Gostaríamos de agradecer ao Dr. Julie Gordon e Dr. Nancy Manley para o seu conselho útil com a técnica de cultura. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Glaucoma Infantil e Sharon-Stewart Aniridia Research Trust.

Rato cultura de embriões: Todos os procedimentos experimentais foram realizados em estrita conformidade com Instituto Nacional de diretrizes de saúde seguindo o protocolo # A2010 07-119, que foi analisado e aprovado pela Universidade de Georgia Institutional Animal Care e do Comitê Use, que mantém a supervisão regulamentar continuou. 1. Preparação de Meios de Cultura <ol><li> Preparar meio de cultura utilizando a mídia e os suplementos de células-tronco disponíveis comercialmente nos seguintes valores: Knockout DMEM, KnockOut Serum Replacement (KSR) (10%), N-2 Suplemento (1x), albumina, a partir de soro bovino (2%), penicilina ( 50 UI / ml), estreptomicina (50 ug / ml) e anfotericina-B (1,25 ug / ml). O meio de cultura preparado é semelhante ao anteriormente descrito 15, com as seguintes alterações: a adição de anti-mycotics e utilizando o dobro da concentração de antibióticos (para detalhes de reagentes e equipamentos específicos, ver Liº de Materiais). Nota: a concentração de antibióticos como utilizado anteriormente (. Moore-Scott, 15 e outros) foi suficiente para culturas de embriões realizadas até 24 horas período de tempo. No entanto, quando a cultura foi prorrogado para além de 24 horas, tivemos a contaminação da cultura e esta foi controlada com sucesso através da duplicação da concentração de antibiótico. </li><li> Armazenar os componentes de media, a 4 ° C ou a -20 ° C, conforme as recomendações do fabricante. KSR e N-2 suplemento deve ser armazenado em alíquotas a -20 ° C para evitar o congelamento e descongelamento repetidos. KnockOut DMEM uma vez aberto deve ser utilizado no prazo de 30 dias, por recomendação do fabricante. Antes de usar, aquecer os componentes em um banho de água a 37 ° C. </li><li> Prepare a mídia em condições estéreis. Desinfetar a superfície de todos os equipamentos e frascos contendo os componentes de mídia com 70% spray de álcool antes de colocá-los na capa de cultura. </li><li> Os componentes do meio podem ser misturados ou num copo esterilizado, ou directamente no sistema de filtro (Corning). Primeiro adicione o pó de albumina para o KnockOut DMEM. Misturar bem, agitando suavemente até a albumina se dissolva completamente. Em seguida, adicione o N-2 Suplemento, KSR e os antibióticos e misture bem com uma pipeta. Em seguida, filtrar esterilizar os meios de comunicação utilizando um filtro de 0,22 mM tamanho dos poros com sucção a vácuo. Dispensar a mídia em tubos de 50 ml e armazenar cônicas a 4 ° C até ser usado. Os meios de comunicação, uma vez preparados devem ser utilizados dentro de 4-5 dias para a cultura. </li></ol> 2. Preparação do Equipamento Cultura <ol><li> Esterilizar os frascos de cultura de vidro e rolhas de borracha. Enrole as garrafas de cultura em uma folha de alumínio e colocar as rolhas de borracha em um copo de água e esterilizar em autoclave. </li><li> Esterilizar a câmara de cultura (Unidade de precisão Incubadora) com 70% de álcool de pulverização e aquecer a 37 ° C antes de iniciar a cultura. A câmara de cultura é ebrincou com um disco de rolamento no centro que detém as garrafas de cultura. O fluxo de gás para dentro da câmara é regulada por um medidor de pressão e a taxa de fluxo pode ser ajustada por meio da observação do fluxo de saída de bolhas de ar através de água em um tubo de vidro no final. Este aparelho cultura garrafa rolando é uma versão modificada do aparelho original introduzidas pelo Novo e Cockcroft 17. </li><li> Conectar um cilindro de gás contendo uma mistura gasosa de 95% O2 / 5% de CO 2 para a câmara de cultura e ajustar o fluxo de gás para &quot;uma bolha de ar por segundo&quot;, que dá uma taxa de fluxo de 50 cc / min, e assegura o fornecimento adequado de oxigénio para os embriões cultura. </li></ol> 3. Rato Embryo Coleta e Preparação para a Cultura <ol><li> Para obter o tipo de embriões de rato selvagens, utilizamos camundongos C57BL/6J e de CD-1 (Charles River Laboratories) cepas de fundo genético. </li><li> Confira os ratos fêmea para plugs vaginais todas as manhãs dia. O meio-dia do dia de encontrar ªe tampão vaginal, deve ser considerado como E0.5 dpc (dias pós-coito). </li><li> Coletar embriões de camundongos em E10.5 dpc por eutanásia das ratas grávidas seguindo protocolos padrão. Os camundongos foram sacrificados utilizando um dispositivo de inalação de CO 2, conforme