Este protocolo permite a imagem de embriões de camundongos à medida que se desenvolvem. Isso permite estudar a cardiogênese precoce em detalhes. Como tirar imagens estáticas de embriões falsos, a imagem ao vivo dá acesso total ao processo dinâmico de estudo no desenvolvimento embrionário.
As habilidades necessárias para a imagem da vida são difíceis de entender a partir da publicação apenas de texto. Ver outra pessoa fazendo isso é essencial para aprender. Para começar, corte pedaços de fio de tungstênio de um centímetro de comprimento e afie-os para 0,02 a 0,05 milímetros de diâmetro, submergindo a ponta do fio em uma solução saturada de nitrato de sódio.
Para preparar capilares de vidro cotovelados, coloque o ponto médio de um capilar de vidro padrão de um milímetro sobre um isqueiro de bunsen por três a seis segundos, puxando lentamente de ambas as extremidades até que o capilar fique fino e flexível. Em seguida, quebre o capilar ao meio e aqueça-o brevemente para produzir uma flexão de 90 graus a dois centímetros da ponta. Viu um pedaço de polimetilmetacrilato medindo aproximadamente sete milímetros de comprimento, quatro milímetros de largura e dois milímetros de espessura.
Segure a peça de metacrilato usando um vício de bancada e, em seguida, faça furos personalizados transversalmente por toda a peça. Gire a broca lentamente enquanto aplica pressão baixa, mas constante. Use um arquivo fino para suavizar a borda do suporte e ajustar seu tamanho.
Além disso, crie uma inclinação suave nas bordas do suporte para facilitar o posicionamento do embrião. Coloque o suporte acabado em um prato com água destilada para enxaguar. Sob o microscópio estéreo, verifique o suporte para ver se os furos contêm poeira de perfuração.
Se a poeira estiver presente, use agulhas de tungstênio para removê-la. Para esterilizar o suporte, coloque-o em um tubo cônico cheio de água destilada e sonicate por 20 minutos com uma potência mínima de 20 watts. Extraia o útero de uma rata grávida de 6,75 a 7,5 dias embrionários eutanasiados e coloque-o sobre um toalhete de papel seco e limpo.
Em seguida, corte o útero, inserindo a ponta de uma tesoura fina do lado mesostrial, e deslizando a lâmina ao longo para expor os decidui, e transferi-los para o meio de dissecção. Dissecar os embriões, mantendo intacto o cone ectoplacentário. Em seguida, retire a membrana do Reichter, deixando parte dela na região extra embrionária.
Para manter o meio de dissecção quente, substitua-o a cada 10 minutos. Além disso, disseque os decidui em grupos de três a quatro, mantendo o restante em um meio de dissecação colocado em banho de 37 graus Celsius. Coloque imediatamente os embriões dissecados em um meio de cultura.
Selecione os embriões com as características de fluorescência desejadas usando um microscópio estéreo de fluorescência e coloque-os no tubo contendo o meio de cultura na incubadora de cultura celular para recuperar por duas horas antes da imagem. Depois de ligar todos os componentes do microscópio, incluindo computador, software e lasers, ligue o controlador de dióxido de carbono e configure-o para 7%Coloque uma gota de graxa de silício de alto vácuo em um prato de 35 milímetros com um fundo deslizante de tampa de vidro. Coloque o suporte em cima da gota e pressione suavemente para imobilizá-lo.
Para a montagem de embriões, transfira de dois a três embriões da incubadora para o prato com um suporte. Usando um par de fórceps e uma agulha de tungstênio cônica, coloque os embriões nos buracos. Use a agulha para prender o embrião pelo cone ectoplacentário e insira-o em um orifício correspondente ao tamanho.
Mova cuidadosamente o prato que contém os embriões e o suporte para a placa do microscópio. Abaixe a objetiva até que um menisco líquido seja formado na interface objetiva média. Depois de colocar o embrião em foco, monte a câmara de incubação e sele-a em torno da objetiva usando fita adesiva.
Usando uma captura ao vivo no software de controle do microscópio, ajuste a saída do laser e os níveis de ganho. Em seguida, cubra o meio com óleo de parafina pingando-o lentamente na objetiva. Configure uma gravação de lapso de tempo.
Defina um intervalo de cinco a 10 minutos com espaço Z de três a cinco mícrons entre as pilhas. Deixe um espaço em branco no topo da pilha Z para antecipar o crescimento do embrião. Um mínimo de 50 mícrons, adicionando 30 mícrons para cada hora que a aquisição não será supervisionada.
Habilite a opção de salvamento automático para permitir a supervisão da aquisição de um computador para permitir o ajuste do tamanho do Z-Stack, se necessário, para se adequar à área de interesse dentro do foco. O desenvolvimento do coração embrionário de corpo inteiro vivo por imagem multifóton é mostrado. No dia embrionário 7,5, a fluorescência venosa está presente em toda a ectoderma neural, com alguns núcleos positivos no mesoderma esplâncnico e extraembrionário.
Após quatro horas, os progenitores endoteliais ativam as veias e se reúnem para formar tubo endocárdico e aortas subjacentes, que se tornam estruturas fechadas após sete horas. Tenha cuidado ao remover a membrana do Reichter. Pode ser realmente preso ao embrião, especialmente em estágios de prevacilação.
Durante a remoção, tente beliscar a membrana pela região extra embrionária.
