Agradecemos Santiago Suarez para a leitura crítica do manuscrito e Betty Cowgill de ajuda em fotografia. Agradecemos também aos revisores anônimos por seus comentários críticos. Este trabalho é suportada pela University of Delaware Research Fund.

1. Preparação de sulfato de protamina (PS) Pratos revestidos <ol><li> Preparar a solução de 1% de sulfato de protamina (PS) por adição de 0,5 g de PS em 50 ml de água destilada e desionizada (ddH2O) em um tubo de 50 ml. Agitar bem a alta velocidade num misturador de bancada à temperatura ambiente durante 1-2 horas para garantir a dissolução completa do PS. Esta solução pode ser guardada a 4 ° C durante pelo menos 3 meses (certifique-se dissolver completamente precipitado do tipo gel, antes de cada utilização) 3. </li><li> Dê uma manga de 60 mm x 15 mm de poliestireno placas de Petri e colocar para fora as duas tampas e fundos no banco. </li><li> Despeje solução PS 1% em cada prato (ambos os fundos e as tampas podem ser usados) apenas o suficiente para cobrir a superfície, deixe por pelo menos 2 min. A solução residual PS pode ser reutilizado muitas vezes dentro de 3 meses, quando armazenada a 4 ° C. </li><li> Local PS-tratados pratos num copo cheio de água destilada (dH2O). Deixe o copo sob execução dH 2 O, pelo menos,10 min. </li><li> Pratos PS-revestidos podem ser utilizados imediatamente ou ar seco para o armazenamento. Cubra-os para evitar o acúmulo de poeira. Eles podem ser armazenados à temperatura ambiente por 1 mês 3. </li></ol> 2. Obter Sea Urchin Gametas e imobilizar os ovos em um prato PS-revestido para microinjeção <ol><li> Ouriços do mar de Spawn por agitação ou injecção intracoelomática de até 1 ml de 0,5% de KCl para induzir a contracção da musculatura lisa para libertar gâmetas 3 (Figura 2). </li><li> Se o animal é um macho, como indicado pela cor branca de esperma, recolher seco esperma a partir da superfície de um animal para um tubo de 1,5 ml. Esperma seco pode ser armazenado a 4 ° C durante uma semana sem perda significativa da função biológica. </li><li> Se o animal é uma fêmea, como indicado pela cor amarela devido ao teor de gema de ovo, recolher os seus gâmetas por imersão dos gonopores num copo cheio de água do mar. Os ovos serão liberados a partir de gonopores e estabelecer-se pela gravidade. &lt;/ Li&gt; <li> Filtrar os ovos de detritos, como espinhos animais usando 80 um filtro de malha de nylon. Os melhores resultados são obtidos se os ovos são utilizados dentro de 5-7 h após a desova. </li><li> Dejelly os ovos: <ol><li> Preparar 100 ml de água do mar ácida para cerca de 1 ml de ovo. Use ácido cítrico 0,5 M para ajustar o pH da água do mar a partir de pH 8,0 para 5,1-5,2. Muito baixo de um pH diminuirá fertilização e muito alto de um pH não vai permitir que os ovos para anexar as placas revestidas PS. </li><li> Adicione os ovos (não mais do que 1 ml) de água do mar ácida e permitir que os ovos para assentar sobre gelo durante 10 min. Alternativamente, a remoção do revestimento de gelatina pode ser facilitada por agitação suave do que os ovos durante o tratamento. Pode-se efetivamente dejelly ovos de S. purpuratus em 3-4 min desta forma. </li><li> Com cuidado, despeje a água do mar ácida, adicione a água fresca do mar e deixar que os ovos se estabelecer no gelo novamente. Ovos Dejellied pode ser armazenado em gelo durante até 6 horas sem problemas de fertilização </li></ol></li&gt; </ol> 3. Linha do Eggs <ol><li> Prepare uma solução de estoque de M 3-aminotriazole (3-AT, PM = 84,08) através da dissolução de 0,84 g de 3-AT, em 10 ml de ddH 2 O. Esta solução pode ser guardada a 4 ° C durante até 6 meses. </li><li> Preparar uma solução de trabalho mM de 3-AT por adição de 50 ul de uma solução de estoque M a 50 ml de água do mar previamente arrefecido. Manter a solução em gelo. </li><li> Prepare pipeta boca (Figura 3) para manuseio suave dos ovos: <ol><li> Ponteira é puxado manualmente a partir de micropipetas de vidro (100 x 1,09 milímetros OD). Segure a micropipeta com ambas as mãos sobre a chama aberta. Como o vidro começa a derreter, puxar cuidadosamente as pontas da pipeta em direcções opostas. </li><li> Conecte uma puxada pipeta a um tubo de plástico (ID 1,14 milímetros), o selo apertado com Parafilm. O comprimento do tubo deve ser de aproximadamente de 50-70 cm. </li><li> Insira uma P20 ou P200 ponta filtrada estéril no