Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Bolsas de Saúde EY0081 e 5T32UY07145 e pela Fundação Eye Cavaleiros Templários. Jason Rihel é membro Bristol-Squibb das Ciências da Vida Research Foundation.

Este protocolo descreve as etapas para realizar a resposta Visual-Motor de larvas de peixe-zebra a incrementos de luz e decrementos em seu próprio laboratório. Peixe-zebra é um sistema grande modelo para estudos comportamentais. Eles são fáceis de manter, eles têm tamanhos de embreagem grandes, e elas se desenvolvem rapidamente. Por exemplo, os olhos de larvas de peixe-zebra são sensíveis a luz do dia 3 de desenvolvimento e momento em que eles exibem uma resposta de sobressalto. Parte 1: Plating peixes individuais em uma placa de 96 poços <ol><li> Crescer larvas WT sob um ciclo claro / escuro a 28 ° C, até pelo menos 4 dias após a fertilização (DPF). Nossa luz típico: ciclo escuro é de 14 horas de luzes acesas a partir de 09h00, e 10 horas de luzes OFF, a partir das 11:00. Para obter os melhores resultados comportamentais, evitar a superlotação, que geralmente não tenham mais de 50 larvas em uma única placa de Petri. </li><li> Após 4 dpf, o peixe-zebra estão prontos para serem transferidos para uma placa de 96 poços. Para dar mais espaço para as larvas de natação, que tipicamente usam uma placa de 96 poços com uma grande e bem-size de 650 mL, no entanto, o padrão placas de 96 poços funcionar muito bem. Usando uma pipeta de transferência de plástico, gentilmente transferência de uma larva por poço. </li><li> Após a transferência dos peixes para os poços, preencha cada poço com peixes de água suficiente de modo que a superfície da água é quase rente ao topo dos poços. Ou overfilling ou enchimento baixo o bem pode causar problemas ópticos para a câmara de gravação. Além disso, tome cuidado para não introduzir bolhas nos poços. </li></ol> Parte 2: Levantamento de aparelhos de gravação Para esta parte do protocolo, por favor consulte o filme para identificar os componentes e para se familiarizar com a nossa criação do aparelho de gravação. <ol><li> Dentro da câmara de gravação é um local bem definido para a posição da placa de 96 poços. </li><li> A câmera está posicionada na parte de trás e está focado na placa usando espelhos fora da caixa. O ângulo desses espelhos pode ser ajustada girando os parafusos que prendem os espelhos no lugar. </li><li> A câmara de gravação é iluminado a partir do fundo por LEDs infravermelhos. Isso permite que a câmera para ver os peixes mesmo no escuro. As larvas não conseguem detectar luz infravermelha, por isso essa iluminação IR constante não afeta o experimento. LEDs brancos também iluminar a câmara de gravação de baixo. Eles são controlados separadamente das luzes de IR. Iluminando a câmara com luz branca a partir de cima ou a partir dos lados é certamente possível, no entanto, nesses casos, os cuidados devem ser tomados para evitar fortes brilhos para fora da superfície da água que podem interferir com a câmera. </li><li> Para experimentos que duram mais de um par de horas, preencher a câmara com cuidado em água para ajudar a manter uma temperatura constante durante todo o período experimental. Uma forma de conseguir um fluxo constante de água é para bombear água de um reservatório por uma bomba de aquário pequeno, que é aquecida a 28 ° com um aquecedor de aquário típico debaixo d&#39;água. </li><li> Para minimizar a vibração desviar-se da sala, a unidade de gravação inteiro deve sentar em cima de uma mesa de equilíbrio pesado. </li></ol> Parte 3: Alinhamento da placa de 96 poços com a rede informática do vídeo-tracking Software <ol><li> Coloque a placa de 96 poços contendo os peixes para dentro da câmara de gravação. </li><li> Quando se utiliza um banho de água, lentamente colocar a placa na água, dando o nível da água a chance de ajustar sem derramar sobre o prato. Em alternativa, desligar o fluxo de água, adicionar a placa, e depois retomar o fluxo. Além disso, certifique-se de usar uma mola ou um elástico para segurar a placa de 96 poços no local. </li><li> No software Videotrack Viewpoint, verifique se todas as larvas de sua experiência são visíveis na tela do computador. Usando os controles do software, alinhar a grade do software de monitoramento de vídeo com os poços do seu prato de forma que cada peixe é dentro de um quadrado da grade. O computador de rastreamento será calcular o movimento separadamente para cada uma destas caixas, então se você desalinhar a grade computador alguns dos movimentos dos peixes podem ser perdidos. Ou pior ainda: dois peixes adjacentes vai ocupar a mesma área e ser contado como um peixe. Este passo é muito importante para todas as suas gravações. </li><li> Após o alinhamento do programa, o tempo para quando as luzes deve ir ligado e desligado. Nós geralmente permitem três horas de adaptação claras ou escuras na caixa tanto para obter um nível de atividade de base, mas também para dar as larvas uma oportunidade para se acalmar após a pipetagem e manuseio. Após a linha de base, nós então alternam-se com 30 minutos de luzes ON seguido de 30 minutos de luzes OFF, e repetir várias vezes. </li><li> Em seguida, feche a porta da câmara de gravação e iniciar a gravação. </li><li> Na prática, registrar a atividade de cada peixe por segundo, mas o software Ponto de Vista, na verdade registra o quadro