especificado pela American Veterinary Medical Association (AVMA) Diretrizes para a eutanásia de animais (2013). Para segurar a morte, luxação cervical foi realizado após a exposição ao CO 2. </li><li> Spray de etanol a 70% sobre a superfície abdominal ventral para evitar a aderência de cabelo abdominal para os instrumentos. Em seguida, abrir a cavidade abdominal ventral utilizando uma tesoura afiada romba de funcionamento e um par de 4-3/4 em microdissecting fórceps para localizar o útero. Utilizando um fórceps 4 em microdissecting levantar todo o útero e separá-lo do corpo por corte com uma tesoura de luz de funcionamento no corpo uterino e nas pontas dos cornos uterinos. </li><li> Enxaguar rapidamente todo o útero em 1x PBS aquecido a 37 ° Cpara remover qualquer colagem de sangue para o útero e colocar imediatamente em DMEM aquecido a 37 ° C em uma placa de Petri. Esterilizar os instrumentos em 70% spray de etanol antes de nova utilização. Nota: O pré-aquecimento das soluções, incluindo o PBS, DMEM e o meio de cultura e a sua manutenção a 37 ° C durante todo o procedimento é recomendado. </li><li> Sob um microscópio de dissecação, o útero deve ser segmentally dissecado com uma luz tesoura operacionais. Isto resulta em pequenas aberturas em cada lado do útero segmentada, através do qual um par de modificados (extremidades embotadas) pinças microdissecting pode ser inserido suavemente para alargar a abertura. Isto permite que a exposição do decidua placentário, que pode então ser removido por arrancamento suavemente com um par de pinças microdissecting para expor o saco vitelino parietal (PYS) com a membrana de Reichert. Utilizando uma ponta de perfurar as pinças suavemente membrana de Reichert, juntamente com os PYS e separar the subjacente saco vitelino visceral (VYS) camada de expor os embriões com VYS intactas. O cone ectoplacental e os derivados trofoectoderma pode ser removido quer com a decídua placentária ou com a membrana de Reichert. Cuidados devem ser tomados para evitar a ruptura do VYS como os embriões sair imediatamente. </li><li> Os embriões com VYS intactas deve então ser transferido para uma placa de Petri contendo o meio de cultura aquecido a 37 ° C utilizando uma pipeta de transferência de plástico. Nota: Transferência para o meio de cultura imediatamente após a separação do útero ajuda para um melhor desenvolvimento do embrião em cultura. </li><li> Uma pequena abertura deve ser feito no saco vitelino com um par de pinças microdissecting evitando grandes vasos sanguíneos. Um par de pinças acentuada pode ser usada para fazer a abertura por perfuração suavemente numa área adjacente à região de cabeça. Alternativamente, dois pares de pinças sem corte pode ser utilizado para segurar o saco vitelino e suavemente rasgar para fazer uma pequena abertura.Então alargar suavemente a abertura expandindo com a pinça a um tamanho suficiente para caber a cabeça embrionária. A membrana amniótica, que é envolver estreitamente o embrião deve ser realizada suavemente para fora do corpo e rasgado usando um par de pinças. A cabeça embrionária e depois todo o embrião deve ser suavemente exteriorizado partir do saco vitelino, mantendo a integridade da vasculatura embrionária com o do saco vitelino 15. Nota: Qualquer dano à vasculatura saco vitelino podem potencialmente afetar o desenvolvimento do embrião em cultura. Tais embriões com vasculatura danificada não devem ser utilizados para a cultura e pode ser utilizado para encenar os embriões que podem mais tarde ser descartados. </li><li> Critérios de estadiamento Embrionárias: Examinar os embriões sob o microscópio de dissecação e de grupo por critérios morfológicos, incluindo corpo e tamanho da cabeça, membros e morfologia do olho e estágio através da contagem do número de somite (s) por pelo menos dois embriões de cada grupo. &lt;strong&gt; Nota: Normalmente embriões obtidos a partir da mesma ninhada apresentam diferenças de desenvolvimento no útero e diferem no tamanho do corpo, características morfológicas e número de somitos. No entanto, descobrimos que os embriões agrupados por nossos critérios morfológicos geralmente exibiram número somite semelhante (± 1). Por esta razão, não é necessário contar somitos de cada embrião como esta iria atrasar o tempo para o início da cultura. Nota: Não usar os embriões que foram usados ​​para contar os somitos para a cultura. Contagem de somitos após o início da cultura de outros embriões de modo a evitar o atraso de tempo no início da cultura. Os embriões que foram retardados de cultura