Die Finanzierung durch die Western University of Health Sciences College of Optometry zu DJC Verfügung gestellt. Besonderen Dank an Irisa Tam für Grafik-Design.

Alle Tierhaltung und Experimente sollte genehmigt und in Übereinstimmung mit Richtlinien, die von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der jeweiligen Institution oder sonstigen gesetzlichen Bestimmungen durchgeführt werden gesetzt. 1. Zebrafisch-Pflege <ol><li> Pflegen Zebrafisch unter Standardbedingungen bei 28,5 ° C auf einem 10 h-14 h dunkel Lichtzyklus 16. </li><li> Halten erwachsenen Zebrafisch an einem Tank Dichte von etwa 3 Fisch / L. </li></ol> 2. Optokinetischen Reaktion (OKR) <ol><li> Erstellen Sie die benutzerdefinierte OKR Aufnahmegerät mit einem 14,5 cm Durchmesser rotierende Trommel, ein Stereo-Mikroskop mit einstellbarer Lichtintensitätseinstellungen (300-8,000 Lux) und einen Computer (Abbildung 1a). <ol><li> Bringen Sie eine Kamera an das Mikroskop, die einen Live-Feed auf ein benachbartes Monitor bieten und damit für Bildaufnahme und Aufnahme. </li><li> Kontrolle der Rotationstrommel mit einem Mikrocontroller mit einem Computer verbunden wird, die AccommoDatum verschiedenen Geschwindigkeits-und Richtungs Auswahl. </li></ol></li><li> Anesthetize die Fische in 0,016% Tricaine für 2-3 min und dann den Fisch auf einer kleinen Plattform mit den Augen und Kiemen über den Rand aufgehängt. </li><li> Legen Sie eine dünne Schwamm / Tuch über den Körper der Fische und Pin 2-3 Schaumstoffstücke, geformt, um die Fische beherbergen, über die Fische zu halten, immobilisiert. Begrenzen der Bewegung des Schwanzes der Fische erwies sich als ein entscheidender Aspekt für die Immobilisierung ohne Verletzung des Fisch sein und am besten mit einem flachen Schaumstoffstück erreicht. (Abbildung 1b) </li><li> Positionieren Sie den Fisch in einem zylindrischen Wasser gefüllten Tank, das im Inneren der rotierenden Trommel des OKR Aufnahmegerät passt. Mit Magneten auf der Plattform, um den Fisch aufrecht, mit den Augen etwa 7,3 cm von der Kante der Trommel. Die Fische sollten aus der Narkose innerhalb von wenigen Minuten wieder zu beleben - normale Atmung wird wieder aufgenommen und zufällige Augenbewegungen zu beachten. </li><li> Legen Sie ein base Gitter von 0,07 Zyklen pro Grad (CPD) in die rotierende Trommel und in Eingriff mit den Computer steuert, um die Drehung und die Videoaufzeichnung zu beginnen (mit einer Geschwindigkeit von 12 UpM wurde dieses Papier verwendet, aber Geschwindigkeiten von 8-16 rpm sollten ähnliche Ergebnisse zu ergeben). </li><li> Sobald ein Anfangs OKR wird von der Basis Gitter hervorgerufen, halten Sie den Dreh kurz, und ersetzen Sie das Gitter mit einem kleineren Gitter (höhere räumliche Frequenz). </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis ein OKR nicht mehr eruiert werden. Wiederholen Sie den Test mit dem kleinsten Gitter, die eine OKR nach einem modifizierten Ansatz Treppe verursacht und wiederholen Sie dann mit dem Gitter, die eine Reaktion auf den Verlust des OKR überprüfen zu entlocken fehlgeschlagen. Dieses Verfahren kann wiederholt werden, um eine wahre Antwort auf den kleinsten nachweisbaren Gitter überprüfen, ob die letzte Gitter verändert gegenüber dem ersten Löschungsereignis. </li><li> Erhalten monokulare Sehschärfe Messungen, indem Sie einen schwarzen Plastikverschluss über den Streifen neben der gegenüberliegenden Auge. Wiederholen Sie den oben beschriebenen Vorgang (Schritte von 2,6 bis 2,7). </li><li>Besorgen Sie sich die Sehschärfe des anderen Auges durch Neupositionierung der Okkluder und Wiederholen der Schritte 2.6-2.7 wieder. </li><li> Notieren Sie den Abstand jedes Auge ist von den Streifen während der Testprozedur mit Hilfe der Referenzmessstreifen unter dem Aquarium, so dass genaue Sehschärfe Maßnahmen können in den folgenden Schritten berechnet werden. </li></ol> 3. Berechnung der Sehschärfe <ol><li> Besorgen Sie sich die Sehschärfe durch die Berechnung der cpd: <img alt="Gleichung 1" fo:content-width="0.7in" src="/files/ftp_upload/50832/50832eq1.jpg" width="70px" /> wobei a der Abstand von der Mitte der Linse zu dem Gitter, und h die Länge eines Zyklus der kleinsten Gitter an dem OKR beobachtet (Fig. 1c). </li><li> Zur kombinierten Messung der Sehschärfe, die gemittelte a-Wert von sowohl dem linken und rechten Auge verwendet wird. </li></ol>

