Name: isolation and ex vivo culture of vδ1+cd4+γδ t cells, an extrathymic αβt-cell progenitor
Uploaded: 2015-12-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Ex Vivo Culture of VÃŽÂ´1+CD4+ÃŽÂ³ÃŽÂ´ T Cells, an Extrathymic ÃŽÂ±ÃŽÂ²T-cell Progenitor at JoVE.com

Christian Welker is funded by a grant provided by the J&#252;rgen-Manchot-Stiftung.

Declaração de ética: Todos os procedimentos foram realizados de acordo com a Declaração de Helsinki e foi aprovado pelo Comitê de Ética da Clínica da Universidade de Tübingen (projetos 38 / 2009B02 e 470 / 2013B02). 1. Isolamento de Células Mononucleares de Sangue Periférico (PBMC) <ol><li> Tome 50-100 ml de um voluntário saudável por meio de venipunctura usando uma seringa de 50 ml contendo 1000 UI de heparina e sulfato de diluir o sangue 1: 2 com PBS (pH = 7,2). </li><li> Camada cuidadosamente 35 ml de sangue em solução de PBS: solução de separação de 15 ml de sangue, tais como Biocoll (d = 1,077 g / ml) num tubo de 50 ml. Centrifugar durante 15 minutos a 800 xg à temperatura ambiente. NOTA: O freio não deve ser utilizado. </li><li> Recolher as células da camada linfocítica com uma pipeta e lava-se as células duas vezes em, pelo menos, 50 ml de PBS (centrifuga-se durante 12 min; a 400 xg). Remover o sobrenadante após centrifugação com uma pipeta. </li><li> Lyse restantes eritrócitos por suspensão e incubAting a fracção linfocítica com 1-5 ml de uma solução tampão hipotónico para 2-4 min. NOTA: A duração da exposição e do volume de tampão de lise dependem do tampão de lise utilizada e a quantidade de glóbulos vermelhos restantes na fracção de linfócitos. </li><li> Dilui-se as células com PBS (1:10) e centrifugar a 250 xg durante 12 min e, subsequentemente, lavar e ressuspender o sedimento de células uma vez em 10 ml de PBS a 300 xg durante 12 min. </li><li> Ressuspender os linfócitos em PBS e contar as células numa câmara de contagem Neubauer usando solução azul de Tripano. NOTA: Normalmente,&gt; 1 x 10 8 a partir de linfócitos são recebidos 100 ml recentemente tirado sangue periférico. </li></ol> 2. Isolamento de Células T Vδ1 <ol><li> Take &lt;1 x 10 6 linfócitos isolados por um período inicial de FACS que determinam a frequência de células T CD4 Vδ1. NOTA: O tamanho da população desta entidade de células T podem diferir muito entre os indivíduos e de acordo com seu estado imunológico. Neossoloaliado, cerca de 1% das células T são Vδ1 + e cerca de 1-5% de células T CD4 + são Vδ1 +. <ol><li> Dilui-se as células com 1 ml de FACS-tampão, que consiste em PBS contendo FCS a 2% e EDTA 5 mM. Centrifugar a 660 xg durante 2 minutos e decantar o sobrenadante. O volume de tampão de FACS de refluxo cerca de 100 ul é suficiente para a coloração subsequente. Resumidamente vórtex e incubar as células com 5 ul de reagente de Fc-bloqueio durante 5 min à TA, durante o aumento da especificidade da coloração FACS. </li><li> Adicionar anticorpos monoclonais humanos directamente para as células sem remover o reagente de bloqueio de Fc. Certifique-se de corar as células com anticorpos contra Vδ1 (1:50), CD3 (1:50), CD4 (1: 200), CD8 (1: 200) e TCRαβ (01:25). Prepara-se o controlo do isotipo de imunoglobulina com as correspondentes isotipos. Incubar as células com anticorpos durante 20 min a 4 ° C no escuro. </li><li> Lave as células em 1 ml de tampão FACS (centrifugar por 2 min; a 660 xg), decantar o supernatant e proceder à aquisição FACS no volume tampão restante. </li></ol></li><li> Peletizar as células (que não são utilizadas na análise de FACS) por centrifugação durante 12 min; a 300 g; 8 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender a célula pelletin 60 ul MACS-tampão por 1 x 10 7 células. Adiciona-se 20 de Reagente de Bloqueio-Fc? L por 1 x 10 7 células e incubar durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Adicionar 10 ul de anticorpo anti-humano Vδ1 conjugado com FITC por 1 x 10 7 células directamente para as células. Incubar durante 12 min a 4 ° C no escuro. </li><li> Lavam-se as células utilizando 14 mL de tampão-MACS (centrifuga-se durante 12 min; a 300 g; 8 ° C). Elimine o sobrenadante completamente e voltar a suspender as células em MACS tampão 80 ul por 1x10 7 células. </li><li> Tome 1-2 x 10 5 células e diluí-los em tampão FACS 100 ul para verificação da rotulagem por análise FACS. Não são necessários outros aditivos para este passo. Certifique-se de que existe um suficient diferença no brilho para Vδ1 - e células Vδ1 +. Se este não for o caso, repetir os passos 2.3) e 2.4). </li><li> Adicionar 20 pi microesferas anti-FITC por 1 x 10 7 células para as células restantes, misturar bem e incubar durante 15 min no escuro a 4 ° C. Em seguida, lavar as células utilizando MACS ml de tampão de pelo menos 10 (centrifuga-se durante 12 min, a 300 xg; 8 ° C). </li><li> Durante a centrifugação, equilibrar a coluna magnética pré-arrefecida em um íman colocado com 500 ul de tampão MACS. </li><li> Ressuspender as células em 500 ul MACS-tampão (para o número de células maior do que 1 x 10 8, adaptar-se de acordo com este volume) e aplicam-se as células cuidadosamente na coluna. Recolher o flow-through contendo a Vδ1 - células. </li><li> Lava-se a coluna três vezes com 500 ul de tampão-MACS e recolher o fluxo de passagem de