fim do tubo oposto ao tubo de vidro deser utilizado como parte de boca. </li><li> Clipe da ponta da micropipeta de vidro com uma tesoura para ajustar o diâmetro da ponta. O diâmetro óptimo excede ligeiramente o diâmetro do ovo (80 mM). </li></ol></li><li> Despeje 4 ml de 1 mM de 3-AT água do mar em cada prato PS-revestido (em baixo ou tampa). </li><li> Tome a pipeta boca, coloque a ponta P20/P200 na boca e prenda-o com os dentes. Para aspirar ovos, primeiro aspirar uma pequena quantidade de água do mar. Por ter uma coluna de líquido antes de carregar os ovos, uma terá máximo controle sobre a técnica de pipetagem boca. </li><li> Posicione a ponta da micropipeta perto dos ovos e aspirar suavemente em várias centenas de ovos na pipeta. Confinar os ovos dentro da micropipeta de vidro. </li><li> Row dejellied ovos em uma linha reta em um prato suavemente soprando-los para fora da pipeta boca enquanto se move a ponta em uma linha reta. Linha dos ovos imediatamente antes das injeções, porque os problemas de fertilização pode ocorrer devido ao prolonged exposição a 3-AT água do mar 3. Além disso, os adesivos catiónicos como o PS pode ser tóxico para ovos, e que não é aconselhável para expor embriões destes reagentes por longos períodos, especialmente se os envelopes de fertilização ter sido removido. </li><li> Faça um arranhão no prato perto da linha de ovos remado usando uma pipeta de vidro. Este zero será importante para quebrar a agulha de injecção para ajustar o fluxo de solução, conforme necessário. Alternativamente, o zero pode ser feita antes de derramar 3-AT água do mar para o prato. </li></ol> 4. Microinjeção do Mar Urchin zigotos <ol><li> Ligue estação de microinjeção. Aqui nós descrevemos o uso de sistema de injeção FemtoJet. </li><li> Puxe capilares injeção usando um extrator de agulha. Um exemplo de um bom agulha está representado na Figura 4. Nota: Para injeções de RNA, os capilares de injeção devem ser pré-tratados para evitar a contaminação RNAase 31: <ol><li> Coloque capilares de injeção em 50 ml cônicotubos e adicionar 50 ml de metanol / HCl filtrada (9:1). Agite bem e deixe durante a noite para não mais do que 10 horas. </li><li> Decantar o metanol / HCl e enxaguar os capilares 2x com metanol filtrada no mesmo tubo. </li><li> Drenar o metanol, tanto quanto possível, e liofilizar de capilares durante a noite para assegurar a remoção completa do metanol. </li></ol></li><li> Monte cuidadosamente o capilar agulha em um suporte de agulha carga e carregá-lo com &lt;0,5 mL de uma solução de amostra usando dicas Microloader. As soluções de amostra normalmente contêm 20% de glicerol, de acordo com o material injectado 3. </li><li> Coloque o prato com ovos remavam no palco microscópio (ovos devem estar alinhados verticalmente quando visto através oculares) e concentrar-se nos ovos. </li><li> Cuidadosamente montar a agulha carregada no suporte de agulha microinjecção e ajustar a posição da agulha ter uma ponta perfeitamente centrada no meio do campo. </li><li> Pressione o botão para aplicar a pressão máxima for limpeza da agulha. Solução deve sair da agulha. Regule a pressão, se necessário: a pressão de injecção deve estar no intervalo de 90-360 hPa, com a pressão de compensação de cerca de 1/3 da pressão de injecção. </li><li> Ajuste o fluxo da solução através da injeção em óvulo não fertilizado. Usando um micromanipulador joystick, direcionar a ponta da agulha de injeção para o óvulo não fertilizado. Para facilitar a entrada da agulha, criar um ligeiro tremor agitando ligeiramente do palco com um objeto duro, como uma chave de fenda. Uma injecção de bolus formando dentro do ovo deve ser visto (Figura 5). </li><li> Se o bolo de injecção não é visível, aumentar ligeiramente a ponta da agulha acima dos ovos, localizar a zero no prato e ajustá-lo para ser posicionado no meio do campo. Bata levemente a ponta da agulha para a marca zero para quebrar a ponta da agulha de injeção. Ajustar as pressões de injecção e de compensação para assegurar que o bólus não exceder 1/5 do tele diâmetro do ovo (1-2 horas). </li><li> Uma vez que a injecção de bolus é calibrado, fertilizar os ovos por adição de esperma diluído (1:1000) ou 1-2 ul de esperma. Misture bem com cuidado para evitar a retirada da linha de ovos. </li><li> Iniciar injecções imediatamente após a fertilização do envelope torna-se visível (Figura 5). Mover ao longo da linha de ovos remavam usando o controlador de palco e injetar tantos zigotos possível, cutucando-os com a agulha controlado por joystick micromanipulador. </li><li> Depois de 10-15 minutos, os ovos recentemente fertilizados se tornará endurecido e não pode ser injectado mais. Retire o prato do palco e aspirar cuidadosamente para fora o esperma em 3-AT água do mar usando uma pipeta Pasteur de plástico. </li><li> Não deixe que os zigotos seco. Adicione rapidamente a água prechilled fresco do mar para cobrir o prato. Incubar os embriões a 15 ° C. </li></ol>