depois da separação do útero geralmente exibem fraca desenvolvimento. </li><li> Transferir os embriões imediatamente para uma placa de Petri com meio de cultura fresco aquecido a 37 ° C e levá-la para a capa de cultura, onde os embriões devem ser novamente transferido para uma placa de Petri com cultur estérile mídia antes de colocá-los em frascos de cultura com meio para iniciar a cultura. Nota: As múltiplas transferências de mídia para os embriões antes de cultura ajuda na prevenção de contaminação como as diferentes etapas de colheita de embriões e dissecção foram realizados sob um microscópio de dissecação que não foi instalado na capa de cultura. Nota: Quando o tamanho da ninhada é grande (&gt; 12 embriões), processo de metade dos embriões e iniciar a cultura ou colocá-los em um prato com meio de cultura e colocá-lo em uma incubadora de CO 2 a 37 ° C. Quando os embriões foram deixados de fora por períodos mais longos (&gt; 35-40 min) observou-se o coração desacelerar e isso vai afetar o posterior desenvolvimento da cultura. </li></ol> 4. Cultivar embriões de camundongos <ol><li> Abra as garrafas de cultura autoclavado na capa de cultura e etiquetá-las corretamente. Transferência de 3 ml de meio de cultura aquecido a 37 ° C para cada um dos the garrafas e, em seguida, os embriões de rato deve ser transferido suavemente nos frascos de cultura, utilizando pipetas de transferência de plástico esterilizadas. As garrafas de cultura deve, então, ser cobertas com as rolhas de garrafas de borracha, que ajudam a segurar as garrafas de cultura para o disco do rolamento no aparelho de cultura. Nota: Os frascos de cultura com os meios de comunicação podem ser preparado e colocado sobre o disco de laminagem do aparelho de cultura antes da eutanásia dos ratos. Isto encurta o tempo para a transferência de embriões para os frascos de cultura. Nota: os embriões do rato podem ser cultivadas individualmente ou como co-culturas com dois ou três embriões no mesmo frasco de cultura. </li><li> As garrafas de cultura deve ser assepticamente transportados para o aparelho de cultura a 37 ° C e força-las para ligar os furos na disco do rolamento com as rolhas de borracha. Ligue o disco de rolamento para girar a uma velocidade constante de 35 rotações por minuto (rpm), que permite a flutuação livre do embryos na mídia e também ajuda na troca de gás livre pelo tecido embrionário. O gás do cilindro ligada à câmara de cultura flui através do disco do rolamento e as rolhas de borracha nas garrafas de cultura. </li><li> Cultura dos embriões para 16-40 horas e verificar regularmente para o escoamento de gás e temperatura da câmara de cultura. Nota: manipulação de embrião de rato em cultura: Deixe os embriões se adaptar às condições de cultura, pelo menos, 30 min. Em seguida, os embriões que mostram um desempenho fraco e batimento cardíaco fraco pode ser descartada e os embriões restantes podem ser utilizadas para estudos de manipulação. Manipulações de embrião, tais como 5,9,16 electroporação, micro-injecções 18, o implante de talão 16, de tratamento de droga e outros procedimentos pode ser realizada nesta altura. Foi realizada com sucesso a implantação de agarose Affi-gel tratada com determinadas moléculas de sinalização para estudar o seu papel no desenvolvimento do olho adiantada. Os embriões depoismanipulações podem ser devolvidos num meio fresco e continuaram em cultura. </li><li> Substitua os meios de cultura totalmente com meios frescos em intervalos específicos após 9-10 horas e 18-19 horas de cultura quando a cultura foi mantida por 40 horas. Nota: A substituição meios de cultura não pode ser necessária se a cultura é parado por 16-18 horas. </li><li> Medidas de sucesso na cultura: a sobrevivência embrionária em cultura devem ser determinados pelo batimento cardíaco visível e circulação do sangue no corpo, enquanto o crescimento embrionário na cultura deve ser avaliada pelo aumento do tamanho do corpo, número somite e desenvolvimento morfológico de cabeça, membros, coração e os olhos. </li><li> No útero desenvolvido em embriões E11.0 dpc (~ 40-41 s) e E12.0 dpc (~ 49-50 s) devem ser utilizados como controlos para comparação de embriões cultivados em 16-18 horas e 38-40 horas, respectivamente. </li><li> O desenvolvimento embrionário em diferentes pontos de tempo durante a cultura e para em fases utero pode ser captrado sob microscópio de dissecação. Software de imagem local foi utilizado para capturar as imagens e posteriormente processadas utilizando o software de processamento de imagem. </li></ol>

