Financiamento concedido pela Universidade Ocidental de Ciências da Saúde Faculdade de Optometria para DJC. Um agradecimento especial a Irisa Tam para design gráfico.

Todos pecuária e experimentos devem ser aprovadas e conduzidos de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê da respectiva instituição ou outros requisitos legais Institutional Animal Care e Use. 1. Cuidados Zebrafish <ol><li> Manter a peixe-zebra, sob condições padrão a 28,5 ° C num ciclo de 10 horas de luz-escuro de 14 h 16. </li><li> Mantenha adulto zebrafish a uma densidade de cerca de 3 tanque de peixes / L. </li></ol> 2. Resposta optocinético (OKR) <ol><li> Construir o dispositivo de gravação OKR personalizado usando um aumento de 14,5 cm de diâmetro tambor rotativo, um microscópio estéreo com configurações de intensidade de luz ajustáveis ​​(300-8,000 Lux) e um computador (Figura 1a). <ol><li> Anexar uma câmera para o microscópio que irá proporcionar uma transmissão ao vivo para um monitor ao lado e permitir a captação e gravação de imagens. </li><li> Controlar o tambor rotativo utilizando um microcontrolador ligado a um computador que irá acomodarData várias selecções de velocidade e direção. </li></ol></li><li> Anestesiar os peixes em 0,016% tricaina por 2-3 min e, em seguida, coloque o peixe em uma pequena plataforma com os olhos e guelras suspensos sobre a borda. </li><li> Coloque uma esponja fina / toalha sobre o corpo do peixe e pin 2-3 pedaços de espuma, em forma de acomodar o peixe, o peixe mais para mantê-lo imobilizado. A limitação do movimento da cauda do peixe foi encontrado para ser um aspecto crucial para a imobilização sem causar danos aos peixes, e foi melhor conseguido utilizando uma peça plana de espuma. (Figura 1b) </li><li> Posicionar o peixe dentro de um tanque cheio de água, cilíndrica, que se encaixa no interior do tambor rotativo do dispositivo de gravação OKR. Use imans na plataforma para posicionar o peixe na posição vertical, com os olhos cerca de 7,3 cm da borda do tambor. O peixe deve reavivar da anestesia dentro de alguns minutos - a respiração normal será retomado e movimentos oculares aleatórios devem ser observadas. </li><li> Coloque um baixoe grade de 0,07 ciclos por grau (cpg) no tambor rotativo e envolver os controles de computador para começar a rotação e captura de vídeo (uma velocidade de 12 rpm foi utilizada para este papel, mas velocidades de 8-16 rpm deve dar resultados semelhantes). </li><li> Uma vez que um OKR inicial é provocada pela base ralar, pausar a rotação brevemente, e substituir a grade com uma grade menor (maior freqüência espacial). </li><li> Repita esse processo até que um OKR já não pode ser atingida. Teste novamente com o menor grade que causou uma OKR seguir uma abordagem modificada escada e, em seguida, repetir usando a grade que falhou para extrair uma resposta para verificar a perda da OKR. Este processo pode ser repetido para verificar uma verdadeira resposta à menor grade detectável se a grade definitiva mudado em relação ao primeiro evento de extinção. </li><li> Obter medidas de acuidade monocular, colocando uma prótese de plástico preto sobre as faixas adjacentes ao olho oposto. Repita o procedimento acima (passos 2,6-2,7). </li><li>Obter a acuidade do olho oposto ao reposicionar a prótese e repetindo a 2,6-2,7 passos novamente. </li><li> Note-se a distância de cada olho é das listras durante o procedimento de teste usando a faixa de medição de referência sob o tanque de peixes, de modo que as medidas de acuidade precisas podem ser calculadas nos passos seguintes. </li></ol> 3. Calculando Visual Acuity <ol><li> Obter a acuidade visual através do cálculo do CPD: <img alt="Equação 1" fo:content-width="0.7in" src="/files/ftp_upload/50832/50832eq1.jpg" width="70px" /> onde a é a distância a partir do centro da lente, para a grade, e h é o comprimento de um ciclo da menor grelha na qual OKR foi observado (Figura 1c). </li><li> Por medidas de acuidade visual combinadas, a média de um valor, tanto do olho esquerdo e direito é usado. </li></ol>

