discriminate between stimulating (and therefore functionally effective) and blocking autoantibodies. There is increasing evidence that this distinction is crucial6,7. It can also be assumed that the targets for a number of cardiotropic antibodies are still unidentified and therefore cannot be detected by immunoassays. Therefore, we established a method for the detection of functionally active cardiotropic antibodies, independent of their respective antigen. The background for the method is the high homology usually observed for functional regions of cardiac proteins in between mammals8,9. This suggests that cardiac antibodies directed against human antigens will cross-react with non-human target cells, which allows testing of IgG from DCM patients on adult rat cardiomyocytes. Our method consists of 3 steps: first, IgG is isolated from patient plasma using sepharose coupled anti-IgG antibodies obtained from immunoadsorption columns (PlasmaSelect, Teterow, Germany). Second, adult cardiomyocytes are isolated by collagenase perfusion in a Langendorff perfusion apparatus using a protocol modified from previous works10,11. The obtained cardiomyocytes are attached to laminin-coated chambered coverglasses and stained with Fura-2, a calcium-selective fluorescent dye which can be easily brought into the cell to observe intracellular calcium (Ca2+) contents12. In the last step, the effect of patient IgG on the cell shortening and Ca2+ transients of field stimulated cardiomyocytes is monitored online using a commercial myocyte calcium and contractility monitoring system (IonOptix, Milton, MA, USA) connected to a standard inverse fluorescent microscope.

The presented method offers a way to detect functional effective cardiotropic autoantibodies in the plasma of patients with dilated cardiomyopathy, irrespective of the specific antigen, by analysing the impact of isolated patient immunoglobulin on cellular shortening and intracellular calcium transients in isolated rat cardiomyocytes.

Medição dos Efeitos de anticorpos sobre a função celular de cardiomiócitos isolados

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

Imunologia e Infecção

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

Investigando os efeitos dos probióticos sobre pneumocócica Colonização Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Adesão Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

Análise dos efeitos de células estromais no recrutamento de leucócitos de Fluxo

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly synthesized allergic, inflammatory and immunoregulatory mediators. MCs&#8217; mediators affect multiple tissues and organs culminating in allergic and immune responses. The synthesis, storage and release of the MC mediators are highly regulated. The pre-formed mediators are packed in cytoplasmic secretory granules&#160;(SG) that fuse with the plasma membrane and release their content by regulated exocytosis. We present a protocol, based on the co-expression of a gene of interest with a reporter gene that is targeted to the SGs and is released in a regulated fashion alongside the endogenous SG mediators. The protocol enables high resolution four dimensional confocal analyses of the MC SGs and monitoring their timeline from biogenesis to triggered exocytosis. Thus, using this protocol for screening genes of interest for their phenotypic and functional impact allows deciphering the molecular mechanisms that govern the biogenesis and exocytosis of the MC SGs and identifying the regulators involved. Thereby, further insights into the cellular mechanisms that account for MCs function in health and disease should be provided.

The goal of the present&#160;protocol was to develop a method that will allow functional genomic analyses of mast cell secretion. The protocol is based on quantitative assessment of the release of a fluorescent reporter gene cotrasfected with the gene of interest and real time&#160;analyses of the secretory granule&#39;s morphology.

Investigando Mastócito Secretory grânulos; de Biossíntese de Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

A Miniaturized Glycan Microarray Ensaio para a Avaliação de avidez e especificidade do Hemaglutininas vírus da gripe A

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate immune system responses during the course of infection. Though methods have been developed to successfully purify and produce many of these important virulence factors, there are still many bacterial toxins whose unique structure or extensive post-translational modifications make them difficult to purify and study in in vitro systems. Furthermore, even when pure toxin can be obtained, there are many challenges associated with studying the specific effects of a toxin under relevant physiological conditions. Most in vitro cell culture models designed to assess the effects of secreted bacterial toxins on host cells involve incubating host cells with a one-time dose of toxin. Such methods poorly approximate what host cells actually experience during an infection, where toxin is continually produced by bacterial cells and allowed to accumulate gradually during the course of infection. This protocol describes the design of a permeable membrane insert-based bacterial infection system to study the effects of Streptolysin S, a potent toxin produced by Group A Streptococcus, on human epithelial keratinocytes. This system more closely mimics the natural physiological environment during an infection than methods where pure toxin or bacterial supernatants are directly applied to host cells. Importantly, this method also eliminates the bias of host responses that are due to direct contact between the bacteria and host cells. This system has been utilized to effectively assess the effects of Streptolysin S (SLS) on host membrane integrity, cellular viability, and cellular signaling responses. This technique can be readily applied to the study of other secreted virulence factors on a variety of mammalian host cell types to investigate the specific role of a secreted bacterial factor during the course of infection.

Here, a method using a permeable membrane insert-based infection system to study the effects of Streptolysin S, a secreted toxin produced by Group A Streptococcus, on keratinocytes is described. This system can be readily applied to the study of other secreted bacterial proteins on various host cell types during infection.

Implementação de um Sistema de Infecção baseado em Inserir Permeável Membrana para estudar os efeitos de secretada bacterianas toxinas em células hospedeiras de mamíferos

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

Citometria de fluxo de partículas ligadas aos Bet v 1 alérgeno no PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Visualizando os Efeitos de escarro no desenvolvimento de biofilmes usando um modelo Chambered lamela

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

-Fluorescência baseado Neuraminidase Ensaio de Inibição Para avaliar a susceptibilidade do vírus influenza A de neuraminidase Inibidor de Classe Antivirais

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Effects of Exposure of Formaldehyde to a Rat Model of Atopic Dermatitis Induced by Neonatal Capsaicin Treatment

Atopic dermatitis is chronically relapsing pruritic eczema and prevails around the world especially in developed countries. Complex interactions between genetic and environmental factors are known to play an important role in the pathophysiology of atopic dermatitis. However, we still lack a detailed picture of the pathogenesis of this disease. Thus, it is of importance to develop appropriate animal models for elucidating the progression of atopic dermatitis. Moreover, investigating the effect of environmental factors such as air pollutants on atopic dermatitis expands understanding of the disease. Here, we describe a method for inducing atopic dermatitis in rats with neonatal capsaicin treatment and a protocol for exposure of a constant concentration of formaldehyde to rats to reveal effects on the development of atopic dermatitis in infantile and adolescent periods. These protocols have been successfully applied to several experiments and can be used for other substances.

We describe here methods for neonatal capsaicin treatment to induce atopic dermatitis in rats and exposure of vaporized formaldehyde to investigate the effects of formaldehyde inhalation on atopic dermatitis.

Efeitos da exposição de formol para um modelo do rato da dermatite atópica, induzido pela capsaicina Neonatal tratamento

Atopic dermatitis is chronically relapsing pruritic eczema and prevails around the world especially in developed countries. Complex interactions between ...