<ol>
	<li>Brockerhoff, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+behavioral+screen+for+isolating+zebrafish+mutants+with+visual+system+defects.">A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10545-10549 (1995).</li><li>Neuhauss, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+disorders+of+vision+revealed+by+a+behavioral+screen+of+400+essential+loci+in+zebrafish.">Genetic disorders of vision revealed by a behavioral screen of 400 essential loci in zebrafish.</a> J. Neurosci. 19, 8603-8615 (1999).</li><li>Schumann, W. 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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Gelegentlich können die Fische in den Wassertank zu entkommen. Es ist kritisch, um den Schwanz zu immobilisieren. Zusätzlich ist die Verwendung einer dünnen Schwamm / Tuch über dem Körper des Fisches wurde auch gefunden, von unschätzbarem Wert zu halten, die Fische für längere Zeit ausgesetzt zu sein. Wir waren in der Lage, Fisch für mehr als 30 min immobilisiert mit diesem Verfahren, ohne die Fische zu halten. Diese Zeit ist mehr als ausreichend, um die beiden monokularen und binokularen Sehschärfe tun. Die Präsentation des Gitters kann entweder geschehen, wie hier und anderswo mit einer sich drehenden Trommel oder physisch durch die Vorlage einer digitalen Anzeige 18 bis 22 beschrieben. Beide Ausführungen haben Vor-und Nachteile. Wir entschieden uns, die physikalische Drehung sowohl aus Kostengründen und technischen Spezifikationen zu verwenden. Ohne den Computer-und Imaging-Geräte, kann die hier beschriebenen OKR Gerät für rund 150 Dollar gebaut werden. Der OKR ist ein Ziel, Mittel zur Bestimmung übermanuelle Schärfe bei erwachsenen Zebrafisch. Während mehrere andere visuomotorischen Assays für Vision haben in früheren Experimenten verwendet wurde und auch die ERG wurde erfolgreich in erwachsenen Zebrafisch Augen gemacht, obwohl es nicht zu stark in Anspruch genommen, die erwachsenen Zebrafisch OKR öffnet die Tür zu vielen neuen experimentellen Bedingungen 22. Diese Studie hat der OKR-Dienstprogramm in der Messung der Sehschärfe Veränderungen über die Zeit gezeigt, die Identifizierung Sehschärfe Unterschied in der Augenkrankheit Modelle und bei der Bestimmung monokulare Sehschärfe. Interessant ist, erwachsenen Zebrafisch Vision im Vergleich zu menschlichen Sehens (20/20) ca. 20/1, 000 (bei 0,60 cpd ist auf -0,3 logMAR umgerechnet). Obwohl dies schlecht scheinen, werden die Zebrafisch-Augen sehr gut für seine Umgebung geeignet. Trotz der visuellen Aufgabe der Blick durch 6,5 cm Wasser, ein paar Millimeter aus Polycarbonat, und einem anderen Zentimeter Luft, die Fische ganz gut durchführen! Wir fanden, dass die erwachsenen Zebrafisch Sehschärfe ist about 70%, was angesichts ihres Photorezeptors Abstand. 23. Kontrast vorhergesagt werden, dass mit einer optimalen menschlichen Leistung ~ 20/12 die etwa 80% der vorhergesagten 20/10, und OKR Technik zur Messung visuelle Fähigkeit in erwachsenen Zebrafisch ist beeindruckend 24 , 25. Die Technik der Messung unabhängig Auge Sehschärfen würde für Studien, in denen ein Auge behandelt werden konnte und die andere verwendet als Kontrolle zu ermöglichen. Zusätzlich könnten Fische mit asymmetrischen Entwicklung des Auges wie der lrp2/bugeye oder Fische, die Katarakt entwickeln genauer überwacht werden. Es sollte beachtet werden, dass darauf zu achten, genau zu messen Sie den Abstand von den Augen zu den Streifen und die volle Sichtfeld zu verschließen werden. Diese Technik sollte die Tür, um genauere und spezifische Maßnahmen der Zebrafisch-visuellen Funktion öffnen.