a quadro de dados (veja o filmepara uma demonstração da coleta de dados). O estabelecimento do limiar mínimo para a mudança de pixels por quadro vai depender um pouco da sua câmera especial e configuração de luz. Para nossa configuração, que geralmente usam um limiar de 4 pixels, ou seja, se menos de 4 pixels estão mudando, considera-se fundo. Se mais de 4 pixels estão se movendo, indica que o peixe está se movendo. Nós empiricamente determinou que este corte detecta quase todos nadar o larval e movimentos vez. </li><li> Mesmo que as caixas de gravação de isolar as larvas razoavelmente bem, desligar a luz no quarto e tomar cuidado para minimizar as interrupções com o ruído mecânico, como fechar e abrir as portas da sala, tendo uma festa de dança, ou fazendo suas rotinas de exercícios. </li></ol> Parte 4: Analisando os dados <ol><li> Após a experiência é completada, transferir os dados coletados em uma folha excel ou em sua suíte de análise favorito. </li><li> A folha de excel em anexo é um exemplo do que os dados podem parecer: ele contém o tempo em segundos desde o início do experimento ea atividade de cada larva por segundo para todos os peixes durante todo o experimento (Veja Dados complementares Exemplo de arquivo em seção Arquivos desta página). </li><li> A Figura 1 mostra um exemplo da atividade de uma larva único. A Figura 2 é um traço representativo da média de 40 larvas de peixe-zebra WT. A média de ON e OFF respostas são proeminentes e consistente. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_9/923_Figure-02.png" alt="Figura 1" width="569" height="398" /> Figura 1: Atividade de um único peixe A atividade de um único peixe WT menos 5 dpf em resposta a períodos alternados de 30 minutos-luz ON e OFF.. As respostas ON são indicadas por setas pretas e as respostas OFF com setas vermelhas. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_11/923_Figure-03.png" alt="Figura 2" width="577" height="387" /> Figura 2: A atividade média de 40 peixes A atividade média de 40 peixes, 5 WT dpf em resposta a períodos alternados de 30 minutos-luz ON e OFF.. A média ON (setas pretas) e OFF (setas vermelhas) respostas são proeminentes e consistente. </li></ol> 5. Resultados representante Figura 3 é um esboço esquemático do delineamento experimental utilizado em todas as nossas experiências. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_12/923_Figure-04.png" alt="Figura 3" width="530" height="479" /> Figura 3. Delineamento experimental do teste de resposta Motor Visual (VMR). Um peixe) individuais são colocados em uma placa de 96 poços em uma câmara de gravação. A atividade de cada peixe é medido por segundo. B) Os peixes são de um período de adaptação ao escuro ou luz para resolvê-las e obter um nível de atividade de base. Períodos de 30 minutos em luzes e luzes OFF são introduzidos consecutivamente para um total de 3 horas. Este diagrama foi adaptado de Sondador et al., 2006. O que os gráficos Visual-Motor resposta parece? Medimos as respostas ON e OFF de peixes WT a incrementos de luz e diminui. Para confirmar que estas respostas foram depende da função dos olhos, nós medimos a atividade de mutantes chk, que não desenvolvem nenhum dos olhos. A Figura 4 mostra a atividade média obtida de animais WT, bem como os mutantes chk. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_13/923_Figure-05.png" alt="Figura 4" width="489" height="212" /> Figura 4: WT peixes têm clara ON e OFF respostas que são mediadas pelos olhos laterais O comportamento locomotor de larvas de peixe-zebra, 5 dpf em resposta a 30 minutos de luz ON e 30 minutos de luz OFF é gravado por segundo.. Cada traço representa uma média de 480 respostas de 120 WT individual (azul traço) ou larvas chk mutante (laranja trace) registrou mais de 3 experimentos. Os mutantes chk não aumentar significativamente a sua actividade, quer incrementos ou decrementos luz e têm um nível basal baixa de atividade. Este valor foi adaptado de Emran et al., 2007. Visual-Motor respostas do peixe mutante nrc. O mutante nrc foi pensado para ser completamente cego com base no teste OKR. No mutante nrc, os terminais de fotorreceptores não formam adequadamente e que o On via visual é severamente comprometida 1. Gravações ganglionares da retina de células a partir desses peixes mutantes revelaram que eles exibem predominantemente OFF-tipo de respostas de células ganglionares, algumas anormal ON-OFF, mas não pura No tipo 2 respostas. Utilizando o teste de VMR nós mostramos que o mutante tem um NRC normais OFF-resposta e um atrasado e lento ON-resposta (SEe Figura 5). Assim, o mutante nrc não é completamente cego como se pensava anteriormente 2. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_14/923_Figure-06.png" alt="Figura 5" width="591" height="244" /> Figura 5: mutats Nrc aumentar a sua actividade em resposta a mudanças na intensidade de luz respostas comportamentais à luz ON e OFF de WT e larvas nrc mutante menos 5 dpf.. Cada traço representa uma média de 480 respostas de 120 peixes individuais de cada genótipo. O comportamento locomotor média de mutantes NRC (traços-de-rosa) é ligeiramente reduzida, em comparação com os peixes WT (traços azuis), mas permanece vigoroso seguindo a luz OFF estímulo. Observe o tempo de subida lenta na resposta mutante nrc à luz ON comparação com a luz sobre a resposta dos peixes WT.