novo no mesmo tubo. Note-se que o reservatório tem de estar vazia antes da aplicação na coluna de tampão. </li><li> Remova a coluna do dispositivo magnético e colocá-lo em um tubo cônico de 15 ml. Rapidamente lavar a coluna com tampão de 1 ml por MACS firmemente empurrando o êmbolo para a coluna. Recolher o eluído num tubo. NOTA: De modo a obter um grau de pureza&gt; 98%, é geralmente necessário repetir os passos de 2,7-2,9) com uma segunda coluna. </li><li> Verifique a pureza das células por análise de FACS 18 com o mesmo painel de anticorpos, como anteriormente (ver 2.1.2) e contar as células. </li></ol> 3. Isolamento de Células T + Vδ1CD4 <ol><li> Ressuspender 25 ul de pérolas de CD4 com um vortex para&gt; 30 seg. Lavar as pérolas (a quantidade mínima como descrito pelo fabricante) em 1 ml de tampão de MACS em um tubo de 1,5 ml de reacção, colocando o tubo num íman durante 1 min. Descartar o sobrenadante cuidadosamente com uma pipeta de pequena escala (200 mL) e ressuspender as esferas no volume original de tampão-MACS. </li><li> Pelotizar Vδ1 + células (centrifugar por 12 min; a 300 xg) e aspirar o sobrenadante e ressuspender as células todas Vδ1 + em 500 ul de tampão-MACS e adicioná-los para o tubo contendo os grânulos. Misturar vigorosamente e incubar durante 20 min a 4 ° C com inclinação constante (por exemplo, em um rotor). </li><li> Colocar o tubo contendo as células em um magnete durante 2 min. Certifique-se de que não existem vestígios na tampa. NOTA: As células T CD4 + terá ligado a esferas magnéticas e anexar ao lado do tubo virado para o íman. </li><li> Abra cuidadosamente a tampa, mantendo o tubo no interior do dispositivo magnético e recolher o sobrenadante que contém o CD4 - células Vδ1 + utilizando uma pipeta de pequena escala. Coloque - CD4 + Vδ1 células para um tubo separado e colocar este tubo para o íman de novo para evitar possivelmente remanescente células CD4 ou grânulos a partir da população. <ol><li> Lava-se a CD4 - células em 5 ml de tampão-MACS (centrifuga-se durante 12 min; a 300 xg) umND ressuspender-los em uma concentração de 1 x 10 5 células por 100 uL meios. - Células CD4 pode ser facilmente cultivado sob as condições dadas abaixo (4.2). </li></ol></li><li> Colocar o tubo com os alvos de células CD4 + fora do campo magnético, ressuspender as células em 500 ul de tampão-MACS e colocá-los de volta para dentro do dispositivo magnético. Repita duas vezes os passos de 3,3-3,5 para obter uma pureza mais elevada. Remover o sobrenadante por pipetagem </li><li> Ressuspender as células CD4 + em meio de cultura 100 ul (RPMI 1640, 10% de FCS, 1% de L-glutamina, 1% de penicilina / estreptomicina) e adicionar 10 ul de uma solução destacando-grânulo. Incubar à temperatura ambiente durante 45 min com inclinação constante (por exemplo, em um rotor). </li><li> Colocar as células em um íman durante 1 min. Recolher cuidadosamente o sobrenadante contendo Vδ1 células CD4 + livre-talão com uma pipeta de pequena escala. </li><li> Fora do ímã, voltar a suspender as contas com meios de cultura de 100 ul e repitaos passos 3.6 e 3.7 por duas vezes para se obter números maiores de células de células CD4 +. </li><li> Peletizar as células (centrifugar a 300 xg, durante 12 minutos) e descartar o sobrenadante completamente por pipetagem. Ressuspender as células em meios frescos, pré-aquecido e contá-los. Examinar a pureza das células CD4 + Vδ1 por análise FACS descritos nos passos 2.1.1-2.1.3. </li></ol> A clonagem de células 4. Único por diluição limitada <ol><li> Isolar células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de um dador alogénico como representado na 1,1-1,6. </li><li> Irradiar 2,5 x 10 7 PBMC alogénicas com 80 Gy em 25 ml de meio de cultura utilizando-γ radiação. </li><li> Adicionar IL-2 (200 U / ml), IL-7 (20 ng / ml) e PHA (2 ug / ml) para as células de alimentação irradiadas e distribuí-los em placas de 96 poços formato U, 5 x 10 4 alimentador células em 50 ul por poço. </li><li> Diluir as células Vδ1 CD4 + a uma concentração de 0,3 células por 50 ul. Pipette 50 ul de solução de células em cada cavidade que abriga as células irradiadas e citocinas. NOTA: Assim, as citocinas são diluídas para a concentração final de 100 U / ml de IL-2, 10 ng / ml de IL-7 e 1 ug / ml de PHA. Incubar as placas de 96 cavidades em uma incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2 atmosfera humidificada. <ol><li> Opcionalmente, permanecendo cultivar células purificadas Vδ1 + CD4 + como a cultura em massa sob as mesmas condições de cultura como os clones. </li></ol></li><li> Fornecer as células a cada 3-4 dias com citocinas e meios frescos. Para isso, a troca de metade do meio nos poços com 50 ul de meio fresco por pipetagem. Adicionar concentração duas vezes superior de citoquinas para cada suplementação. Adicionar 5x10 4 células de alimentação irradiadas por poço qualquer outra rodada de alimentação. </li><li> Utilizando um microscópio, observar primeiros clones tornam-se visíveis após 3-4 semanas, como eles metabolizam e, assim, alterar a cor das colónias de meio de cultura e forma. NOTA: Para pelesterap cultivo, ressuspender os clones bem e transferi-los para separar placas de 96 poços. Analisar as células via FACS, conforme indicado na 2.1.1-2.1.3. Clones mantidos nestas condições poderá vir a alterar a sua TCR a partir Vδ1 para αβTCR. O ponto de tempo para esta transdiferenciação varia de clone para clonar. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Para estudar o fenótipo, biologia e função de uma entidade celular escassos (T-), nomeadamente células Vδ1 + T CD4 +, foram utilizados dois marcadores: Vδ1 e CD4 por seu isolamento de células magnético positivo. Vδ1 é um receptor órfão, enquanto que CD4 é expresso em células T auxiliares, a um nível inferior em monócitos e células dendríticas, e a um nível muito baixo em células progenitoras hematopoiéticas. As técnicas para o enriquecimento e a selecção de células com elevada pureza incluem células activadas por fluorescência (FACS), uma técnica que separa uma população de células em sub-populações com base na marcação fluorescente. As células coradas utilizando anticorpos conjugados com fluoróforos podem ser separados uns dos outros dependendo do fluoróforo (s) que se ligaram. Sorters pode conseguir pureza cerca de 98% 19, o que é útil se a única necessidade é a própria classificação. Os inconvenientes desta técnica incluem células separadas que mostram uma diminuição da vi célulacapacidade, e em nossa população-alvo também um potencial reduzido para transdifferention. A viabilidade celular reduzida após a triagem é a hipótese de ser devido às forças de cisalhamento e estresse hidrodinâmico que o FACS impõe células. Além disso, para manter as células viáveis ​​e sem contaminação para a cultura subseqüente, o experimento deve ser realizado em condições estéreis assépticas que é difícil de gerir. Além disso, a separação por FACS recomenda um elevado número de células para a classificação. Os kits de isolamento têm sido desenvolvidos a partir de várias empresas para rotulagem magnética directa e a classificação de células de acordo com vários marcadores de superfície. A estratégia baseia-se na remoção da etiqueta magnética das células após o primeiro tipo, usando um reagente de libertação, o que quer enzimaticamente ou competitivamente remove a etiqueta magnética da estrutura para o qual foi ligado. Isto permite que uma segunda marcação magnética e separação das células para outro marcador de superfície de interesse that é conseguido através de rotulagem directa ou indirecta com esferas magnéticas. A remoção da etiqueta recomenda trabalhar a temperaturas baixas (em gelo, a 2-8 ° C) durante longos períodos de tempo, a exposição a um produto químico e lavagens sucessivas. Se as células alvo do segundo parâmetro de separação estão presentes numa concentração baixa após selecção (&lt;10% de células alvo na fracção positiva após a primeira separação) até uma segunda volta para a remoção de células magneticamente marcadas ofany residuais é necessária. Este procedimento é-além de ter uma perda substancial de células alvo devido ao passos repetidos de lavagem em-risco elevado para a indução de dano celular e perda da função devido a factores de stress mecânicas e fisiológicas. Comparado com FACS classificação no entanto preparações de células permanecem estéreis e os números de células menores podem ser classificados. A estratégia que perseguimos combina duas seleções positivos consecutivamente, no entanto, a remoção da primeira etiqueta não é necessária como o metiquetas agnetic diferem na magnitude de suas forças magnéticas por várias fases de log. Enquanto o primeiro anti-fluorocromo magneticamente marcada tipo de cordão é pequena, com um diâmetro de 50 nm, o segundo agente anti-fluorocromo magneticamente marcada grânulo medidas de tipo 1 a 4,5 mm, ultrapassando assim o volume / força da primeira etiqueta magnética 20 a 90 vezes. Além disso, o segundo tipo positivo omite de stresse celular, que está associado com a coluna de retenção / libertação magnético como células permanecem num frasco de 1,5 ml que é colocado num aparelho magnético de modo que as células marcadas são fixados à parede do frasco. Procedimentos de lavagem pode ser mantido em uma pequena escala. Este protocolo elaborado reduz a perda de células e aumenta a viabilidade celular, desde células experimentam menos manipulação e passar no processo de isolamento mais rápido do que os protocolos que utilizam sistemas de kit de isolamento MULTISORT. Por conseguinte, este protocolo permite separar, mesmo um pequeno número de células e uma outra vantagem: células separadas permanecem sterile durante todo o procedimento. Experiências de clonagem subsequentes utilizando diluição limitante permite a expansão eficiente de membros individuais das células isoladas, aqui a muito escasso Vδ1 + CD4 + T γδ entidade de célula 18. As células seleccionadas mostrar excelente viabilidade e clonogenicidade e permanecem totalmente funcional. Para aplicações futuras, usar essa estratégia para selecionar quantitativamente e purificar entidades de células T pequenas de diversas fontes humanas, incluindo sangue periférico extraído recentemente com sucesso, (mobilizados) produtos de leucaférese, sangue do cordão umbilical e da medula óssea pela combinação de duas seleções positivos consecutivamente realizadas utilizando etiquetas magnéticas que diferem pela magnitude nas suas forças magnéticas e, assim, a capacidade de retenção.