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	<li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem. Biophys.Res. Commun. 230, 376-380 (1997).</li><li>Peng, H., Wu, Y. Y., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Delivery+of+DNA+and+Morpholinos+into+Mouse+Preimplantation+Embryos+by+Electroporation.">Efficient Delivery of DNA and Morpholinos into Mouse Preimplantation Embryos by Electroporation.</a> Plos One. 7, 13 (2012).</li><li>Ettensohn, C. A., Wray, G. A., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> eds. Development of sea urchins, ascidians, and other invertebrate deuterostomes: experimental approaches. 74, (2004).</li><li>Franks, R. R., Houghevans, B. R., Britten, R. J., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+introduction+of+cloned+DNA+into+the+sea+urchin+zygote+nucleus,+and+fate+of+injected+DNA.">Direct introduction of cloned DNA into the sea urchin zygote nucleus, and fate of injected DNA.</a> Development. 102, 287-299 (1988).</li><li>Kinsey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+signaling+pathways+in+zebrafish+development+by+microinjection.">Analysis of signaling pathways in zebrafish development by microinjection.</a> Methods Mol. Biol. 518, 67-76 (2009).</li><li>Kola, I., Sumarsono, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+in+vitro+transcribed+RNA+and+antisense+oligonucleotides+in+mouse+oocytes+and+early+embryos+to+study+the+gain-+and+loss-of-function+of+genes.">Microinjection of in vitro transcribed RNA and antisense oligonucleotides in mouse oocytes and early embryos to study the gain- and loss-of-function of genes.</a> Mol. Biotechnol. 6, 191-199 (1996).</li><li>Mishina, T., Fuchimukai, K., Igarashi, K., Tashiro, K., Shiokawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+secondary+head-forming+activity+of+microinjected+a+dagger+beta-catenin+mRNA+by+co-injected+spermine+and+spermidine+in+Xenopus+early+embryos.">Modification of secondary head-forming activity of microinjected a dagger beta-catenin mRNA by co-injected spermine and spermidine in Xenopus early embryos.</a> Amino Acids. 42, 791-801 (2012).</li><li>O'Meara, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+bovine+zygotes:+siRNA+transfection+versus+microinjection.">Gene silencing in bovine zygotes: siRNA transfection versus microinjection.</a> Reprod. Fertil. Dev. 23, 534-543 (2011).</li><li>Dean, D. A., Gasiorowski, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+gene+delivery.">Nonviral gene delivery.</a> Cold Spring Harb. Protoc. , (2011).</li><li>Hiramoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+division+without+mitotic+apparatus+in+sea+urchin+eggs.">Cell division without mitotic apparatus in sea urchin eggs.</a> Exp. Cell Res. 11, 630-636 (1956).</li><li>Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. 25, (1982).</li><li>Gross, J. M., McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Brachyury+(T)+during+gastrulation+movements+in+the+sea+urchin+Lytechinus+variegatus.">The role of Brachyury (T) during gastrulation movements in the sea urchin Lytechinus variegatus.</a> Dev. Biol. 239, 132-147 (2001).</li><li>Yajima M, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomy+in+specification+of+primordial+germ+cells+and+their+passive+translocation+in+the+sea+urchin.">Autonomy in specification of primordial germ cells and their passive translocation in the sea urchin.</a> Development. 139, 3786-3794 (2012).</li><li>Duboc, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+and+BMP2/4+pattern+the+mesoderm+and+endoderm+during+development+of+the+sea+urchin+embryo.">Nodal and BMP2/4 pattern the mesoderm and endoderm during development of the sea urchin embryo.</a> Development. 137, 223-235 (2010).