<ol>
	<li>Allwardt, A. B., Lall, B. A., Brockerhoff, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+formation+is+arrested+in+retinal+photoreceptors+of+the+zebrafish+nrc+mutant.">Synapse formation is arrested in retinal photoreceptors of the zebrafish nrc mutant.</a> J Neurosci. 21, 2330-2330 (2001).</li><li>Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OFF+ganglion+cells+cannot+drive+the+optokinetic+reflex+in+zebrafish.">OFF ganglion cells cannot drive the optokinetic reflex in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 19126-19126 (2007).</li><li>Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypocretin/orexin+overexpression+induces+an+insomnia-like+phenotype+in+zebrafish.">Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish.</a> J Neurosci. 26, 13400-13400 (2006).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish. , (2000).</li></ol>

Os procedimentos experimentais que mostram no filme são todos representativos de peixes WT. No entanto, estas experiências podem ser feitas de forma análoga em peixes mutantes também (ver secção resultado representativo). Sugerimos aos peixes placa WT e peixes mutantes na mesma placa em um esboço placa de verificador para fins de controle ótimo. Ao usar peixes mutantes no mesmo prato como peixe WT certifique-se que você anote o tipo de peixe era banhado em cada poço. Aqui está uma sugestão sobre como acompanhar o peixe b...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microplate devices</td>
<td>Tool</td>
<td>Whatman</td>
<td>7701-1651</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transfer pipetes</td>
<td>Tool</td>
<td>VWR</td>
<td>202205</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fish water</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>refer to reference #4</td>
</tr>
<tr>
<td>Recording chambers (Zebrabox)</td>
<td>Tool</td>
<td>Viewpoint Lifesciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Videotrack Software</td>
<td>Tool</td>
<td>Viewpoint Lifesciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a behavioral assay to measure responsiveness of zebrafish to changes in light intensities 

O reflexo optocinético (OKR) é um visual básico reflexo exibida pela maioria dos vertebrados e desempenha um papel importante na estabilização do olho em relação à cena visual. No entanto, o OKR exige que um animal detectar riscas em movimento e é possível que os peixes que não exibem um OKR não pode ser completamente cega. Um peixe-zebra mutante, a não optocinético resposta c (NRC) não tem nenhuma OKR sob quaisquer condições de luz testadas e foi relatado para ser completamente cego. Anteriormente, mostramos que OFF-atividade das células ganglionares podem ser gravadas nestes mutantes. Para determinar se os peixes mutantes sem OKR como o mutante nrc pode detectar incrementos de luz simples e decrementa nós desenvolvemos o teste do motor visuais comportamentais (VMR). Neste ensaio, larvas do peixe única são colocados em cada poço de uma placa de 96 poços permitindo o monitoramento simultâneo de larvas através de um sistema de vídeo monitoramento automatizado. As respostas locomotor de cada larva a 30 minutos-luz ON e 30 minutos OFF luz foram registrados e quantificados. WT peixes têm um pico breve da atividade motora sobre luzes ON, conhecida como a resposta de sobressalto, seguido pelo retorno a menor do que a atividade de base, chamada de congelar. Peixes WT também aumentar drasticamente sua atividade locomotora imediatamente após luzes apagadas e apenas gradualmente (durante vários minutos) retornar à atividade locomotora basal. Os mutantes nrc responder de maneira similar à luz OFF como peixes WT, mas apresentam uma ligeira redução em sua atividade média, em comparação aos peixes WT. Atividade motora em resposta à luz ON em nrc mutantes é atrasado e lento. Há um tempo de subida lenta da resposta mutante nrc à luz ON, em comparação com luz WT ON resposta. Os resultados indicam que os peixes nrc não são completamente cegos. Porque teleósteos podem detectar a luz através da retina não-tecidos, que confirmou que as respostas imediatas de comportamento à luz de intensidade mudanças requerem olhos intactos usando o chokh (chk) mutantes, o que falta completamente os olhos, desde os primeiros estágios de desenvolvimento. No nosso ensaio VMR, os mutantes chk não apresentam resposta de sobressalto a qualquer luz ON ou OFF, mostrando que os olhos laterais mediar esse comportamento. O ensaio aqui descrito VMR complementa o ensaio OKR bem estabelecido, que não testa a capacidade de larvas de peixe-zebra para responder às mudanças nas intensidades de luz. Além disso, a automação do ensaio VMR se presta a high-throughput screening para defeitos de intensidade leve-driven respostas visual.