Nos vertebrados, a imunidade adaptativa, que está estruturado na celular e uma parte humoral da imunidade desempenha um papel importante na defesa contra agentes patogénicos. O reconhecimento de uma vasta gama de antigénios é mediada por T-hyperpolymorphic e receptores de células B (TCR / BCR), que diz respeito às células T são assumidos para ser produzida principalmente no timo 1. A esta, as células estaminais hematopoiéticas (HSCs), derivadas de medula óssea, o timo sementes e se diferenciam ao longo de etapas bem definidas, finalmente, que dão origem a todas as linhagens de células T. Timo progenitores de semeadura são CD4 - e CD8 - e constituem, assim, a fração de timócitos imaturos, dupla negativa (DN). Sinais derivados do timo, em seguida, induzir a sua linhagem compromisso e a diferenciação em células T, quer ap ou γδ. A expressão de TCR e TCR-y-ô genes das cadeias funcionalmente rearranjados em DN2 / 3 timócitos leva a y δTCR complexos, que levam uma proliferação celulard promover a diferenciação em células γ AT 2,3. Em contraste, o rearranjo de uma cadeia de TCR-β funcional, que pode emparelhar com preTα para construir um preTCR Pt, induz o silenciamento transcricional da cadeia TCR-γ em timócitos DN3 e a sua passagem em células CD4 + CD8 + duplo-positivos timócitos 4 . Nesta fase, a recombinação da cadeia TCR-α ocorre, a exclusão do locus TCR-δ que se aninha no interior do locus TCR-α, revoga assim a produção de um γδTCR nestas células irrevogavelmente 5-9. ΑβTCRs reorganizados são posteriormente seleccionados pela sua capacidade de se ligar a auto-MHC fracamente (seleção positiva), que não pode exceder um determinado limiar para evitar a auto-imunidade (seleção negativa). De acordo com a sua capacidade de se ligar a MHC de classe I ou II, as células seleccionadas αβT desenvolvem em células de um único positivo CD4 + ou T CD8 +, que a saída do timo células T como naive. No entanto, a involução do timo começa cedo na vida levando a exponencialmente reduziu a produção de células T naive que é quase extinto pós-adolescência 10. No entanto, o tamanho do conjunto de células T permanece constante durante toda a vida, o que pode ser explicado apenas parcialmente por uma proliferação homeostática pós-timo de células T e a proliferação de memória imunológica de longa duração 11. Por conseguinte, o desenvolvimento de células T extrathymic deve ocorrer. Uma pesquisa recente ganhou atração substancial que caracterizou progenitores de células, que αβT-at-extrathymic locais deram origem às células T ap funcional 12-17. No entanto, o conhecimento detalhado sobre precursores de células extrathymic αβT que independente de um timo diferenciam em células αβT é tão fragmentado como o fundo que nós temos na rota tomam assim. Recentemente, identificou a entidade pequeno de células T de Vδ1 + </sup&gt; células T CD4 + como uma αβT γδT prognitor extrathymic célula 18, a qual, quando isolados a partir de sangue periférico de dadores humanos saudáveis, podem transdiferenciar em células αβT num ambiente inflamatório leve. Curiosamente e ao contrário da proliferação homeostática de células T pós-timo, transdiferenciação de células Vδ1 CD4 + gera novos receptores de células T, ampliando assim a diversidade repertório, de modo que, potencialmente, novos antígenos podem ser reconhecidas e podem protecção do hospedeiro contra patógenos recém-adquiridas. Isso aumenta a plasticidade das células T e adiciona um novo caminho até agora pouco apreciado para o desenvolvimento de células T extrathymic. O isolamento quantitativo a partir de fontes linfocítica, a geração de clones de uma única célula e sua expansão eficiente são essenciais para o objectivo de identificar os marcadores e moléculas que desencadeiam essa célula αβT precursor`s desenvolvimento extrathymic.

