Gostaríamos de agradecer o laboratório de A. Hadjantonakis (Sloan-Kettering Institute) eo laboratório de L. Niswander (U of Colorado-Denver) para conselhos úteis com técnicas de dissecação e cultura. Este trabalho tem sido apoiado por NRSA NS059562 para JDG e RO1NS05897 para MER em colaboração com L. Niswander e Nadeau J. (Institute for Systems Biology).

1. Preparação de meios de cultura - todos os reagentes estão listados na Tabela 1 <ol><li> Thaw soro de ratos machos a 37 ° C. </li><li> Heat-Inativar soro de ratos por 30 minutos a 55 ° C </li><li> Soro dos ratos, no 10K centrífuga por 5 minutos em temperatura ambiente </li><li> Remover 50:50 sobrenadante e misture com fenol vermelho-livre DMEM w / glicose alta </li><li> Esterilizar os meios de comunicação utilizando um filtro de seringa de 0,45 hm </li><li> Pelo menos 1 ml de media / embrião deve ser preparado </li></ol> 2. Isolamento do útero da mãe grávida <ol><li> Usando procedimentos aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê de Uso (IACUC), a barragem é a primeira grávida anestesiados e sacrificados por deslocamento cervical </li><li> Esterilizar o abdômen com EtOH 70% </li><li> Aperte um pequeno caminho de pele ao longo da linha média, pouco acima da linha dos mamilos, com uma pinça grande e abrir o abdômen debaixo de seu fórceps com uma tesoura grande. Tenha cuidado para não danificar nenhuma estrutura internas </li><li> Use a tesoura para cortar lateralmente a partir da abertura inicial para cada lado do mouse para que todo o abdômen está aberto </li><li> Intestinos e excesso de bolsas de gordura pode muitas vezes obscuros no útero e essas devem ser movidas de lado para que a parte superior do útero e ovários pode ser observado em cada lado </li><li> Aperte a parte superior do útero abaixo os ovários e use a tesoura para separar o útero a partir da gordura, o corte de uma extremidade do útero ao ovário outros </li><li> Retire do útero com o forceps e colocar em uma placa de Petri com solução salina </li></ol> 3. Remoção dos embriões do útero <ol><li> Lavar o útero com solução salina para remover qualquer excesso de sangue e aparar o excesso de gordura do lado de fora </li><li> Transferir para um prato limpo, com temperatura ambiente. Tyrodes salina para melhorar a visualização </li><li> Usando um microscópio estereoscópico, separe cada embrião usando uma tesoura pequena multa ou se necessário (# 5) fórceps cuidadosamente casca do útero distante. </li> &lt;li&gt; Inserir uma pinça fina para o espaço entre a parede uterina ea decídua e descole da parede uterina, tomando cuidado para não furar o embrião </li></ol> 4. Remoção de decídua de embriões <ol><li> Orientar o decidua de modo que a parte mais escura (placenta) está voltado para longe de você </li><li> Faça uma incisão com o fórceps ao longo da linha que separa a parte escura do decidua do isqueiro parte, tomando cuidado para não cortar demasiado profundamente </li><li> Completar a separação da placenta da parte superior do saco vitelino, tomando cuidado para não rasgar o cone ectoplacental (EPC). Neste ponto, você deve ser capaz de visualizar a membrana Reicherts no saco vitelino </li><li> Continue para remover o decidua inteiro (mais leve porção) tomando cuidado para não furar o saco vitelino </li><li> Aperte suavemente e remover o Reicherts por raspagem-lo longe do EPC. Se o EPC está danificado ou separado do saco vitelino, embriões vai deixar de vez normalmente a partir E8.5-E9.5 </li><li&gt; Com o Reicherts removida do embrião deve ser facilmente visível através do saco vitelino e pode ser encenado por somities contagem. </li></ol> 5. Configurando o sistema de cultura <ol><li> Cortar o final de uma pipeta de plástico com uma tesoura para aumentar o diâmetro da abertura para que um embrião pode ser pipetado sem danificar o saco vitelino </li><li> Encher garrafas roller limpo com 1 ml de mídia por embrião. Dependendo do tipo de garrafas de rolo usado um máximo de 3-6 embriões podem ser colocados em cada garrafa. </li><li> Transferência de embriões utilizando a pipeta cortada para a garrafa cheia de rolos de mídia, transportando mais como Tyrodes mínimo possível de modo a não diluir a mídia </li><li> Anexar a ficha de borracha (bung) para a parte superior da garrafa de vidro rolo </li><li> Inserir as garrafas roller no tambor cultura rolo de modo que uma boa vedação é formada entre o plug eo tambor </li><li> Uma vez que todas as garrafas foram anexados, e quaisquer espaços vazios no tambor foram selados wrolhas de borracha ith, ative o rolo </li><li> Abra CO 2 e O 2 tanques e ajustá-los a cerca de 2 psi, de modo que a válvula de saída está lançando uma bolha por segundo. Para E8.5-E10 embriões, 20% O 2 e 5% CO 2 deve ser usado. </li><li> Garantir que a incubadora está definida para 37 ° C e cobrir ou fechar a incubadora para que os embriões são protegidos da luz. </li><li> Embriões devem ser verificados periodicamente para avaliar o seu desenvolvimento através da adição de somities, a progressão de transformar, e na medida de fechamento do tubo neural </li><li> Depois de 2-3 horas de cultura, inibidores farmacológicos ou outros tratamentos podem ser adicionados aos meios de comunicação </li><li> O desenho do estudo deve incluir controles, como veículo ou análogos inativos do reagente de estudo. </li></ol> 6. Avaliação do desenvolvimento após a cultura de embriões todo <ol><li> Desligue o gás, pare de rolo, e remover as garrafas de incubadora </li><li> Embriões transferir de volta para Tyrodes ou PBS em uma placa de Petri para avaliação sob estereomicroscópio </li><li> O saco