</li><li>Ernst, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Offerings+from+an+Urchin.">Offerings from an Urchin.</a> Dev. Biol. 358, 285-294 (2011).</li><li>McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology:+sea+urchins.">Evolutionary crossroads in developmental biology: sea urchins.</a> Development. 138, 2639-2648 (2011).</li><li>Sodergren, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+article+-+The+genome+of+the+sea+urchin+Strongylocentrotus+purpuratus.">Research article - The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus.</a> Science. 314, 941-952 (2006).</li><li>Roux, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+genomic+and+proteomic+perspective+of+sea+urchin+calcium+signaling+and+egg+activation.">A functional genomic and proteomic perspective of sea urchin calcium signaling and egg activation.</a> Dev. Biol. 300, 416-433 (2006).</li><li>Turner, P. R., Sheetz, M. P., Jaffe, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+increases+the+polyphosphoinositide+content+of+sea+urchin+eggs.">Fertilization increases the polyphosphoinositide content of sea urchin eggs.</a> Nature. 310, 414-415 (1984).</li><li>Voronina, E., Marzluff, W. F., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+B+synthesis+is+required+for+sea+urchin+oocyte+maturation.">Cyclin B synthesis is required for sea urchin oocyte maturation.</a> Dev. Biol. 256, 258-275 (2003).</li><li>Wong, J. L., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+modifications+at+fertilization:+regulation+of+dityrosine+crosslinking+by+transamidation.">Extracellular matrix modifications at fertilization: regulation of dityrosine crosslinking by transamidation.</a> Development. 136, 1835-1847 (2009).</li><li>Shuster, C. B., Burgess, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitions+regulating+the+timing+of+cytokinesis+in+embryonic+cells.">Transitions regulating the timing of cytokinesis in embryonic cells.</a> Curr. Biol. 12, 854-858 (2002).</li><li>Morris, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cytoskeletal+and+motility+proteins+in+the+sea+urchin+genome+assembly.">Analysis of cytoskeletal and motility proteins in the sea urchin genome assembly.</a> Dev. Biol. 300, 219-237 (2006).</li><li>Minc, N., Burgess, D., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Cell+Geometry+on+Division-Plane+Positioning.">Influence of Cell Geometry on Division-Plane Positioning.</a> Cell. 144, 414-426 (2011).</li><li>Davidson, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+regulatory+network+for+development.">A genomic regulatory network for development.</a> Science. 295, 1669-1678 (2002).</li><li>Oliveri, P., Tu, Q., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+regulatory+logic+for+specification+of+an+embryonic+cell+lineage.">Global regulatory logic for specification of an embryonic cell lineage.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5955-5962 (2008).</li><li>Peter, I. S., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+regulatory+network+controlling+the+embryonic+specification+of+endoderm.">A gene regulatory network controlling the embryonic specification of endoderm.</a> Nature. 474, (2011).</li><li>Nam, J. M., Dong, P., Tarpine, R., Istrail, S., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cis-regulatory+genomics+for+systems+biology.">Functional cis-regulatory genomics for systems biology.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3930-3935 (2010).</li><li>Showman, R. M., Foerder, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+the+fertilization+membrane+of+sea-urchin+embryos+employing+aminotriazole.">Removal of the fertilization membrane of sea-urchin embryos employing aminotriazole.</a> Exp. Cell Res. 120, 253-255 (1979).</li><li>Lepage, T., Sardet, C., Gache, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+expression+of+the+hatching+enzyme+gene+in+the+sea-urchin+embryo.">Spatial expression of the hatching enzyme gene in the sea-urchin embryo.</a> Dev. Biol. 150, 23-32 (1992).</li><li>Jaffe, L. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microinjection+of+oocytes,+eggs,+and+embryos.">Quantitative microinjection of oocytes, eggs, and embryos.</a> Development of Sea Urchins, Ascidians, and Other Invertebrate Deuterostomes: Experimental Approaches. 74, 219-242 (2004).</li></ol>

Os autores declaram não competindo interesses financeiros ou outros conflitos de interesse.