<ol>
	<li>Brockerhoff, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+behavioral+screen+for+isolating+zebrafish+mutants+with+visual+system+defects.">A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10545-10549 (1995).</li><li>Neuhauss, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+disorders+of+vision+revealed+by+a+behavioral+screen+of+400+essential+loci+in+zebrafish.">Genetic disorders of vision revealed by a behavioral screen of 400 essential loci in zebrafish.</a> J. Neurosci. 19, 8603-8615 (1999).</li><li>Schumann, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+objective+determination+of+visual+acuity+on+the+basis+of+the+optokinetic+nystagmus.">The objective determination of visual acuity on the basis of the optokinetic nystagmus.</a> Am. J. Optom. Arch. Am. Acad. Optom. 29, 575-583 (1952).</li><li>Gorman, J. J., Cogan, D. G., Gellis, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+apparatus+for+grading+the+visual+acuity+of+infants+on+the+basis+of+opticokinetic+nystagmus.">An apparatus for grading the visual acuity of infants on the basis of opticokinetic nystagmus.</a> Pediatrics. 19, 1088-1092 (1957).</li><li>Fulton, A. B., Manning, K. 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Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+optokinetic+response+to+study+visual+function+of+zebrafish.">Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (36), e1742 (2010).</li><li>Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurements+of+the+optokinetic+response+in+adult+fish.">Quantitative measurements of the optokinetic response in adult fish.</a> J. Neurosci. Methods. 186, 29-34 (2010).</li><li>Li, L., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dominant+form+of+inherited+retinal+degeneration+caused+by+a+non-photoreceptor+cell-specific+mutation.">A dominant form of inherited retinal degeneration caused by a non-photoreceptor cell-specific mutation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 11645-11650 (1997).</li><li>Ren, J. Q., McCarthy, W. R., Zhang, H., Adolph, A. R., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+visual+responses+of+wild-type+and+hypopigmented+zebrafish.">Behavioral visual responses of wild-type and hypopigmented zebrafish.</a> Vision Res. 42, 293-299 (2002).</li><li>Maaswinkel, H., Mason, B., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ENU-induced+late-onset+night+blindness+associated+with+rod+photoreceptor+cell+degeneration+in+zebrafish.">ENU-induced late-onset night blindness associated with rod photoreceptor cell degeneration in zebrafish.</a> Mech. Ageing Dev. 124, 1065-1071 (2003).</li><li>Stujenske, J. M., Dowling, J. 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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+zebrafish+lrp2+result+in+adult-onset+ocular+pathogenesis+that+models+myopia+and+other+risk+factors+for+glaucoma.">Mutations in zebrafish lrp2 result in adult-onset ocular pathogenesis that models myopia and other risk factors for glaucoma.</a> PLoS Genet. 7, e1001310 (2011).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Cagenello, R., Arditi, A., Halpern, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binocular+enhancement+of+visual+acuity.">Binocular enhancement of visual acuity.</a> J. Opt. Soc. Am. A Opt. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+optokinetic+response+in+zebrafish+by+computer-based+eye+tracking.">Analysis of optokinetic response in zebrafish by computer-based eye tracking.</a> Methods Mol. Biol. 935, 139-160 (2013).</li><li>Tappeiner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+acuity+and+contrast+sensitivity+of+adult+zebrafish.">Visual acuity and contrast sensitivity of adult zebrafish.</a> Front. Zool. 9, 10 (2012).