Zebrafisch (Danio rerio) sind ein gutes Modell, um visuelle Physiologie aufgrund der Ähnlichkeit ihrer Netzhaut zu anderen Wirbeltieren, ihren kurzen Lebenszyklus, und der Verfügbarkeit von genetisch veränderten Mutanten 1,2 studieren. Der optokinetische Reflex / Reaktion / Nystagmus (OKR) ist eine Kombination von glatten Streben und schnelle Sakkaden Augenbewegungen. Für mehr als 60 Jahren Kliniker haben gezeigt, dass der OKR kann zur objektiven Messung der Sehschärfe bei Patienten angewendet werden und ist besonders nützlich für die Bestimmung Säugling visuellen Fähigkeiten 3-5. Die erste aufgezeichnete Verwendung von OKR bei Tieren wurde mit Tauben in den 1950er Jahren sechs. Vor kurzem hat der Oberkirchenrat hat sich zu einem wertvollen Werkzeug für die Beurteilung der visuellen Funktion in Zebrafisch-Larven und wird häufig verwendet, um für die genetische Mutanten, die eine Sehbehinderung haben 1,2 Bildschirm. Während die OKR wurde weit verbreitet, um die visuelle Funktion in Zebrafisch-Larven festzustellen, hat es erst vor kurzem bei erwachsenen Zebra nachgewiesenfischen 7-10. Eine aktuelle Arbeit von Tappeiner et al. Nutzt einen handelsüblichen optomotorischen System traditionell für Mäuse verwendet, OptoMotry, um zu zeigen, dass die Sehschärfe des erwachsenen Zebrafisch bleibt ziemlich konstant, ~ 0,59 Zyklen pro Grad (cpd), auch über verschiedene Winkelgeschwindigkeiten 7 . Obwohl die OKR hat sich als sehr nützlich bei der Zebrafisch-Larven-Studien wurden andere Methoden für visuelle Verhalten im Zebrafisch Erwachsene mit unterschiedlichem Erfolg eingesetzt. Die Fluchtreaktion Test gezeigt, dass Albino-Zebrafisch und Rubin, beide Pigmentierung Mutanten haben visuelle Antworten in hellen Lichtverhältnissen 11,12 reduziert. Das gleiche Fluchtreaktion Test auch erfolgreich Nachtblindheit d Mutanten identifiziert, wenn auch in 2 Jahren 13. Jedoch ist die Fluchtreaktion Assay nicht ohne Mängel. Es ist schwierig, zu einer exakten visuellen Funktion zuschreiben und ist nur eine grobe approximation der optische Veränderungen - also dauert es eine große Veränderung bevor die Änderung erkannt wird. Eine weitere Methode, die zur Identifizierung von erwachsenen Zebrafisch mit Sehbehinderungen entwickelt wurde, ist der optomotorischen Reaktion (OMR) 11. In diesem Test werden die Fische in einem kreisförmigen Behälter mit einem undurchsichtigen Spalte in der Mitte. Schwarz-Weiß-Streifen drehen, um den Tank und die Fische schwimmen mit in Richtung der Streifenbewegung beauftragt. Wie die Fluchtreaktion, konzentriert sich die OMR auf den visuomotorischen Fähigkeiten des erwachsenen Zebrafisch. Es hat sich jedoch erfolgreich eingesetzt, um Fisch mit Sehbehinderungen, wie die 14 lrp2/bugeye Mutanten zu identifizieren. Die lrp2/bugeye Zebrafisch zeigen Buphthalmus, erhöhtem Augeninnendruck, verminderte OMR und progressive Degeneration der Netzhaut 14,15. Viele Studien haben die visuomotorische Fähigkeiten bei erwachsenen Zebrafischen, die oft subjektiv und kann nicht verwendet werden quantitatively analysiert. Durch die Verwendung des OKR, kann man die Sehschärfe von erwachsenen Fischen mehr objektiv zu studieren. Wir haben unsere eigenen OKR Gerät, nach einem zunächst für ein Larven-Studien verwendet, modelliert gebaut. In dieser Studie zeigen wir, dass der OKR kann verwendet werden, um sowohl die monokulare und binokulare Sehschärfe im Zebrafisch zu berechnen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="593">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:209px;">Super Low Light Black White Video Security Camera</td>
			<td style="width:143px;">Super Circuits</td>
			<td style="width:119px;">PC164CEX-2</td>
			<td style="width:124px;"> Any low light camera may be used</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:209px;">Arduino Duemilanove microcontroller</td>
			<td style="width:143px;">Adafruit Industries</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:124px;"> The Arduino Uno is also compatible with the speed control software.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tricaine Methanesulfonate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101107-950</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the optokinetic response as a quantitative measure of visual acuity in zebrafish