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Não temos quaisquer interesses financeiros concorrentes.

Embriões fase mid-gestação de ratinho foram cultivadas num meio de cultura livre de soro, numa atmosfera de 95% O2 / 5% de CO 2, num aparelho de cultura de garrafa de rolamento a 37 ° C. O desenvolvimento embrionário ex útero foi criticamente dependente de vários factores, em cada passo durante o processo a partir do momento que o útero é isolado a partir de murganhos sacrificados para a realização da cultura (Figura 1). O fator mais importante que influenciou o...

In vitro, utilizando métodos de cultura de embriões inteiros são adequados para estudar mecanismos de sinalização envolvidos na organogênese embrionária que são de outra maneira difícil acesso no útero. Embriões inteiros fornecer a integridade dos tecidos e apoio adequado para as interações de tecido que são cruciais para a ocorrência oportuna de mecanismos de sinalização essenciais para diferentes processos celulares, durante a organogénese. Enquanto as culturas de embriões inteiros fornecer uma plataforma para uma infinidade de aplicações, tais como estudos de transplante, manipulações genéticas e de tecidos, estudos de implantação do grânulo, estudos toxicológicos, etc., Sistemas de cultura de embriões atualmente utilizados são principalmente dependentes de soro para o crescimento e manutenção dos embriões na cultura 1-9. O soro foi utilizado como um dos principais componentes que variam entre 10-100% do meio de cultura de 6-8, 10, 11.; No entanto, a composição do soro não está bem definida e pode variar de animal para animal e cada vez que o soro é recolhido. Enquanto preparação laboratorial de soro é demorado e envolve procedimentos rigorosos, o soro obtido exibe comercialmente considerável variabilidade entre lotes diferentes e aumenta os custos experimentais. A estes, o soro pode conter factores desconhecidos, como factores de crescimento, hormonas, ou outras proteínas, o que pode, potencialmente, afectar o resultado de certas experiências, especialmente aqueles que envolvem o estudo de moléculas de sinalização importantes em interacções de tecidos. Estudos têm mostrado que a adição de soro para a cultura pode potencialmente alterar os níveis intracelulares de determinadas moléculas de sinalização, tais como o monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) e de proteínas envolvidas na sinalização mitogénica e fosfoinositida 3 (PI3), as vias de sinalização da cinase 12-14. Contrariamente a isso, um sistema de cultura isento de soro, proporciona as vantagens de ambiente antigénio livre,abstinência de enzimas biologicamente ativas que podem alterar os processos celulares e permite a consistência entre experimentos. No presente estudo, utilizámos um meio de cultura isento de soro preparado a partir de células-tronco suplementos media comercialmente disponíveis para a cultura da fase mid-gestação de embriões inteiros de uma atmosfera de 95% O2 / 5% de CO 2, num aparelho de cultura de garrafa de rolamento a 37 ° C 15,16. Mouse embriões cultivados em 16 a 40 horas sob estas condições definidas apresentaram progressão para o desenvolvimento morfológico de corpo e diferentes estruturas embrionárias gerais, tais como o coração, membros, cérebro e olhos, indicando níveis adequados de proliferação celular, a migração, a diferenciação e as interacções de tecidos. A análise molecular do desenvolvimento embrionário em cultura por um dos sistemas de órgãos complexos como o olho revelou o desenvolvimento ocular para ser coerente com o observado no tecido ocular em embryos desenvolvendo no útero (Kalaskar e Lauderdale, em preparação). Assim, mostramos que os embriões de rato cultivadas em fase mid-gestação, apresentam um crescimento progressivo e desenvolvimento morfológico comparável à observada nos embriões em desenvolvimento in utero.