vitelino deve aparecer balão-como, num piscar de olhos devem ser visíveis e freqüência cardíaca deve ser&gt; 120 batimentos por minuto, ea circulação deve ser evidente </li><li> Embriões fotografia antes de yolk sac remoção, se necessário </li><li> Remover saco vitelino do embrião, cortando um buraco perto da EPC e lançando o saco vitelino e âmnio sobre a cabeça e garupa do embrião. </li><li> O cordão umbilical pode ser cortado para separar o saco vitelino do embrião e do saco vitelino pode ser usado para genotipagem do embrião, se necessário. </li><li> Examine o embrião para o número de somito e defeitos do tubo neural, tais como dobras abertas cranial, fechamento incompleto da face e / ou um neuroporo aberta caudal. Embriões podem ser estadiados segundo a classificação de alterações Theiler morfogenética múltipla ( <a href="http://genex.hgu.mrc.ac.uk/Databases/Anatomy/MAstaging.html">http://www.emouseatlas.org/ emap / home.html</a> ) Mais uma vez, um registro fotográfico dedesenvolvimento embrionário é útil. </li></ol> 7. Notas <ol><li> A dissecção de alta qualidade é essencial, porque qualquer nick ou lágrimas no saco vitelino impedirá virando sucesso e inibir o desenvolvimento normal. O EPC também podem ser danificados durante a remoção da membrana de Reichert (RM), e se o EPC é ainda parcialmente separado do saco vitelino, os embriões não se desenvolverá normalmente. No entanto, a remoção incompleta da RM pode causar embriões para ficar juntos e / ou células RM podem overgrow na cultura e na gema de constrição expansão saco, sendo que ambos vão impedir o desenvolvimento normal. </li><li> Pinças limpas e nítidas são o segredo para obter uma dissecção bom, porque fórceps maçante ou dobradas tornar o processo muito mais difícil. Depósitos de proteínas em instrumentos vai levar a danos nos tecidos. </li><li> Limpa, garrafas de vidro estéreis também são essenciais para evitar que embriões de degola para a parede lateral e sendo danificado. Antes de iniciar o experimento, as garrafas devem ser scrubbed com água e sabão, enxaguados em dH 2 O, e microondas com uma pequena quantidade de água em cada garrafa até que a água ferve. Garrafas são então lavados com EtOH 70% e permitiu secar ao ar. </li><li> Trabalho o mais rápido possível, porque quanto mais cedo o embrião pode ser transferida para os meios de cultura e aquecido de volta para 37 ° C a sobrevivência do melhor. </li><li> Completa dissecar toda a ninhada antes de transferir qualquer embriões para garrafas de rolos de modo que cada embrião é a temperatura ambiente para a mesma quantidade de tempo para evitar a criação de alguma discrepância no crescimento do embrião </li><li> Manter um ambiente estéril para evitar contaminação bacteriana das culturas. Experimentos nossa cultura ter sido realizada sem antibióticos, mas muitos laboratórios adicionar antibióticos para seus meios de comunicação para prevenir o crescimento bacteriano. O meio deve aparecer como clara no final do experimento como era no início do experimento. Se a mídia tornou-se nublado ou há um precipitado visível, provavelmente haverá um concontaminação que infectou sua cultura. </li><li> Troca gasosa ineficaz também pode retardar o desenvolvimento de embriões, por isso não deixe de ter um regulador de confiança que vai garantir a entrega contínua. </li><li> Embriões se desenvolvem cerca de 50% mais lento em cultura ex vivo, portanto, é essencial contar somitos para garantir que você tenha atingido o estágio adequado de desenvolvimento para a conclusão do experimento. </li></ol> 8. Resultados representativos: O aparecimento de embriões pré e pós-roller-cultura é ilustrada na Figura 1. No momento da dissecção, os embriões devem estar em uma configuração unturned (Fig. 1A, D) onde a cauda está por trás das dobras cabeça. Após 36 horas de cultura, os embriões deverão ter concluído o giro de modo que eles estão no C-curva, posição fetal, onde a cauda está na frente da cabeça (Fig 1B, C, E, F). Manipulação farmacológica com inibidores da quinase RhoA (Y-27632), um conhecido inibidor da extensão convergente duranteneurulação (Ybot-Gonzalez, 2007), resulta em um encurtamento dos embriões ao longo de seu eixo rostral-caudal (Fig. 1E, F) e inibe o fechamento do crânio neural dobra. Nossos dados mostram que doses crescentes de Y-27632 progressivamente prejudica fechamento vezes cranial (Figura 2A) e encurta o eixo do corpo (Fig. 2B), de acordo com o papel de downstream RhoA sinalização em neurulação cranial e extensão convergente. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3132/3132fig1.jpg" /> Figura 1. Aspecto de culturas e manipulação de embriões com o inibidor farmacológico Y-27632. (A D) embriões dissecado em E8.5 antes da cultura de embriões todo (B, E) em embriões E10 com o saco vitelino ainda intacto, após a 36hrs da cultura russa. (C, F) O saco vitelino foi removido para ilustrar virando sucesso e fechamento do tubo neural. Embriões que foram tratadas com o inibidor da quinase Rho Y-27632 (E, F) não se submeter a extensão convergente adequada e ilustramum eixo do corpo encurtado. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3132/3132fig2.jpg" /> Figura 2. Efeito do inibidor da quinase RhoA no fechamento do tubo neural craniana e alongamento do eixo. (A) A porcentagem de embriões que foram capazes de fechar com sucesso as suas dobras cranial (NTC% = percentagem fechamento do tubo neural) é comparada com a dose de Y-27632 adicionado ao meio de cultura. (B) A distância entre a vesícula ótica e forelimb foi significativamente reduzida em doses crescentes de Y-27632 (p &lt;0,05).