</li><li>Saszik, S., Bilotta, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+temperature+on+the+dark-adapted+spectral+sensitivity+function+of+the+adult+zebrafish.">The effects of temperature on the dark-adapted spectral sensitivity function of the adult zebrafish.</a> Vision Res. 39, 1051-1058 (1999).</li><li>Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+acuity+in+larval+zebrafish:+behavior+and+histology.">Visual acuity in larval zebrafish: behavior and histology.</a> Front. Zool. 7, 8 (2010).</li><li>Curcio, C. A., Sloan, K. R., Kalina, R. E., Hendrickson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+photoreceptor+topography.">Human photoreceptor topography.</a> J. Comp. Neurol. 292, 497-523 (1990).</li><li>Kalloniatis, M., Luu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Visual Acuity. , (1995).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Na ocasião, o peixe pode escapar para o reservatório de água. É crítico para imobilizar a cauda. Além disso, o uso de uma esponja fina / toalha sobre o corpo do peixe também foi encontrado para ser de valor inestimável para manter os peixes suspensos por períodos prolongados de tempo. Fomos capazes de manter os peixes imobilizados por mais de 30 minutos usando este procedimento, sem prejudicar os peixes. Esta quantidade de tempo é mais do que suficiente para fazer a binocular e ambos acuidade monoculares. A apresentação da grade pode ser feita de forma, tal como descrito aqui e em qualquer local usando um tambor rotativo ou fisicamente por apresentar um mostrador digital 18-22. Ambos os tipos têm vantagens e desvantagens específicas. Optamos por usar a rotação física tanto por razões de custo e especificações técnicas. Excluindo-se o computador e equipamentos de imagem, o dispositivo OKR descrito aqui pode ser construído por cerca de US $ 150. O OKR é um meio objetivo de determinar visual acuidade no peixe-zebra adulto. Embora vários outros ensaios visuomotoras para visão têm sido utilizados em experiências anteriores e mesmo o electrorretinograma foi feito com êxito em olhos de peixe-zebra adultos, embora não tenha sido muito utilizada, o peixe-zebra adultos OKR abre a porta para muitas novas condições experimentais 22. Este estudo demonstrou a utilidade do OKR em medir as variações de acuidade visual ao longo do tempo, identificando diferença de acuidade visual em modelos de doenças dos olhos, e para determinar a acuidade visual monocular. Curiosamente, adulto visão do peixe-zebra, quando comparado com a visão humana (20/20) é de aproximadamente 20/1, 000 (0,60 cpg quando é convertido para -0.3 logMAR). Embora isso possa parecer pobre, os olhos de peixe-zebra são muito bem adequados para o seu ambiente. Apesar da tarefa visual de olhar através de 6,5 centímetros de água, alguns milímetros de policarbonato, e outro centímetro de ar, o peixe executar muito bem! Descobrimos que a acuidade adulto zebrafish é about 70% do que seria previsível dado o seu espaçamento fotorreceptor. 23 Contraste isso com o desempenho humano ideal ~ 20/12, o que é cerca de 80% do previsto 20/10, e da técnica para medir a capacidade OKR visual em peixe-zebra adulto é impressionante 24 , 25. A técnica de medição da acuidade visual do olho independentes permitiria estudos em que um olho podem ser tratadas e a outra utilizada como um controlo. Além disso, o peixe com o desenvolvimento do olho assimétrico como o lrp2/bugeye ou peixes que desenvolver catarata pode ser monitorado com mais precisão. Deve notar-se que o tratamento tem de ser feita para medir com precisão a distância entre os olhos para as faixas e para obstruir o campo de visão completo. Esta técnica deve abrir a porta para medidas mais precisas e específicas da função visual peixe-zebra.