<table><tbody><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>Stock: 100x</td></tr><tr><td>Albumin, from Bovine Serum</td><td>Sigma</td><td>A9418-50G</td><td>Stock: 100%</td></tr><tr><td>Antibiotic - Antimycotic Solution</td><td>Cellgro</td><td>30-004-Cl</td><td>Stock: Penicillin (10,000 IU/ml); Streptomycin (10,000 &amp;micro;g/ml; Amphotericin (250 &amp;micro;g/ml)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Precision Incubator Unit</td><td>B.T.C. Engineering Milton Cambridge England</td><td>Id.No. 840-374</td><td></td></tr><tr><td>Glass Bottles for Rotating Unit</td><td>B.T.C. Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicone Rubber Cork</td><td>B.T.C. Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Cylinder</td><td>AirGas Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi SV6 Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Water Jacketed Incubator</td><td>Forma Scientific</td><td>Model: 3110</td><td></td></tr><tr><td>Culture Hood</td><td>Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2</td><td>Model: Nu-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>IsoTemp205</td><td></td></tr><tr><td>Weigh Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>AG285</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Tube, 50 ml</td><td>Corning</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>Light Operating Scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>Operating Sharp-Blunt Scissors&amp;nbsp;</td><td>Roboz</td><td>RS-6812</td><td></td></tr><tr><td>Microdissecting Forceps, 4 in</td><td>Roboz</td><td>RS-5211</td><td></td></tr><tr><td>Microdissecting Forceps - Hudson (cWALD), 4-3/4 in</td><td>Roboz</td><td>RS-5237</td><td></td></tr><tr><td>Microdissecting Tweezers (5/45)</td><td>Roboz</td><td>RS-5005</td><td>Modified - Sharp ends were made blunt</td></tr><tr><td>Microdissecting Tweezers (5)</td><td>Roboz</td><td>RS-5060</td><td>Modified - Sharp ends were made blunt</td></tr><tr><td>Microdissecting Tweezers (55)</td><td>Roboz</td><td>RS-5063</td><td>Modified - Sharp ends were made blunt</td></tr><tr><td>Instrument Tray</td><td>Roboz</td><td>RT-1401S</td><td></td></tr><tr><td>Instrument Tray Lid</td><td>Roboz</td><td>RT-1401L</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish-100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>087571Z</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish-60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish-35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875711YZ</td><td></td></tr><tr><td>Filter System ( 0.22 &amp;micro;m Cellulose Acetate)-150 ml</td><td>Corning</td><td>431153</td><td></td></tr><tr><td>Filter System (0.22 &amp;micro;m Cellulose Acetate)-250 ml</td><td>Corning</td><td>430756</td><td></td></tr><tr><td>Filter System (0.22 &amp;micro;m Cellulose Acetate)-500 ml</td><td>Corning</td><td>430758</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-aid Pipettor</td><td>Drummond Scientific Co.</td><td>D57849</td><td></td></tr><tr><td>Serological Pipette-10 ml</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Serological Pipette-25 ml</td><td>Corning</td><td>4251</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Pipette - 7.7 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>202-20S</td><td></td></tr></tbody></table>

mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system

Embriões fase mid-gestação de rato foram cultivadas utilizando um meio de cultura isento de soro preparado a partir de células-tronco suplementos media comercialmente disponíveis em um sistema de cultura em frasco de rolamento oxigenado. Mouse embriões em E10.5 foram cuidadosamente isolada do saco vitelino com útero intacto e num processo que envolve a manobra cirúrgica precisa os embriões foram gentilmente exteriorizado partir do saco vitelino, enquanto mantém a continuidade vascular do embrião com o saco vitelino. Em comparação com os embriões preparados com saco vitelino intacta ou com o saco vitelino removidos, estes embriões apresentaram a taxa de sobrevivência superior e progressão do desenvolvimento, quando cultivadas sob condições semelhantes. Mostramos que estes embriões de ratinho, quando cultivadas num meio definido em uma atmosfera de 95% O2 / 5% de CO 2, num aparelho de cultura de garrafa de rolamento a 37 ° C durante 16-40 horas, exibem crescimento e desenvolvimento morfológico comparável à os embriões em desenvolvimento no útero. Acreditamos ªé o método será útil para pesquisadores que necessitam de utilizar a cultura do embrião inteiro para estudar interações de sinalização importantes na organogênese embrionária.

Desenvolvimento de embriões de ratinho ex utero depende de múltiplos factores, a partir do momento em que o útero é isolado a partir do corpo para o momento em que os embriões são cultivados. Como representado na Figura 1, o processo envolve uma série de passos, incluindo, a separação do útero grávido do corpo (Figura 1A), isolamento de embriões com saco vitelino intacta (Figura 1B), exteriorização dos embriões a partir do saco vitelino ( <strong...

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Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Soro utilizado em culturas de embriões contém componentes desconhecidos que podem afetar o resultado de experimentos especialmente em estudos que envolvem interações de sinalização. Aqui, utilizamos um sistema de cultura oxigenado sem soro e mostram que os embriões no meio da gestação rato cultivadas durante 16-40 horas apresentam desenvolvimento morfológico comparável aos embriões em desenvolvimento in utero.

Rato Desenvolvimento Embrionário em todo um sistema de cultura de embriões sem soro

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

mouse-embryonic-development-serum-free-whole-embryo-culture

Research

JoVE Journal

Biology

25.7K visualizações.  University of Georgia.  Soro utilizado em culturas de embriões contém componentes desconhecidos que podem afetar o resultado de experimentos especialmente em estudos que envolvem interações de sinalização. Aqui, utilizamos um sistema de cultura oxigenado sem soro e mostram que os embriões no meio da gestação rato cultivadas durante 16-40 horas apresentam desenvolvimento morfológico comparável aos embriões em desenvolvimento in utero. 