Zebrafische sind ein bewährtes Modell für Vision-Forschung, aber viele der früheren Verfahren in der Regel auf Fischlarven konzentriert oder demonstriert eine einfache Antwort. In jüngerer Erwachsener visuelle Verhalten im Zebrafisch hat sich von Interesse, sondern Methoden, um spezifische Reaktionen messen, neue kommen sind. Um diese Lücke zu schließen, machten wir uns, eine Methodik wiederholt und genau nutzen die optokinetische Reaktion (OKR), um die Sehschärfe bei erwachsenen Zebrafisch messen zu entwickeln. Hier zeigen wir, dass die Sehschärfe des erwachsenen Zebrafisch die gemessen werden kann, einschließlich der beiden Fernglas und monokulare Sehschärfe. Da der Fisch in dem Verfahren nicht geschädigt, kann die Sehschärfe gemessen und verglichen werden über kurze oder längere Zeit. Die hier beschriebenen Messungen Sehschärfe kann auch getan werden schnell so dass für hohen Durchsatz und für zusätzliche visuelle Verfahren, falls gewünscht. Diese Art der Analyse ist förderlich für Drogeninterventionsstudien oder Untersuchungen der Krankheitsprogression.

OKR-Device-Funktionalität Der OKR Gerät wie oben beschrieben und in Abbildung 1 dargestellten Funktionen mit minimalem Wartungsaufwand. Wie in Schritt 2.3 erwähnt, Immobilisierung der Schwanz ist entscheidend für die Beibehaltung der Fisch während der Aufnahme festgehalten. Ausreichend immobilisiert, können die Fische in der OKR Gerät für längere Zeit gehalten werden. Folglich sollte Sorgfalt während der Anfangs Immobilisierung Maßnahmen ergriffen werden, so dass mehr Daten für jeden einzelnen Fisch gesammelt werden. Die Sehschärfe Messungen Das Fernglas OKR leicht in normalen erwachsenen Fischen hervorgerufen. Nach dem Verfahren über einen Sehschärfen Zebrafisch für viele Altersgruppen (Abbildung 2) zu finden. Der beste Fernglas räumlichen Schärfe verzeichneten wir 0,74 cpd. Wie in Fig. 2 angegeben, der binokulare Sehschärfe Allgemeinen mit dem Alter zunimmt (n = 46, p = 0,002 ANOVA mit SPSS v14), aber einpendeltnach etwa 12 Monaten. Beim Vergleich der gemessenen Sehschärfe in 5 Monate alten Wildtyp-Fische Alter abgestimmte lrp2/bugeye Fisch, fanden wir, dass der Fisch hatte lrp2/bugeye Sehschärfe deutlich reduziert (p &lt;0,001; Wildtyp: 0,49 ± 0,05 cpd, n = 8; lrp2/bugeye: 0,35 ± 0,06, n = 10; Student-T-Test mit Excel). Durch Verschließen des rechten Auges die Sehschärfe des linken Auges bestimmt werden und umgekehrt. Im Vergleich zu der binokularen Sehschärfe wird binokularen Summa ähnlich menschliche Auge 17 (Fig. 3) beobachtet. Das binokulare Sehschärfe war in der Regel 5 bis 10% besser als entweder rechts (OD) oder links (OS) acuities unabhängig gemessen. Aus irgendeinem einzelnen Fische der Unterschied war eine Verbesserung um 25%. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50832/50832fig1.jpg" width="500px" /> Fig. 1 ist. OKR recoDing. A) Der OKR Gerät besteht aus einem 14,5 cm Durchmesser rotierenden Trommel und Mikroskop mit einstellbarer Lichtintensitätseinstellungen (300-8,000 Lux). Eine Kamera bietet einen Live-Feed auf einer benachbarten Monitor. Die Drehtrommel hat verschiedene Geschwindigkeiten in beiden Richtungen im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn und austauschbar Raumfrequenzgitter eingesetzt und entfernt nach Bedarf. B) Fisch befestigt sind und in der Mitte der rotierenden Trommel angeordnet ist. C) Zyklen pro Grad (cpd) berechnet wird mit cpd = <img alt="" src="img2.png" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50832/50832fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50832/50832fig2.jpg" width="500px" /> 2. Die Sehschärfe ändert sich mit dem Alter. Die Grafik zeigt, unabhängig Sehschärfe gemessen 5 -<html> 15 Monate in Alter. Das erhöht die Sehschärfe in der Regel während der ersten Jahre der Entwicklung und Schwänze sich ein wenig bei 15 Monaten (p = 0,002 ANOVA mit SPSS v14) dann. Jeder Punkt kann entweder für 1 oder mehrere Fische. Die Sehschärfe wird in Zyklen / Grad (cpd) gemessen. (N = 46 insgesamt, 8 auf 5 Monate, 4 auf 6 Monate, 7 auf 8 Monate, 6 auf 9 Monate, 11 auf 10 Monate, 2 mit 11 Monaten, 2 bei 12 Monaten und 6 auf 15 Monate). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50832/50832fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50832/50832fig3.jpg" width="500px" /> 3. Binocular Sehschärfe Summationseffekt. Das Fernglas (OU) Sehschärfe ist im allgemeinen höher, verglichen mit rechts (OD) oder links (OS) Augen acuities. In dieser speziellen Gruppe waren die OS acuities deutlich niedriger. (* P = 0,006, n = 8)jove.com/files/ftp_upload/50832/50832fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