Zebrafish (Danio rerio) são um bom modelo para o estudo da fisiologia visual devido à semelhança de sua retina para outros vertebrados, seu ciclo de vida curto, ea disponibilidade de mutantes geneticamente modificados 1,2. O reflexo optocinético / resposta / nistagmo (OKR) é uma combinação de exercício suave e movimentos oculares rápidos sacádicos. Durante mais de 60 anos os clínicos têm demonstrado que a OKR pode ser usado para medir objectivamente acuidade visual nos pacientes e é especialmente útil para a determinação infantis capacidades visuais 3-5. O primeiro registro do uso OKR em animais estava usando pombos na década de 1950 6. Mais recentemente, o OKR tornou-se uma ferramenta valiosa para a avaliação da função visual em zebrafish larval e é muitas vezes usado para triagem de mutantes genéticos que têm uma deficiência visual 1,2. Enquanto o OKR tem sido amplamente utilizada para determinar a função visual em peixes-zebra de larvas, que apenas recentemente foi demonstrada em adultos zebrapescar 7-10. Um artigo recente de Tappeiner et al. Utiliza um sistema optomotor disponível comercialmente tradicionalmente utilizado para ratinhos, OptoMotry, para demonstrar que a acuidade visual do peixe-zebra adultos permanece bastante constante, ~ 0,59 ciclos por grau (cpd), mesmo através de várias velocidades angulares 7 . Embora o OKR provou ser bastante útil em estudos de peixe-zebra de larvas, outros métodos para o comportamento visual foram usadas em adultos de peixes-zebra com variados graus de sucesso. O ensaio resposta de fuga demonstrou que albino e rubi peixe-zebra, os dois mutantes de pigmentação, reduziram respostas visuais em condições de luz brilhante 11,12. Este ensaio resposta de fuga mesmo também identificou com sucesso cegueira noturna d mutantes, ainda que aos 2 anos de idade 13. No entanto, o ensaio de resposta de fuga não é sem falhas. É difícil atribuir a uma função visual exata e é apenas uma approximatio bruton de mudanças visuais - o que significa que é preciso uma grande mudança antes da mudança é identificado. Outro método que tem sido desenvolvido para a identificação de peixe-zebra adulto com deficiência visual é a resposta optomotor (OMR) 11. Neste ensaio, os peixes são colocados em um tanque circular com uma coluna opaco no centro. Listras preto e branco girar em torno do tanque e os peixes tem a tarefa de nadar na direção do movimento de distribuição. Como a resposta de fuga, o OMR se concentra nos recursos visuomotoras do peixe-zebra adulto. Todavia, foi utilizado com sucesso para identificar peixes com deficiências visuais, tais como os mutantes lrp2/bugeye 14. Os lrp2/bugeye buphthalmos exibem peixe-zebra, a pressão intra-ocular elevada, diminuiu OMR, e degeneração progressiva da retina 14,15. Muitos estudos têm utilizado as capacidades visuomotoras em peixe-zebra adulto, que muitas vezes são subjetivos e não podem ser quantitatively analisados. Ao utilizar o OKR, pode-se estudar a acuidade visual de peixes adultos de forma mais objetiva. Nós construímos nosso próprio dispositivo OKR, modelado após um inicialmente usado para estudos de larvas 1. Neste estudo demonstrámos que o OKR pode ser utilizado para calcular tanto monocular e acuidade visual binocular em peixes-zebra.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="593">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:209px;">Super Low Light Black White Video Security Camera</td>
			<td style="width:143px;">Super Circuits</td>
			<td style="width:119px;">PC164CEX-2</td>
			<td style="width:124px;"> Any low light camera may be used</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:209px;">Arduino Duemilanove microcontroller</td>
			<td style="width:143px;">Adafruit Industries</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:124px;"> The Arduino Uno is also compatible with the speed control software.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tricaine Methanesulfonate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101107-950</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the optokinetic response as a quantitative measure of visual acuity in zebrafish