Vídeo: Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Diferenciação Neural of Mouse Células-Tronco Embrionárias em soro livre de cultura em monocamada

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Biologia do Desenvolvimento

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

Reprogramação do rato embrionárias fibroblastos com Fatores de transcrição para induzir um Programa hegemônicos

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture

Genetic mouse models are an important tool in the study of mammalian neural tube closure (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010). However, the study of mouse embryos in utero is limited by our inability to directly pharmacologically manipulate the embryos in isolation from the effects of maternal metabolism on the reagent of interest. Whether using a small molecule, recombinant protein, or siRNA, delivery of these substances to the mother, through the diet or by injection will subject these unstable compounds to a variety of bodily defenses that could prevent them from reaching the embryo. Investigations in cultures of whole embryos can be used to separate maternal from intrinsic fetal effects on development.
Here, we present a method for culturing mouse embryos using highly enriched media in a roller incubator apparatus that allows for normal neural tube closure after dissection (Crockett, 1990). Once in culture, embryos can be manipulated using conventional in vitro techniques that would not otherwise be possible if the embryos were still in utero. Embryo siblings can be collected at various time points to study different aspects of neurulation, occurring from E7-7.5 (neural plate formation, just prior to the initiation of neurulation) to E9.5-10 (at the conclusion of cranial fold and caudal neuropore closure, Kaufman, 1992). In this protocol, we demonstrate our method for dissecting embryos at timepoints that are optimal for the study of cranial neurulation. Embryos will be dissected at E8.5 (approx. 10-12 somities), after the initiation of neural tube closure but prior to embryo turning and cranial neural fold closure, and maintained in culture till E10 (26-28 somities), when cranial neurulation should be complete.

A method allowing for direct pharmacological manipulation of mouse embryos during neurulation that bypasses maternal metabolism is described. The technique can be adapted to study different aspects of neurulation by varying the time point and pharmacological agent.

Fechamento do tubo neural no embrião do rato Cultura Whole

Genetic mouse models are an important tool in the study of mammalian neural tube closure (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010).  However, the study of mouse ...

Neurociência

Collection of Serum- and Feeder-free Mouse Embryonic Stem Cell-conditioned Medium for a Cell-free Approach

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field of regenerative medicine. However, despite their benefits, the tumorigenic potential of ESCs and iPSCs has long been a barrier for clinical applications. Interestingly, it has been shown that ESCs produce several soluble factors that can promote tissue regeneration and delay cellular aging, suggesting that ESCs and iPSCs can also be utilized as a cell-free intervention method. Therefore, the method for harvesting mouse embryonic stem cell (mESC)-conditioned medium (mESC-CM) with minimal contamination of serum components (fetal bovine serum, FBS) and feeder cells (mouse embryonic fibroblasts, MEFs) has been highly demanded. Here, the present study demonstrates an optimized method for the collection of mESC-CM under serum- and feeder-free conditions and for the characterization of mESC-CM using senescence-associated multiple readouts. This protocol will provide a method to collect pure mESC-specific secretory factors without serum and feeder contamination.

This protocol provides a method for the collection of mouse embryonic stem cell (mESC)-conditioned medium (mESC-CM) derived from serum (fetal bovine serum, FBS)- and feeder (mouse embryonic fibroblasts, MEFs)-free conditions for a cell-free approach. It may be applicable for the treatment of aging and aging-associated diseases.

Coleção de sérica e sem Alimentador rato-tronco embrionárias Médio condicionado celular para uma abordagem livre de celular

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Sistema baseado em microinjeção para na implantação de Vivo do Cardiomyocytes embrionárias no embrião aviária

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Um Ex-ovo Sistema de Cultura de embriões de frango Indicado para aplicações de imagem e Microcirurgia