<table><tbody><tr><td>Biocoll Solution</td><td>Biochrom</td><td>L 6113</td><td>lymphocyte separating solution</td></tr><tr><td>Lysing Buffer</td><td>BD BioSciences</td><td>555899</td><td>lysis of erythrocytes&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MACS buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>supplement with BSA and pre-cool before use</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>not mandatorily from this supplier</td></tr><tr><td>anti-human Vd1 FITC (clone:&amp;nbsp; TS8.2)</td><td>Thermo Scientific</td><td>TCR2730</td><td>not mandatorily from this supplier</td></tr><tr><td>anti-human CD3 PerCP (clone: SK7)</td><td>BD BioSciences</td><td>345766</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31)</td><td>BD BioSciences</td><td>555548</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466)&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-333</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1)</td><td>BD BioSciences</td><td>641400</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>Anti-FITC MultiSort Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-058-701</td><td>yields better results than anti-FITC MicroBeads</td></tr><tr><td>MS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>pre-cool before use</td></tr><tr><td>MiniMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>CD4 Positive Isolation Kit</td><td>life technologies</td><td>11331D</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and ex vivo culture of v&#948;1+cd4+&#947;&#948; t cells, an extrathymic &#945;&#946;t-cell progenitor

O timo, o órgão primário para a geração de células T e ap espinha dorsal do sistema imune adaptativa em vertebrados, tem sido considerada como a única fonte de células αβT. No entanto, a involução do timo começa no início da vida que conduz a uma saída drasticamente reduzido de células αβT naive para a periferia. No entanto, mesmo centenários pode construir a imunidade contra patógenos recém-adquiridas. Uma pesquisa recente sugere o desenvolvimento de células αβT extrathymic, no entanto a nossa compreensão das vias que podem compensar a perda da função do timo são ainda rudimentar. γδ células T são os linfócitos inatos que constituem o principal subconjunto de células T nos tecidos. Recentemente atribuída uma função notável, até agora não apreciado a um subconjunto de células T γδ, mostrando que a entidade escasso de células CD4 + Vδ1 + γδ células T podem transdiferenciar em células αβT em condições inflamatórias. Aqui, nós provide o protocolo para o isolamento do presente progenitoras do sangue periférico e o seu cultivo subsequente. Vδ1 células são enriquecidas a partir de PBMC positivamente de dadores humanos saudáveis ​​usando esferas magnéticas, seguido por um segundo passo em que temos como alvo a fracção escasso de células CD4 + com uma outra técnica de marcação magnética. A força magnética do segundo rótulo for superior a da primeira etiqueta magnética, e assim permite o isolamento positivo eficiente, quantitativa e específico da população de interesse. Em seguida, introduzir o estado da técnica e da cultura requerido para a clonagem eficiente e expansão das células e para a identificação dos clones gerados por análise de FACS. Assim, nós fornecemos um protocolo detalhado para a purificação, a cultura e expansão ex vivo de células T γδ CD4 + Vδ1 +. Este conhecimento é pré-requisito para estudos relacionados a esse αβT progenitor`s celulares biologia e para aqueles que pretendem identify os gatilhos moleculares que estão envolvidos na sua transdiferenciação.

