Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo das interações proteicas, permitindo a detecção de novos parceiros de ligação para proteínas extracelulares, tanto em alto rendimento quanto com alta sensibilidade. A principal vantagem deste método é que, com apenas alguns microgramas de proteína, você pode gerar centenas de slides usando a impressora micro array. Use um micro arrayer padrão para impressão de slides.
Este instrumento tem capacidade para 57 slides por corrida, usa uma cabeça de impressão com 48 pinos de manchas e pode acomodar até 8.000 pontos por slide. Gere placas de trabalho utilizando 384 placas de poço a 10 microliters de amostra por poço a partir das placas de estoque. Execute esta etapa manualmente, antes de deslizar usando o micro arrayer.
Em seguida, localizam proteínas com pinos de manchas tipo pena em lâminas de silano epóxi a 60% de umidade para evitar a desidratação das manchas proteicas. A albumina de soro bovino círio cy3 pode ser vista em duplicata entre cada amostra de proteína para visualizar a matriz para a montagem da máscara. Após a impressão, remova os slides da micro matriz de proteínas do ambiente umidificado.
Em seguida, use um fogger ultrassônico para gerar uma fina névoa de solução de bloqueio que se instala na superfície do slide. Em seguida, bloqueie os slides durante a noite com 5% de leite no PBST para promulgar a superfície. Armazene slides a menos 20 graus Celsius em 50% de glicerol para evitar congelamento.
Interações entre proteínas extracelulares são muitas vezes caracterizadas por suas baixas afinidades. Para permitir a detecção dessas interações, aumentando a avidez vinculante, desenvolvemos uma abordagem multivalente baseada na captura da proteína queried expressa como domínios extracelulares marcados pelo FC em micro contas revestidas de proteína A. Gire o IgG portador, que foi rotulado com corante mono reativo Cy5, conforme descrito no protocolo de texto.
Para calcular a razão molar da proteína de consulta e Cy5 IgG, divida o peso molecular da proteína de consulta pelo peso molecular do IgG e multiplique por 40 microgramas por mililitro para determinar a concentração de Cy5 IgG necessária. Uma vez que todas as proporções tenham sido determinadas formam o complexo de proteína de micro contas combinando a consulta marcada fc e o Cy5 IgG com a proteína A micro contas. Misture a suspensão em PBS em um rotador de tubo por 30 minutos em temperatura ambiente, protegido da luz.
Para começar a triagem, aqueça os slides preparados à temperatura ambiente antes de carregar para a estação de hibridização. Para realizar a triagem, primeiro lave a micro matriz com PBST por um minuto para remover glicerol residual. Carregue 200 microlitadores de um miligrama por mililitro de proteína A em PBS 5% de leite e incubar por 30 minutos para prevenir proteínas não complexas Uma micro contas de ligação com proteínas marcadas pela FC que podem estar presentes na micro matriz.
Após a estação de hibridização lavar os slides com PBST, carregue 200 microlitadores do complexo de micro contas de consulta, na presença de um miligrama por milliliter protein A e incubar por 30 minutos. Após a hibridização e lavagem dos slides pela estação de hibridização, enxágue lâminas com água e coloque-as em tubos cônicos individuais de 50 mililitros. Seque os tubos girando a 900 vezes G por cinco minutos.
Finalmente, escaneie os slides com um scanner de micro array apropriado para detectar fluorescência Cy3 e Cy5, excitando em 532 e 635 nanômetros, respectivamente. Mostrado aqui é uma imagem representativa de um slide impresso. Os pontos de albumina de soro bovino rotulados cy3 estão em verde.
As manchas foram impressas em duplicata como controle de qualidade do processo de impressão. Resultados representativos de uma proteína órfã, rastreada para identificação de parceiros de ligação usando a tecnologia de micro array de proteína extracelular, são mostrados aqui. As manchas vermelhas duplicadas são identificadas como um sucesso para a proteína de consulta tela.
Este método que é descrito é altamente versátil e pode ser usado para a impressão de uma gama de bibliotecas proteicas, sejam elas famílias de proteínas específicas ou grandes compilações de proteínas como a nossa. Qualquer proteína de interesse pode ser avaliada. Ao tentar este procedimento é importante manusear os slides com cuidado e garantir que eles não sequem de modo a evitar a perda de atividade das proteínas impressas.
Seguindo a tela de uma proteína de interesse, é altamente aconselhável validar ainda mais quaisquer hits observados usando tecnologias ortogonais, como ressonância de plasmon superficial. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores estudarem interações proteicas extracelulares em humanos.