<ol>
	<li>Cockroft, D. L., Copp, A. J., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+culture+of+post+implantation+embryos.">Dissection and culture of post implantation embryos.</a> Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. , (1990).</li><li>Gray, J. D., Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+folate+supplementation+from+Crooked+tail+and+other+NTD-prone+mutant+mice.">Mechanistic insights into folate supplementation from Crooked tail and other NTD-prone mutant mice.</a> Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 85, 314-321 (2009).</li><li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Atlas of Mouse Development. , (1992).</li><li>Ybot-Gonzalez, P., Savery, D., Gerrelli, D., Signore, M., Mitchell, C. E., Faux, C. H., Greene, N. D., Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+extension,+planar-cell-polarity+signalling+and+initiation+of+mouse+neural+tube+closure.">Convergent extension, planar-cell-polarity signalling and initiation of mouse neural tube closure.</a> Development. 134, 789-799 (2007).</li><li>Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-environment+interactions,+folate+metabolism+and+the+embryonic+nervous+system.">Gene-environment interactions, folate metabolism and the embryonic nervous system.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2, 471-480 (2010).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A capacidade de separar materna, fatores intra-uterinos daqueles que são intrínsecos ao embrião durante o seu desenvolvimento é uma importante ferramenta para o estudo de todas as fases da embriogênese. Aqui analisamos os efeitos de uma pequena molécula de inibidor da quinase do utero RhoA cranial neurulação ex, eliminando assim a variável do metabolismo materno da droga. Esta manipulação farmacológica tem um efeito profundo sobre neurulação cranial e extensão convergente. Sensibilidade a este composto pode ser comparado entre os diferentes mutantes rato genético. O método aqui apresentado também pode ser aplicado em estudos de outras vias moleculares em desenvolvimento, permitindo a manipulação direta da função celular em embriões utilizando uma variedade de reagentes.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Estereomicroscópio para Dissecção </td><td> Leica </td><td> M165 </td><td></td></tr><tr><td> Incubadora de precisão </td><td> BTC Engenharia (Reino Unido) </td><td> BTC 001 </td><td></td></tr><tr><td> Unidade de Cultura rotativa Bottle </td><td> BTC </td><td> BTC 003 </td><td></td></tr><tr><td> Garrafas de vidro para Rotating Unidade </td><td> BTC </td><td> BTC 005 </td><td></td></tr><tr><td> Bung de borracha de silicone </td><td> BTC </td><td> BTC 007 </td><td></td></tr><tr><td> Silicone Cork Rubber </td><td> BTC </td><td> BTC 008 </td><td></td></tr><tr><td> Gás Bubbler Inlet </td><td> BTC </td><td> BTC 012 </td><td></td></tr><tr><td> Armadilha de entrada de gás Bubbler </td><td> BTC </td><td> BTC 013 </td><td></td></tr><tr><td> Saída de gás Bubbler </td><td> BTC </td><td> BTC 014 </td><td></td></tr><tr><td> Cilindro de gás </td><td> TechAir </td><td></td><td> 20% O 2, 5% CO 2 </td></tr><tr><td> Regulador de gás </td><td> TechAir </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Serum Rat masculino </td><td> Harlan Labs </td><td> 4520 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM vermelho w / o de fenol </td><td> Invitrogen </td><td> 31053 </td><td></td></tr><tr><td> Seringa de 10 ml </td><td> BD </td><td> 309604 </td><td></td></tr><tr><td> Filtro de seringa </td><td> Nalgene </td><td> 190-2545 </td><td></td></tr><tr><td> Tesoura grande Dissecando (ponta Blunt) </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td><td></td></tr><tr><td> Extra Fine Bonn Tesoura </td><td> Multa Ferramentas Científica (FST) </td><td> 14084-08 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Dumot # 5 forceps </td><td> FST </td><td> 11252-50 </td><td></td></tr><tr><td> Tyrode de Saline </td><td></td><td></td><td> Conforme descrito na Cockroft 1990 </td></tr><tr><td> 10 centímetros prato de Petri descartáveis </td><td> BD </td><td> 351029 </td><td></td></tr></tbody></table>