Zebrafish são um modelo comprovado de pesquisa da visão, no entanto muitos dos métodos anteriores, geralmente focados em larvas de peixes ou demonstraram uma resposta simples. Mais recentemente comportamento visual adulto no peixe-zebra tornou-se de interesse, mas os métodos para medir respostas específicas são novos chegando. Para preencher esta lacuna, nos propusemos a desenvolver uma metodologia para repetidamente e precisa utilizar a resposta optocinético (OKR) para medir a acuidade visual em peixe-zebra adulto. Aqui nós mostramos que a acuidade visual do peixe-zebra adulto pode ser medido, incluindo tanto acuidade binocular e monocular. Porque o peixe não seja prejudicado durante o procedimento, a acuidade visual pode ser medida e comparada ao longo de períodos de tempo curtos ou longos. As medidas de acuidade visual descritos aqui também pode ser feito permitindo que rapidamente para alto rendimento e para procedimentos visuais adicionais, se desejar. Este tipo de análise é propício para estudos de intervenção de drogas ou investigações de progressão da doença.

OKR funcionalidade do dispositivo O dispositivo OKR como explicado acima e mostrado na Figura 1 funciona com um mínimo de manutenção. Como observado na etapa 2.3, imobilizando a cauda é fundamental para manter o peixe contido durante a gravação. Suficientemente imobilizada, o peixe pode ser mantido no dispositivo de OKR por períodos prolongados de tempo. Consequentemente, o cuidado deve ser tomado durante os passos iniciais de imobilização, para que mais dados podem ser coletados para cada peixe. Medidas de acuidade visual O binocular OKR é facilmente atingida em peixe adulto normal. Seguindo o procedimento acima descrito pode-se encontrar acuidade visual de peixe-zebra de várias idades (Figura 2). A melhor acuidade espacial binocular registramos foi de 0,74 cpg. Como observado na Figura 2, a acuidade binocular geralmente aumenta com a idade (n = 46, p = 0,002 ANOVA usando SPSS v14), mas os níveis de folgadepois de cerca de 12 meses de idade. Quando comparamos a medida da acuidade visual em cinco meses de idade do tipo selvagem de peixe para pareados por idade lrp2/bugeye peixe, descobrimos que o peixe lrp2/bugeye tinham reduzido significativamente a acuidade (p &lt;0,001; tipo selvagem: 0,49 ± 0,05 cpg; n = 8; lrp2/bugeye: 0,35 ± 0,06, n = 10; t de Student usando Excel). Por oclusão do olho direito acuidade visual para o olho esquerdo pode ser determinada e vice-versa. Quando comparado com a acuidade binocular, soma binocular é observado de maneira semelhante à visão humana 17 (Figura 3). A acuidade binocular era geralmente 5-10% melhor do que qualquer direito (OD) ou à esquerda (OS) acuidades medidos de forma independente. Para alguns peixes individuais a diferença foi uma melhoria de 25%. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50832/50832fig1.jpg" width="500px" /> Figura 1. Reco Okrrding. A) O dispositivo consiste de uma OKR 14,5 centímetros de diâmetro do cilindro e microscópio com ajustes de intensidade de luz ajustável (300-8,000 lux) em rotação. A câmera oferece uma transmissão ao vivo em um monitor adjacente. O tambor rotativo tem várias configurações de velocidade em ambos os sentido horário e anti-horário direções e grades de freqüência espacial intercambiáveis ​​são inseridos e removidos conforme necessário. B) Os peixes são garantidos e colocado no centro do tambor rotativo. C) ciclos por grau (cpg) é calculado usando = CPD <img alt="" src="img2.png" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50832/50832fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50832/50832fig2.jpg" width="500px" /> Figura 2. A acuidade visual muda com a idade. O gráfico mostra acuidades visuais independentes medidos 5 -<html> 15 meses de idade. A acuidade visual geralmente aumenta ao longo do primeiro ano de desenvolvimento e, em seguida, caudas um pouco aos 15 meses de idade (p = 0,002 ANOVA usando SPSS v14). Cada ponto pode tanto representar um ou vários peixes. A acuidade visual é medida em ciclos / grau (cpg). (N = 46 total, 8 a 5 meses, 4 a 6 meses, 7 a 8 meses, 6 a 9 meses, 11 a 10 meses; 2 a 11 meses, 2 a 12 meses, e de 6 a 15 meses). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50832/50832fig2highres.jpg" target="_blank">clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50832/50832fig3.jpg" width="500px" /> Figura 3. Efeito somatório acuidade visual binocular. O binocular (OU) acuidade visual é geralmente mais elevado em relação ao direito (OD) ou à esquerda (OS) acuidade dos olhos. Neste grupo particular as acuidades OS foram significativamente menores. (* P = 0,006, N = 8)jove.com/files/ftp_upload/50832/50832fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver imagem ampliada.