A Figura 1 ilustra as diferentes fases e o resultado do isolamento das células T Vδ1 do sangue periférico. Figura 1A mostra uma distribuição típica das células Vδ1 + em linfócitos CD3 +, bem como a expressão do co-receptor da população Vδ1 +. Neste dador, a frequência de células Vδ1 + (vermelho) é de 2,3% das contagens totais de linfócitos e a expressão de CD4 (verde) de linfócitos Vδ1 + é de 2,6%. No total, a população alvo para isolamento representa 0,06% do total de linfócitos neste dador. A Figura 1B mostra uma intensidade de coloração óptima para as células Vδ1 + antes de prosseguir para a rotulagem magnético. A coloração com o anticorpo primário deve resultar em populações Vδ1 positivos e negativos claramente distintos Vδ1 de modo que as células Vδ1 + podem ser marcados de forma eficiente e separado com o magngrânulos etic. A Figura 1C apresenta as células Vδ1 + após o procedimento de isolamento por análise de FACS. A pureza de Vδ1 + é geralmente&gt; 99% de células CD3 +. Para aumentar a pureza, células isoladas são aplicadas sobre uma segunda coluna de isolamento. Isso resulta em perda de células considerável no entanto, este degraus leva à eliminação quantitativa das células potencialmente contaminando TCRαβ + CD4 +. Os resultados do CD4 + isolamento são mostrados na Figura 2. Devido aos baixos números de células CD4 + Vδ1 células +, e uma vez que as células são expandidos em uma única célula de diluição limitada abordagem de clonagem de pureza das células CD4 + inferior a 100% pode ser tolerado. Na experiência apresentada aqui, a pureza das células CD4 + Vδ1 + foi de cerca de 90% (Figura 2A, blot à direita) e a subsequente clonagem de célula única resultou em mais de 60 Vδ1+ Clones de células T CD4 +. Contrariamente, no Vδ1 + CD4 - fração não CD4 + células permaneceram (Figura 2B), o que evidencia a eficiência dessa estratégia de isolamento. De nota, as células CD4 + (azul) Vδ1 expressar em um nível mais baixo do que distinguíveis CD4 - células (vermelho) (Figura 2A, ambos os borrões). Assim, a coloração de células Vδ1 + deve ser excessiva, tal como descrito no protocolo de rotulagem para um suficiente isolamento bem sucedido e a fracção de células CD4 + dentro da piscina de células Vδ1 + T. Na Figura 3A, o fenótipo típico de um clone que emerge é apresentado. O TCR é composto por um Vδ1 e uma cadeia Vγ9 e as células clonais expressam CD3 e CD4. A Figura 3B mostra o processo de transdiferenciação de um clone isolado com a técnica apresentada. Transdiferenciação inclui os downregulatina da cadeia V&#39;1 a um nível de expressão baixo, a qual é acompanhada pela expressão de novo de uma αβTCR. Isto conduz a um fenótipo de TCR-duplo positivo transiente que dá eventualmente origem a células T que expressam αβTCR-single-positivos. A expressão do co-receptor também podem mudar durante o curso de transdiferenciação. Semelhante a timócitos, um fenótipo CD4 + CD8 + DP pode ocorrer, que eventualmente se desenvolve em qualquer CD8 + αβ T CD4 + ou SP. Sob as condições de cultura aqui apresentados, transdiferenciação é um raro evento de apenas um dos 50 clones mudou sua Vδ1 + TCR em αβTCR. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53482/53482fig1.jpg" /> Figura 1. FACS monitorando todas as fases do processo de isolamento de células T V δ1 a partir de sangue periférico. (A &lt;/ Distribuição forte&gt;) de células Vδ1 + (vermelho) em células de linfócitos de sangue periférico e a sua expressão do co-receptor CD3 +. As células T CD4 + Vδ1 + são indicados em azul (círculo). (B) Coloração da fracção Vδ1 antes de prosseguir para a rotulagem magnético. (C) Análise FACS de células de Vδ1 fracção positiva + após o isolamento. Os números indicam percentagem de células fechadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53482/53482fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53482/53482fig2.jpg" /> Figura 2. Análises FACS de V δ 1 CD4 + isolados (A) células T CD4 + e fracção (B) de CD4 -. Fracçãoapós o isolamento das células T CD4 +. Os números indicam percentagem de células fechadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53482/53482fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53482/53482fig3.jpg" /> Figura 3. A análise fenotípica de um clone logo após a detecção. (A) a composição de TCR e co-expressão de receptores de um clone isolado de fresco. Vδ1 e Vγ9 TCR é co-expressa com CD3 e CD4. (B) Processo de transdiferenciação de um clone de células T CD4 + Vδ1 +. Mudança de expressão TCR (em cima), e mudança de expressão co-receptor (parte inferior) 18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53482/53482fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Isolamento e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura de Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; Células T, γδ um Extrathymic αβT de células progenitoras