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The Optokinetic Response as a Quantitative Measure of Visual Acuity in Zebrafish

Zebrafische haben ein wertvolles Werkzeug für viele Forschungsbereiche. Hier zeigen wir eine Methode, um eine visuelle Reaktion hervorzurufen und berechnen eine funktionale Sehschärfe im erwachsenen Zebrafisch.

Die optokinetischen Antwort als quantitatives Maß der Sehschärfe im Zebrafisch

Zebrafish are a proven model for vision research, however many of the  earlier methods generally focused on larval fish or demonstrated a simple  ...

the-optokinetic-response-as-quantitative-measure-visual-acuity

Research

JoVE Journal

Neuroscience

20.4K Aufrufe.  Western University of Health Sciences.  Zebrafische haben ein wertvolles Werkzeug für viele Forschungsbereiche. Hier zeigen wir eine Methode, um eine visuelle Reaktion hervorzurufen und berechnen eine funktionale Sehschärfe im erwachsenen Zebrafisch. 

Serie: The Optokinetic Response as a Quantitative Measure of Visual Acuity in Zebrafish

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

Doppel-Fluoreszenz- In situ Hybridisierung in Fresh Hirnschnitten

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Forschung

Neurowissenschaften

Hyponeophagia: A Measure of Anxiety in the Mouse

Before the present day, when fast-acting and potent rodenticides such as alpha-chloralose were not yet in use, the work of pest controllers was often hampered by a phenomenon known as "bait shyness". Mice and rats cannot vomit, due to the tightness of the cardiac sphincter of the stomach, so to overcome the problem of potential food toxicity they have evolved a strategy of first ingesting only very small amounts of novel substances. The amounts ingested then gradually increase until the animal has determined whether the substance is safe and nutritious. So the old rat-catchers would first put a palatable substance such as oatmeal, which was to be the vehicle for the toxin, in the infested area. Only when large amounts were being readily consumed would they then add the poison, in amounts calculated not to affect the taste of the vehicle. The poisoned bait, which the animals were now readily eating in large amounts, would then swiftly perform its function.
Bait shyness is now used in the behavioural laboratory as a way of measuring anxiety. A highly palatable but novel substance, such as sweet corn, nuts or sweetened condensed milk, is offered to the mice (or rats) in a novel situation, such as a new cage. The latency to consume a defined amount of the new food is then measured.
Robert M.J. Deacon can be reach at <a href="mailto:robert.deacon@psy.ox.ac.uk">robert.deacon@psy.ox.ac.uk</a>

Mice and rats, due to their innate cautiousness, are initially slow in consuming a novel food, particularly in a novel place. This hyponeophagia can readily be measured in the laboratory, even though laboratory animals are much less anxious than their wild counterparts

Hyponeophagia: A Measure of Anxiety in der Maus

Before the present day, when fast-acting and potent rodenticides such as alpha-chloralose were not yet in use, the work of pest controllers was often ...