A microinjecção é uma técnica poderosa para entregar vários tratamentos, tais como o ADN, ARNm, proteínas recombinantes, perda de função e ganho de reagentes funcionais, corantes e as suas combinações em ovos, embriões, e as células de vários organismos 1-7. No entanto, várias considerações devem ser mantidos em mente ao projetar um experimento de microinjeção. É criticamente importante considerar a solubilidade do tratamento entregue e o volume de injecção. S...

Entrega eficiente e reprodutível tratamento é um dos principais desafios metodológicos para os investigadores. Vários métodos têm sido estabelecidos para entregar transitoriamente soluções de tratamento para os ovos, embriões e células. Estes métodos incluem electroporação (com base em um gerando poros transientes na membrana utilizando impulsos eléctricos curtos) 1,2, lipofecção (entrega através da fusão de lipossomas contendo de tratamento com a membrana) 1, bombardeamento com micropartículas 1 (ADN é precipitado na mícron partículas de dimensão de metal que são, então, utilizadas para penetrar as células a alta velocidade), e transdução (vírus é utilizado como um veículo de entrega de transgenes). No momento, a microinjecção é a única abordagem que tem a vantagem de fornecer uma solução com uma eficiência de 100%, com o mínimo de reagentes. Além disso, uma única solução para injecção pode ser composto por um complexo coquetel de tratamentos. Esta técnica tem sido utilizada para o sucessoly microinject os ovos e embriões de várias espécies, como ouriços do mar, 3,4 zebra peixe 5, 6 rato, sapo 7 e 8 de gado, bem como as células individuais na cultura de tecidos 9. Blastômeros Solteiro injeções em fases posteriores de desenvolvimento também foram realizados 10-12. Os métodos atuais de microinjeções são baseados no método de pressão de injeção, que foi inicialmente descrita por Hiramoto 10, no entanto, grandes progressos foram feitos no sentido de otimização deste processo. Técnicas de microinjeção Excelentes foram descritos em outro 11, e aqui nós descrevemos um dos métodos específicos que atualmente é usado para microinject ouriço do mar (Strongylocentrotus purpuratus) ovos recém-fertilizados. Por mais de um século, ouriços do mar têm sido um valioso modelo experimental 15,16. Ouriços do mar são evolutivamente intimamente relacionado com cordados (incluindo nós) e análise deseu genoma revelou que contêm todas as principais famílias de genes como o 17 humana. Eles produzem um grande número de embriões em desenvolvimento sincronicamente transparentes que podem ser facilmente manipuladas. Usando ouriço do mar como um organismo modelo, a comunidade ouriço do mar tem contribuído para o nosso entendimento do processo de fertilização 18-21, processos biológicos celulares 22-24, e as redes de regulação gênicas (GRNs) 25-28. Microinjeção em zigotos ouriço-do-mar requer várias etapas. Em primeiro lugar, os ovos devem ser imobilizada antes das injecções (descrito abaixo). Pratos de micro-injecção são revestidas com sulfato de protamina (PS), que cria uma superfície positivamente carregada a que os ovos carregados negativamente podem aderir 3. Os ovos são dejellied por incubação em água do mar acidificada (pH 5,15) durante 10 min, seguido por duas lavagens em água do mar natural ou de água do mar artificial (pH 8,0). Os ovos são cuidadosamente dejellied remou em uma linha retano meio do prato de PS-revestido na presença de 1 mM de 3-aminotriazole (3-AT), que é necessária para inibir a actividade da ovoperoxidase, que é segregada a partir dos grânulos corticais do ovo como um resultado de fertilização 29. Esta etapa é importante para prevenir o endurecimento do invólucro de fertilização e de facilitar a entrada da agulha de microinjecção. Como uma alternativa para 1 mM de 3-AT, 10 mM de ácido paraminobenzoic (PABA) pode ser utilizado. A solução injectável é carregado para uma agulha de microinjecção utilizando ponta microloading pipeta especializado e montado sobre um suporte ligado a micromanipulador e da unidade de pressão (Figura 1). Cada agulha pode ser usado para microinject zigotos individuais em várias experiências em dias separados. Microinjecção pode ser realizada durante 10-15 minutos, até