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The Optokinetic Response as a Quantitative Measure of Visual Acuity in Zebrafish

Zebrafish têm sido uma ferramenta valiosa para diversas áreas de pesquisa. Aqui demonstramos um método para induzir uma resposta visual e calcular uma acuidade visual funcional no peixe-zebra adultos.

A resposta optocinético como uma medida quantitativa da acuidade visual em Zebrafish

Zebrafish are a proven model for vision research, however many of the  earlier methods generally focused on larval fish or demonstrated a simple  ...

the-optokinetic-response-as-quantitative-measure-visual-acuity

Research

JoVE Journal

Neuroscience

20.4K visualizações.  Western University of Health Sciences.  Zebrafish têm sido uma ferramenta valiosa para diversas áreas de pesquisa. Aqui demonstramos um método para induzir uma resposta visual e calcular uma acuidade visual funcional no peixe-zebra adultos. 

Vídeo: The Optokinetic Response as a Quantitative Measure of Visual Acuity in Zebrafish

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

Fluorescência dupla In situ Hibridação nas Seções cérebro fresco

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Neurociência

Hyponeophagia: A Measure of Anxiety in the Mouse

Before the present day, when fast-acting and potent rodenticides such as alpha-chloralose were not yet in use, the work of pest controllers was often hampered by a phenomenon known as "bait shyness". Mice and rats cannot vomit, due to the tightness of the cardiac sphincter of the stomach, so to overcome the problem of potential food toxicity they have evolved a strategy of first ingesting only very small amounts of novel substances. The amounts ingested then gradually increase until the animal has determined whether the substance is safe and nutritious. So the old rat-catchers would first put a palatable substance such as oatmeal, which was to be the vehicle for the toxin, in the infested area. Only when large amounts were being readily consumed would they then add the poison, in amounts calculated not to affect the taste of the vehicle. The poisoned bait, which the animals were now readily eating in large amounts, would then swiftly perform its function.
Bait shyness is now used in the behavioural laboratory as a way of measuring anxiety. A highly palatable but novel substance, such as sweet corn, nuts or sweetened condensed milk, is offered to the mice (or rats) in a novel situation, such as a new cage. The latency to consume a defined amount of the new food is then measured.
Robert M.J. Deacon can be reach at <a href="mailto:robert.deacon@psy.ox.ac.uk">robert.deacon@psy.ox.ac.uk</a>

Mice and rats, due to their innate cautiousness, are initially slow in consuming a novel food, particularly in a novel place. This hyponeophagia can readily be measured in the laboratory, even though laboratory animals are much less anxious than their wild counterparts

Hyponeophagia: Uma Medida de ansiedade no rato

Before the present day, when fast-acting and potent rodenticides such as alpha-chloralose were not yet in use, the work of pest controllers was often ...

A Dual Tracer PET-MRI Protocol for the Quantitative Measure of Regional Brain Energy Substrates Uptake in the Rat

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the rat. The developed method is a small-animal positron emission tomography (PET) protocol, in which&#160;11C-AcAc and 18F-fluorodeoxyglucose (18F-FDG) are injected sequentially in each animal. This dual tracer PET acquisition is possible because of the short half-life of 11C (20.4 min). The rats also undergo a magnetic resonance imaging (MRI) acquisition seven days before the PET protocol. Prior to image analysis, PET and MRI images are coregistered to allow the measurement of regional cerebral uptake (cortex, hippocampus, striatum, and cerebellum). A quantitative measure of 11C-AcAc and 18F-FDG brain uptake (cerebral metabolic rate; &#956;mol/100 g/min) is determined by kinetic modeling using the image-derived input function (IDIF) method. Our new dual tracer PET protocol is robust and flexible; the two tracers used can be replaced by different radiotracers to evaluate other processes in the brain. Moreover, our protocol is applicable to the study of brain fuel supply in multiple conditions such as normal aging and neurodegenerative pathologies such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases.