Watch this Scientific Journal Video about A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities at JoVE.com

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

Nós desenvolvemos o Response Visual-Motor para quantificar a saída do motor de zebrafish larval em resposta aos aumentos de luz e diminui. Também examinamos os mutantes visão zebrafish, incluindo a resposta não optocinético (NRC) mutantes, que foram pensados ​​para serem completamente cego quando testado por um outro ensaio de visão, o reflexo optocinético.

Um Ensaio Comportamental para Medida de capacidade de resposta a alterações em Zebrafish intensidades de luz

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

a-behavioral-assay-to-measure-responsiveness-zebrafish-to-changes

Research

JoVE Journal

Biology

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

16.2K visualizações.  Harvard. Nós desenvolvemos o Response Visual-Motor para quantificar a saída do motor de zebrafish larval em resposta aos aumentos de luz e diminui. Também examinamos os mutantes visão zebrafish, incluindo a resposta não optocinético (NRC) mutantes, que foram pensados ​​para serem completamente cego quando testado por um outro ensaio de visão, o reflexo optocinético.

Vídeo: A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Microinjeções intravenosa de larvas do peixe para o Estudo de lesão renal aguda

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Biologia

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Ablação a laser da Pronephros Zebrafish para estudo da regeneração epitelial renal

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

Imunofluorescência combinados e FISH DNA em 3D preservado núcleos interfásicos para estudar mudanças na organização nuclear 3D

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Análise de apoptose em embriões Zebrafish por Whole-mount imunofluorescência para detectar Caspase 3 ativado

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

A metilação in vitro Ensaio de Proteína Estudo Arginina metilação

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Quantitative Reação de Imunofluorescência Indireta para medir a variação nos níveis de proteína no centrossomas

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Método de Avaliação de efeitos de uma gama de comprimentos de onda e intensidades de Terapia da Luz Vermelha / near-infrared sobre o estresse oxidativo<em&gt; In Vitro</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

Modulation of renal epithelial ion transport allows organisms to maintain ionic and osmotic homeostasis in the face of varying external conditions. The Drosophila&#160;melanogaster Malpighian (renal) tubule offers an unparalleled opportunity to study the molecular mechanisms of epithelial ion transport, due to the powerful genetics of this organism and the accessibility of its renal tubules to physiological study. Here, we describe the use of the Ramsay assay to measure fluid secretion rates from isolated fly renal tubules, with the use of ion-specific electrodes to measure sodium and potassium concentrations in the secreted fluid. This assay allows study of transepithelial fluid and ion fluxes of ~20 tubules at a time, without the need to transfer the secreted fluid to a separate apparatus to measure ion concentrations. Genetically distinct tubules can be analyzed to assess the role of specific genes in transport processes. Additionally, the bathing saline can be modified to examine the effects of its chemical characteristics, or drugs or hormones added. In summary, this technique allows the molecular characterization of basic mechanisms of epithelial ion transport in the Drosophila tubule, as well as regulation of these transport mechanisms.

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

This protocol describes the use of the Ramsay assay to measure fluid secretion rates from isolated Malpighian (renal) tubules from Drosophila melanogaster. In addition, the use of ion-specific electrodes to measure sodium and potassium concentrations in the secreted fluid, allowing calculation of transepithelial ion flux, is described.

A utilização do Ramsay ensaio para medir secreção de fluidos e Ion Flux Preços no<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Tubule Malpighian

Modulation of renal epithelial ion transport allows organisms to maintain ionic and osmotic homeostasis in the face of varying external conditions. The ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

Ensaio in vitro para medir Fosfatidiletanolamina Metiltransferase Atividade

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotoxina microinjeção no peixe-zebra ao modelo de lesão renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...