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

Biologia

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. Platforms have been recently developed for highly robust and prolonged ex utero culture of mouse embryos from egg-cylinder stages until advanced organogenesis. These platforms enable appropriate and faithful development of pregastrulating embryos (E5.5) until the hind limb formation stage (E11). Late gastrulating embryos (E7.5) are grown in rotating bottles in these settings, while extended culture from pregastrulation stages (E5.5 or E6.5) requires a combination of static and rotating bottle cultures. In addition, sensitive regulation of O2 and CO2 concentration, gas pressure, glucose levels, and the use of a specific ex utero culture medium are critical for proper embryo development. Here, a detailed step-by-step protocol for extended ex utero mouse embryo culture is provided. The ability to grow normal mouse embryos ex utero from gastrulation to organogenesis represents a valuable tool for characterizing the effect of different experimental perturbations during embryonic development.

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

An enhanced platform for whole-embryo culture allows continuous and robust ex utero development of postimplantation mouse embryos for up to six days, from pregastrulation stages until advanced organogenesis. In this protocol, we detail the standard procedure for successful embryo culture using static plates and rotating bottle systems.

Ex Utero Cultura de Embriões de Camundongos de Pregastrulation a Organogênese Avançada

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. ...

Live Imaging of Early Cardiac Progenitors in the Mouse Embryo

The first steps of heart development imply drastic changes in cell behavior and differentiation. While analysis of fixed embryos allows studying in detail specific developmental stages in a still snapshot, live imaging captures dynamic morphogenetic events, such as cell migration, shape changes, and differentiation, by imaging the embryo as it develops. This complements fixed analysis and expands the understanding of how organs develop during embryogenesis. Despite its advantages, live imaging is rarely used in mouse models because of its technical challenges. Early mouse embryos are sensitive when cultured ex vivo and require efficient handling. To facilitate a broader use of live imaging in mouse developmental research, this paper presents a detailed protocol for two-photon live microscopy that allows long-term acquisition in mouse embryos. In addition to the protocol, tips are provided on embryo handling and culture optimization. This will help understand key events in early mouse organogenesis, enhancing the understanding of cardiovascular progenitor biology.

We present a detailed protocol for mouse embryo culture and imaging that enables 3D + time imaging of cardiac progenitor cells. This video-toolkit addresses the key skills required for successful live imaging otherwise hard to acquire from text-only publications.

Imagem ao vivo de progenitores cardíacos precoces no embrião de camundongo

The first steps of heart development imply drastic changes in cell behavior and differentiation. While analysis of fixed embryos allows studying in detail ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

Preparação de Rat Serum Indicado para cultura de embriões de mamíferos Whole

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Avaliação da adesão embrionária em um modelo de co-cultura in vitro com células de Ishikawa

Establishment of an Embryo Implantation Model In Vitro

Embryo implantation is the first step in the establishment of a successful pregnancy. An in vitro model for embryo implantation is critical for basic biological research, drug development, and screening. This paper presents a simple, rapid, and highly efficient in vitro model for embryo implantation. In this protocol, we first introduce mouse blastocyst acquisition and human endometrial adenocarcinoma cells (Ishikawa)&#160;preparation for implantation, followed by the co-culture method for mouse embryos and Ishikawa cells. Finally, we conducted a study to assess the impact of varying concentrations of 17-&#946;-estradiol (E2) and progesterone (P4) on embryo adhesion rates based on this model. Our findings revealed that high concentrations of E2 significantly reduced embryo adhesion, whereas the addition of progesterone could restore the adhesion rate. This model offers a simple and fast platform for evaluating and screening molecules involved in the adhesion process, such as cytokines, drugs, and transcription factors controlling implantation and endometrial receptivity.

Autor em destaque: Avançando em estratégias terapêuticas para melhorar as taxas de gravidez analisando as interações embrião-endométrio

This protocol describes methodologies to establish simple and efficient embryo implantation in vitro model for evaluating the relevant molecules affecting the embryo implantation process.

Estabelecimento de um Modelo de Implantação Embrionária In Vitro

Embryo implantation is the first step in the establishment of a successful pregnancy. An in vitro model for embryo implantation is critical for basic ...