Small-animal positron emission tomography enables the assessment of the brain&#39;s two main energy substrates:&#160;glucose and ketones. In the present method, 11C-acetoacetate and 18F-fluorodeoxyglucose are injected sequentially in each animal, and their uptake is measured quantitatively in specific brain regions determined from the magnetic resonance images.

A dupla Tracer PET-MRI Protocolo para a medida quantitativa da Regional cérebro substratos energéticos Captação no Rato

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the ...

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the surface of the cornea, electrical activity generated in response to light can be measured and used to assess the activity of retinal cells in vivo. This manuscript describes the use of the ERG to measure visual function in zebrafish. Zebrafish have long been utilized as a model for vertebrate development due to the ease of gene suppression by morpholino oligonucleotides and pharmacological manipulation. At 5-10 dpf, only cones are functional in the larval retina. Therefore, the zebrafish, unlike other animals, is a powerful model system for the study of cone visual function in vivo. This protocol uses standard anesthesia, micromanipulation and stereomicroscopy protocols that are common in laboratories that perform zebrafish research. The outlined methods make use of standard electrophysiology equipment and a low light camera to guide the placement of the recording microelectrode onto the larval cornea. Finally, we demonstrate how a commercially available ERG stimulator/recorder originally designed for use with mice can easily be adapted for use with zebrafish. ERG of larval zebrafish provides an excellent method of assaying cone visual function in animals that have been modified by morpholino oligonucleotide injection as well as newer genome engineering techniques such as Zinc Finger Nucleases (ZFNs), Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs), and Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9, all of which have greatly increased the efficiency and efficacy of gene targeting in zebrafish. In addition, we take advantage of the ability of pharmacological agents to penetrate zebrafish larvae to evaluate the molecular components that contribute to the photoresponse. This protocol outlines a setup that can be modified and used by researchers with various experimental goals.

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Eletrorretinograma Análise da Visual Response no peixe-zebra Larvas

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Simultâneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Teste Funcional de Dois retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Eletrorretinograma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

Visual Gravação Potencial Evocado em um modelo de rato de Experimental Nervo Óptico desmielinização

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

Em Gene Vivo Transferência de células de Schwann no nervo ciático de roedores por Eletroporação

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model organisms such as the fruit fly, Drosophila melanogaster. Drosophila is useful for understanding the basic neurobiology underlying cognitive deficits resulting from mutations in genes associated with human cognitive disorders, such as intellectual disability (ID) and autism. This work describes a methodology for testing learning and memory using a classic paradigm in Drosophila known as courtship conditioning. Male flies court females using a distinct pattern of easily recognizable behaviors. Premated females are not receptive to mating and will reject the male&#39;s copulation attempts. In response to this rejection, male flies reduce their courtship behavior. This learned reduction in courtship behavior is measured over time, serving as an indicator of learning and memory. The basic numerical output of this assay is the courtship index (CI), which is defined as the percentage of time that a male spends courting during a 10 min interval. The learning index (LI) is the relative reduction of CI in flies that have been exposed to a premated female compared to na&#239;ve flies with no previous social encounters. For the statistical comparison of LIs between genotypes, a randomization test with bootstrapping is used. To illustrate how the assay can be used to address the role of a gene relating to learning and memory, the pan-neuronal knockdown of Dihydroxyacetone phosphate acyltransferase (Dhap-at) was characterized here. The human ortholog of Dhap-at, glyceronephosphate O-acyltransferase (GNPT), is involved in rhizomelic chondrodysplasia punctata type 2, an autosomal-recessive syndrome characterized by severe ID. Using the courtship conditioning assay, it was determined that Dhap-at is required for long-term memory, but not for short-term memory. This result serves as a basis for further investigation of the underlying molecular mechanisms.