neural tube closure in mouse whole embryo culture

Modelos de ratos genéticas são uma importante ferramenta no estudo de fechamento do tubo neural de mamíferos (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010). No entanto, o estudo dos embriões de camundongos in utero é limitado pela nossa incapacidade de manipular diretamente farmacologicamente os embriões no isolamento dos efeitos do metabolismo materno sobre o reagente de interesse. Seja usando uma pequena molécula, a proteína recombinante, ou siRNA, a entrega dessas substâncias para a mãe, através da dieta ou por injecção sujeitará estes compostos instáveis ​​a uma variedade de defesas corporais que poderiam impedi-los de alcançar o embrião. Investigações em culturas de todo o embrião pode ser usado para separar materna intrínseca de efeitos sobre o desenvolvimento fetal. Aqui, apresentamos um método para cultivo de embriões de rato usando a mídia altamente enriquecido em um aparelho de incubadora de rolos que permite o fechamento do tubo neural normal, após a dissecção (Crockett, 1990). Uma vez que na cultura, os embriões podemser manipulados usando técnicas in vitro convencional que não seria possível se os embriões ainda estavam no útero. Irmãos embrião pode ser coletadas em vários pontos do tempo para estudar os diferentes aspectos da neurulação, ocorrendo a partir E7-7.5 (formação de placa neural, pouco antes do início da neurulação) para E9.5-10 (na conclusão do neuroporo dobrar e caudal do crânio fechamento, Kaufman, 1992). Neste protocolo, demonstramos o nosso método para a destruição de embriões em intervalo de tempo que são ideais para o estudo da neurulação craniana. Os embriões serão dissecados em E8.5 (aprox. 10-12 somities), após o início do fechamento do tubo neural, mas antes de ligar embrião e fechamento neural cranial fold, e mantidos em cultura até E10 (26-28 somities), quando cranial neurulação deve ser completa.

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Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture

Um método que permite a manipulação farmacológica direta de embriões de camundongos durante a neurulação que ultrapassa o metabolismo materno é descrito. A técnica pode ser adaptada para estudar os diferentes aspectos da neurulação, variando o ponto de tempo e agente farmacológico.