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

isolation-ex-vivo-culture-v1-cd4-t-cells-an-extrathymic-t-cell

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

9.3K visualizações.  Children's University Hospital Tübingen. Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Vídeo: Isolation and Ex Vivo Culture of Vδ1+CD4+γδ T Cells, an Extrathymic αβT-cell Progenitor

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Caracterização de Thymic Settling Progenitores no embrião do rato Usando<em&gt; In Vivo</em&gt; E<em&gt; In Vitro</em&gt; Os ensaios

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Biologia do Desenvolvimento

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

Geração de células T específicas Multivirus para Prevenir / tratar infecções virais após transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Imunologia e Infecção

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

Isolamento e Th17 Diferenciação de Linfócitos T CD4 Naïve

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major histocompatibility complex (MHC)-independent manner and develop strong cytolytic effector function that makes it an ideal candidate for cancer immunotherapy. Due to the low frequency of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T cells in the peripheral blood, we developed an effective protocol to greatly expand a highly pure &#947;&#948; T cells drug product for first-in-human use of allogeneic &#947;&#948; T cells in patients with acute myeloid leukemia (AML). Using healthy donor apheresis as an allogenic cell source, the lymphocytes are isolated using a validated device for a counterflow centrifugation method of separating cells by size and density. 
The lymphocyte-rich fraction is utilized, and the &#947;&#948; T cells are preferentially activated with zoledronic acid (FDA-approved) and interleukin (IL)-2 for 7 days. Following the preferential expansion of &#947;&#948; T cells, a clinical-grade magnetic cell-separation device and TCR&#945;&#946; beads are used to deplete contaminating T-cell receptor (TCR)&#945;&#946; T cells. The highly enriched &#947;&#948; T cells then undergo a second expansion using engineered artificial antigen-presenting cells (aAPCs) derived from K562 cells-genetically engineered to express single-chain variable fragment (scFv) for CD3 and CD28, 41BBL (CD137L) and IL15-RA-together with zoledronic acid and IL-2. Seeding all day-7 enriched &#947;&#948; T cells in co-culture with the aAPCs facilitates the manufacture of highly pure &#947;&#948; T cells with an average fold expansion of &gt;229,000-fold from healthy donor blood.

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta &#947;&#948; T Cells from Apheresed Human Product

Presented is a protocol for the expansion of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T cell drug product. Lymphocytes are isolated by elutriation and &#947;&#948;-enriched with zoledronic acid and interleukin-2. Alpha-beta T cells are depleted using a clinical-grade magnetic separation device. The &#947;&#948; cells are co-cultured with K562-derived, artificial antigen-presenting cells and expanded.