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

This protocol describes a Drosophila learning and memory assay called courtship conditioning. This classic assay is based on a reduction of male courtship behavior after sexual rejection by a non-receptive premated female. This natural form of behavioral plasticity can be used to test learning, short-term memory, and long-term memory.

Drosophila Courtship Acondicionamento Como Medida de Aprendizagem e Memória

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model ...

Using Optical Coherence Tomography and Optokinetic Response As Structural and Functional Visual System Readouts in Mice and Rats

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for the investigation of processes of neurodegeneration, neuroprotection and neuro-repair involving the visual system, as these often correlate well with retinal changes. As a functional readout, visually evoked compensatory eye and head movements are commonly used in experimental models involving the visual function. Combining both techniques allows a quantitative in vivo investigation of structure and function, which can be used to investigate the pathological conditions or to evaluate the potential of novel therapeutics. A great benefit of the presented techniques is the possibility to perform longitudinal analyses allowing the investigation of dynamic processes, reducing variability and cuts down the number of animals needed for the experiments. The protocol described aims to provide a manual for acquisition and analysis of high quality retinal scans of mice and rats using a low cost customized holder with an option to deliver inhalational anesthesia. Additionally, the proposed guide is intended as an instructional manual for researchers using optokinetic response (OKR) analysis in rodents, which can be adapted to their specific needs and interests.

A detailed protocol for the assessment of structural and visual readouts in rodents by optical coherence tomography and optokinetic response is presented. The results provide valuable insights for ophthalmologic as well as neurologic research.

Usando a tomografia de coerência óptica e resposta Optokinetic como estrutural e funcional sistema Visual leituras em camundongos e ratos

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for ...

Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% of the total stroke-related mortality with an important morbidity in terms of neurological outcome. A delayed cerebral vasospasm (CVS) may occur most often in association with a delayed cerebral ischemia. Different animal models of SAH are now being used including endovascular perforation and direct injection of blood into the cisterna magna or even the prechiasmatic cistern, each exhibiting distinct advantages and disadvantages. In this article, a standardized mouse model of SAH by double direct injection of determined volumes of autologous whole blood into the cisterna magna is presented. Briefly, mice were weighed and then anesthetized by isoflurane inhalation. Then, the animal was placed in a reclining position on a heated blanket maintaining a rectal temperature of 37 &#176;C and positioned in a stereotactic frame with a cervical bend of about 30&#176;. Once in place, the tip of an elongated glass micropipette filled with the homologous arterial blood taken from carotid artery of another mouse of the same age and gender (C57Bl/6J) was positioned at a right angle in contact with the atlanto-occipital membrane by means of a micromanipulator. Then 60 &#181;L of blood was injected in the cisterna magna followed by a 30&#176; downward tilt of the animal for 2 minutes. The second infusion of 30 &#181;L of blood into the cisterna magna was performed 24 h after the first one. The individual follow-up of each animal is carried out daily (careful evaluation of weight and well-being). This procedure allows a predictable and highly reproducible distribution of blood, likely accompanied by intracranial pressure elevation that can be mimicked by an equivalent injection of an artificial cerebral spinal fluid (CSF), and represents an acute to mild-model of SAH inducing low mortality.

We described in this protocol a standardized subarachnoid hemorrhage (SAH) mouse model by a double injection of autologous whole-blood into the cisterna magna. The high degree of standardization of the double-injection procedure represents a middle-to-acute model of SAH with relative safety regarding mortality.

Dupla injeção direta de sangue na Cisterna Magna como modelo de hemorragia subaracnóide

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% ...