Fechamento do tubo neural no embrião do rato Cultura Whole

Genetic mouse models are an important tool in the study of mammalian neural tube closure (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010).  However, the study of mouse ...

neural-tube-closure-in-mouse-whole-embryo-culture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.5K visualizações.  Weill Cornell Medical College. Um método que permite a manipulação farmacológica direta de embriões de camundongos durante a neurulação que ultrapassa o metabolismo materno é descrito. A técnica pode ser adaptada para estudar os diferentes aspectos da neurulação, variando o ponto de tempo e agente farmacológico.

Vídeo: Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Estabelecer embrionárias de rato Cultura de Células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neurociência

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolamento e cultivo de células da crista neural do tubo neural embrionário murino

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

Ex vivo imagens ao vivo de divisões celulares simples no mouse neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ability to study cell movements and differentiation in vivo is still very difficult. Neurocristopathies, or disorders of the neural crest lineage, are particularly challenging to study due to a lack of accessibility of key embryonic stages and the difficulties in separating out the neural crest mesenchyme from adjacent mesodermal mesenchyme. Here, we set out to establish a well-defined, routine protocol for the culture of primary cranial neural crest cells. In our approach we dissect out the mouse neural plate border during the initial neural crest induction stage. The neural plate border region is explanted and cultured. The neural crest cells form in an epithelial sheet surrounding the neural plate border, and by 24 h after explant, begin to delaminate, undergoing an epithelial-mesenchymal transition (EMT) to become fully motile neural crest cells. Due to our two-dimensional culturing approach, the distinct tissue populations (neural plate versus premigratory and migratory neural crest) can be readily distinguished. Using live imaging approaches, we can then identify changes in neural crest induction, EMT and migratory behaviors. The combination of this technique with genetic mutants will be a very powerful approach for understanding normal and pathological neural crest cell biology.

This protocol describes the dissection and culture of cranial neural crest cells from mouse models, primarily for the study of cell migration. We describe the live imaging techniques used and the analysis of speed and cell shape changes.

Dissecção, cultura e análise de células da crista neural craniana primária do mouse para o estudo de delaminação e migração de células de crista neural

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

Biologia do Desenvolvimento

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

O método de cultura de embriões de roedores inteiro usando o Rotator do tipo Sistema de Cultura Garrafa

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Biologia

Monitoramento longitudinal da mecânica das placas neurais no desenvolvimento de embriões de galinhas

Monitoring the Mechanical Evolution of Tissue During Neural Tube Closure of Chick Embryo

Neural tube closure (NTC) is a critical process during embryonic development. Failure in this process can lead to neural tube defects, causing congenital malformations or even mortality. NTC involves a series of mechanisms on genetic, molecular, and mechanical levels. While mechanical regulation has become an increasingly attractive topic in recent years, it remains largely unexplored due to the lack of suitable technology for conducting mechanical testing of 3D embryonic tissue in situ. In response, we have developed a protocol for quantifying the mechanical properties of chicken embryonic tissue in a non-contact and non-invasive manner. This is achieved by integrating a confocal Brillouin microscope with an on-stage incubation system. To probe tissue mechanics, a pre-cultured embryo is collected and transferred to an on-stage incubator for ex ovo culture. Simultaneously, the mechanical images of the neural plate tissue are acquired by the Brillouin microscope at different time points during development. This protocol includes detailed descriptions of sample preparation, the implementation of Brillouin microscopy experiments, and data post-processing and analysis. By following this protocol, researchers can study the mechanical evolution of embryonic tissue during development longitudinally.

Autor em destaque: Medição sem contato da mecânica dos tecidos em embriões de pintinhos vivos usando microscopia de Brillouin

This protocol was developed to longitudinally monitor the mechanical properties of neural plate tissue during chick embryo neurulation. It is based on the integration of a Brillouin microscope and an on-stage incubation system, enabling live mechanical imaging of neural plate tissue in ex ovo cultured chick embryos.

Monitoramento da Evolução Mecânica do Tecido Durante o Fechamento do Tubo Neural de Embrião de Pintinhos

Neural tube closure (NTC) is a critical process during embryonic development. Failure in this process can lead to neural tube defects, causing congenital ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

Um ensaio de explante para avaliar o comportamento celular do mesênquima craniana

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

Fechamento do tubo neural no embrião do rato Cultura Whole

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Estabelecer embrionárias de rato Cultura de Células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere

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O método de cultura de embriões de roedores inteiro usando o Rotator do tipo Sistema de Cultura Garrafa

Monitoramento da Evolução Mecânica do Tecido Durante o Fechamento do Tubo Neural de Embrião de Pintinhos

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