Expansão e enriquecimento de células T Gama-Delta (γδ) do produto humano aferido

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

Pesquisa do câncer

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Rato Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento de células T e<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciação em subpopulações de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have been conducive to downstream in vivo functional analysis of TCR heterodimers. We have developed an improved protocol based on a two-step multiplex-nested PCR, which results in a PCR product that spans entire variable regions of a human TCR alpha and beta chains. By identifying unique restriction sites and incorporating them into the PCR primers, we have made the PCR product compatible with direct sub-cloning into the template retroviral vector. The resulting retroviral construct encodes a chimeric human/mouse TCR with a mouse intracellular domain, which is functional in mouse cells or in in vivo mouse models. Overall, the protocol described here combines human single cell paired TCR alpha and beta chain identification with streamlined generation of retroviral vectors readily adaptable for in vitro and in vivo TCR expression. The video and the accompanying material are designed to give a highly detailed description of the single cell PCR, so that the critical steps can be followed and potential pitfalls avoided. Additionally, we provide a detailed description of the cloning steps necessary to generate the expression vector. Once mastered, the whole procedure from single cell sorting to TCR expression could be performed in a short two-week period.

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

The current protocol combines single cell paired human TCR alpha and beta chain sequencing with streamlined generation of retroviral vectors compatible with in vitro and in vivo TCR expression.

Aerodinâmico única célula TCR isolamento e geração de vetores retrovirais para In Vitro e In Vivo de expressão de TCRs humanas

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have ...

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high mortality, despite new therapeutic options such as transcatheter aortic valve replacement (TAVR). 
The complete pathways that start with valve calcification and lead to severe aortic stenosis remain only partly understood. By providing a close representation of the aortic valve cells in vivo, the assaying of T lymphocytes from stenotic valve tissue could be an efficient way to clarify their role in the development of calcification. After surgical excision, the fresh aortic valve sample is dissected in small pieces and the T lymphocytes are cultured, cloned then analyzed using fluorescence activated cell sorting (FACS).
The staining procedure is simple and the stained tubes can also be fixed using 0.5% of paraformaldehyde and analyzed up to 15 days later. The results generated from the staining panel can be used to track changes in T cell concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific T cell subtypes of interest. In this study, we show the isolation of T cells, performed on fresh calcified aortic valve samples and the steps of analyzing T cell clones using flow cytometry to further understand the role of adaptive immunity in CAVD pathophysiology.

In this study, we describe the process of T lymphocyte isolation from fresh samples of calcified aortic valves and the analytical steps of T cell-cloning for the characterization of the adaptive leukocyte subsets by using flow cytometry analysis.

Investigando a calcificação da válvula aórtica através do isolamento e cultura de linfócitos T usando células alimentadoras do casaco de buffy irradiado

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...

<meta charset="utf8"></head><body>Técnica de imagem de alta resolução para detecção de microdomínios de Ca2+ em células T

Imaging Initial Ca2+ Microdomains in Primary T Cells

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and might already determine the fate of a T cell. Upon T cell receptor activation, NAADP is formed rapidly, binding to NAADP binding proteins (HN1L/JPT2, LSM12) and their respective receptors (RyR1, TPC2) sitting on intracellular Ca2+ stores, like the ER and lysosomes, and leading to subsequent release and elevation of [Ca2+]i. To capture these fast and dynamically occurring Ca2+ signals, we developed a high-resolution imaging technique using a combination of two Ca2+ indicators, Fluo-4 AM and FuraRed AM. For postprocessing, an open-source, semi-automated Ca2+ microdomain detection approach was developed based on the programming language Python. Using this workflow, we are able to reliably detect Ca2+ microdomains on a subcellular level in primary murine and human T cells in high temporal and spatial resolution fluorescence videos. This method can also be applied to other cell types, like NK cells and murine neuronal cell lines.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Desvendando a ativação inicial da resposta imune adaptativa para intervenção terapêutica

Here, we provide a comprehensive protocol to resolve initial local Ca2+ signals, known as Ca2+ microdomains, in primary murine and human T cells using fluorescence microscopy. This protocol serves as a valuable resource for researchers examining Ca2+ signaling pathways within immune cells and to further unravel their function.

Imagem de microdomínios iniciais de Ca2+ em células T primárias

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and ...

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Imagem de microdomínios iniciais de Ca²⁺ em células T primárias

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