A Dual Tracer PET-MRI Protocol for the Quantitative Measure of Regional Brain Energy Substrates Uptake in the Rat

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the rat. The developed method is a small-animal positron emission tomography (PET) protocol, in which&#160;11C-AcAc and 18F-fluorodeoxyglucose (18F-FDG) are injected sequentially in each animal. This dual tracer PET acquisition is possible because of the short half-life of 11C (20.4 min). The rats also undergo a magnetic resonance imaging (MRI) acquisition seven days before the PET protocol. Prior to image analysis, PET and MRI images are coregistered to allow the measurement of regional cerebral uptake (cortex, hippocampus, striatum, and cerebellum). A quantitative measure of 11C-AcAc and 18F-FDG brain uptake (cerebral metabolic rate; &#956;mol/100 g/min) is determined by kinetic modeling using the image-derived input function (IDIF) method. Our new dual tracer PET protocol is robust and flexible; the two tracers used can be replaced by different radiotracers to evaluate other processes in the brain. Moreover, our protocol is applicable to the study of brain fuel supply in multiple conditions such as normal aging and neurodegenerative pathologies such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases.

Small-animal positron emission tomography enables the assessment of the brain&#39;s two main energy substrates:&#160;glucose and ketones. In the present method, 11C-acetoacetate and 18F-fluorodeoxyglucose are injected sequentially in each animal, and their uptake is measured quantitatively in specific brain regions determined from the magnetic resonance images.

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the ...

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the surface of the cornea, electrical activity generated in response to light can be measured and used to assess the activity of retinal cells in vivo. This manuscript describes the use of the ERG to measure visual function in zebrafish. Zebrafish have long been utilized as a model for vertebrate development due to the ease of gene suppression by morpholino oligonucleotides and pharmacological manipulation. At 5-10 dpf, only cones are functional in the larval retina. Therefore, the zebrafish, unlike other animals, is a powerful model system for the study of cone visual function in vivo. This protocol uses standard anesthesia, micromanipulation and stereomicroscopy protocols that are common in laboratories that perform zebrafish research. The outlined methods make use of standard electrophysiology equipment and a low light camera to guide the placement of the recording microelectrode onto the larval cornea. Finally, we demonstrate how a commercially available ERG stimulator/recorder originally designed for use with mice can easily be adapted for use with zebrafish. ERG of larval zebrafish provides an excellent method of assaying cone visual function in animals that have been modified by morpholino oligonucleotide injection as well as newer genome engineering techniques such as Zinc Finger Nucleases (ZFNs), Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs), and Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9, all of which have greatly increased the efficiency and efficacy of gene targeting in zebrafish. In addition, we take advantage of the ability of pharmacological agents to penetrate zebrafish larvae to evaluate the molecular components that contribute to the photoresponse. This protocol outlines a setup that can be modified and used by researchers with various experimental goals.

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Elektroretinogramm Analyse der Sicht Antwort in Zebrafisch-Larven

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Gleichzeitig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionsprüfung von zwei Netzhäute von<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogramm-System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

Visuell evozierten Potential-Aufnahme in einem Rattenmodell für Experimentelle Optic Nerve Demyelinisierung

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

In vivo - Gentransfer auf Schwann - Zellen in der Nagerischiasnerv durch Elektroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model organisms such as the fruit fly, Drosophila melanogaster. Drosophila is useful for understanding the basic neurobiology underlying cognitive deficits resulting from mutations in genes associated with human cognitive disorders, such as intellectual disability (ID) and autism. This work describes a methodology for testing learning and memory using a classic paradigm in Drosophila known as courtship conditioning. Male flies court females using a distinct pattern of easily recognizable behaviors. Premated females are not receptive to mating and will reject the male&#39;s copulation attempts. In response to this rejection, male flies reduce their courtship behavior. This learned reduction in courtship behavior is measured over time, serving as an indicator of learning and memory. The basic numerical output of this assay is the courtship index (CI), which is defined as the percentage of time that a male spends courting during a 10 min interval. The learning index (LI) is the relative reduction of CI in flies that have been exposed to a premated female compared to na&#239;ve flies with no previous social encounters. For the statistical comparison of LIs between genotypes, a randomization test with bootstrapping is used. To illustrate how the assay can be used to address the role of a gene relating to learning and memory, the pan-neuronal knockdown of Dihydroxyacetone phosphate acyltransferase (Dhap-at) was characterized here. The human ortholog of Dhap-at, glyceronephosphate O-acyltransferase (GNPT), is involved in rhizomelic chondrodysplasia punctata type 2, an autosomal-recessive syndrome characterized by severe ID. Using the courtship conditioning assay, it was determined that Dhap-at is required for long-term memory, but not for short-term memory. This result serves as a basis for further investigation of the underlying molecular mechanisms.

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

This protocol describes a Drosophila learning and memory assay called courtship conditioning. This classic assay is based on a reduction of male courtship behavior after sexual rejection by a non-receptive premated female. This natural form of behavioral plasticity can be used to test learning, short-term memory, and long-term memory.

Drosophila Courtship Conditioning Als Maß für Lernen und Gedächtnis

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model ...

Using Optical Coherence Tomography and Optokinetic Response As Structural and Functional Visual System Readouts in Mice and Rats

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for the investigation of processes of neurodegeneration, neuroprotection and neuro-repair involving the visual system, as these often correlate well with retinal changes. As a functional readout, visually evoked compensatory eye and head movements are commonly used in experimental models involving the visual function. Combining both techniques allows a quantitative in vivo investigation of structure and function, which can be used to investigate the pathological conditions or to evaluate the potential of novel therapeutics. A great benefit of the presented techniques is the possibility to perform longitudinal analyses allowing the investigation of dynamic processes, reducing variability and cuts down the number of animals needed for the experiments. The protocol described aims to provide a manual for acquisition and analysis of high quality retinal scans of mice and rats using a low cost customized holder with an option to deliver inhalational anesthesia. Additionally, the proposed guide is intended as an instructional manual for researchers using optokinetic response (OKR) analysis in rodents, which can be adapted to their specific needs and interests.

A detailed protocol for the assessment of structural and visual readouts in rodents by optical coherence tomography and optokinetic response is presented. The results provide valuable insights for ophthalmologic as well as neurologic research.

Mit optischen Kohärenztomographie und optokinetischen Antwort als strukturelle und funktionelle visuelles System auslesen bei Mäusen und Ratten

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for ...

Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% of the total stroke-related mortality with an important morbidity in terms of neurological outcome. A delayed cerebral vasospasm (CVS) may occur most often in association with a delayed cerebral ischemia. Different animal models of SAH are now being used including endovascular perforation and direct injection of blood into the cisterna magna or even the prechiasmatic cistern, each exhibiting distinct advantages and disadvantages. In this article, a standardized mouse model of SAH by double direct injection of determined volumes of autologous whole blood into the cisterna magna is presented. Briefly, mice were weighed and then anesthetized by isoflurane inhalation. Then, the animal was placed in a reclining position on a heated blanket maintaining a rectal temperature of 37 &#176;C and positioned in a stereotactic frame with a cervical bend of about 30&#176;. Once in place, the tip of an elongated glass micropipette filled with the homologous arterial blood taken from carotid artery of another mouse of the same age and gender (C57Bl/6J) was positioned at a right angle in contact with the atlanto-occipital membrane by means of a micromanipulator. Then 60 &#181;L of blood was injected in the cisterna magna followed by a 30&#176; downward tilt of the animal for 2 minutes. The second infusion of 30 &#181;L of blood into the cisterna magna was performed 24 h after the first one. The individual follow-up of each animal is carried out daily (careful evaluation of weight and well-being). This procedure allows a predictable and highly reproducible distribution of blood, likely accompanied by intracranial pressure elevation that can be mimicked by an equivalent injection of an artificial cerebral spinal fluid (CSF), and represents an acute to mild-model of SAH inducing low mortality.

We described in this protocol a standardized subarachnoid hemorrhage (SAH) mouse model by a double injection of autologous whole-blood into the cisterna magna. The high degree of standardization of the double-injection procedure represents a middle-to-acute model of SAH with relative safety regarding mortality.

Doppelte Direkteinspritzung von Blut in die Cisterna Magna als Modell der subarachnoiden Blutung

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% ...