os zigotos endurecer. Os zigotos foram então lavadas com a água do mar e cultivadas a 15 ° C. Quando os embriões atingem incubação blastula fase, eles liberam enzimas incubação que digere componentes da fertilization envelope 30 e permitir-lhes retirar naturalmente a partir do prato de PS-revestido. Se necessário, os embriões podem ser suavemente separado do prato usando uma pipeta de boca ou pipeta Pasteur soprando suavemente por água do mar para os embriões. O método descrito permite a microinjecção eficiente e fiável de 100-400 ovos recentemente fertilizados num prato único, fornecendo um método de alto rendimento para a análise a jusante.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:793px;" width="794">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass pasteur pipettes</td>
			<td style="width:200px;">VWR</td>
			<td style="width:211px;">14673-043</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Inverted microscope Axiovert 40C</td>
			<td style="width:200px;">Zeiss</td>
			<td style="width:211px;">4109431007990000</td>
			<td>Injection microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microloader tips</td>
			<td style="width:200px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:211px;">5242 956.003</td>
			<td style="width:167px;">Load injection solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nylon filter mesh 80 &#956;m</td>
			<td style="width:200px;">Amazon.com</td>
			<td style="width:211px;">03-80-37</td>
			<td style="width:167px;">Filter eggs to get rid of debris</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:211px;">02707432 or 02707430</td>
			<td style="width:167px;">Part of a mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Parafilm</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:211px;">13 374 12</td>
			<td style="width:167px;">Part of a mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polyethylene tubing</td>
			<td style="width:200px;">Intramedic</td>
			<td style="width:211px;">PE-160</td>
			<td style="width:167px;">Part of a mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Protamine sulfate</td>
			<td style="width:200px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td style="width:211px;">194729</td>
			<td style="width:167px;">Attach dejellied eggs to injection dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sea urchins S. purpuratus</td>
			<td>Pt. Loma Marine Invertebrate Lab</td>
			<td style="width:211px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sea water</td>
			<td style="width:200px;">any pet store</td>
			<td style="width:211px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:211px;">0875713A</td>
			<td style="width:167px;">Injection dishes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1</td>
			<td style="width:200px;">Narishige</td>
			<td style="width:211px;">9124</td>
			<td>Manipulate injection needle</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND</td>
			<td style="width:200px;">Narishige</td>
			<td style="width:211px;">9212</td>
			<td>Manipulate injection needle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Transfer pipettes</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:211px;">13-711-9AM</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vertical needle puller </td>
			<td style="width:200px;">Narishige</td>
			<td style="width:211px;">PC-10</td>
			<td>Pull injection needles</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput microinjections of sea urchin zygotes

Microinjecção de células e de embriões é uma técnica comum que é usado para o estudo de uma ampla gama de processos biológicos. Neste método, uma pequena quantidade de solução de tratamento é colocado numa agulha de microinjecção que é utilizado para injectar células imobilizadas fisicamente ou embriões individuais. Apesar da necessidade de formação inicial para realizar esse procedimento para entrega de alto rendimento, a microinjeção oferece o máximo de eficiência e entrega reprodutível de uma ampla variedade de soluções de tratamento (incluindo misturas complexas de amostras) em células, ovos ou embriões. Aplicações para microinjeções incluem entrega de construções de DNA, mRNAs, proteínas recombinantes, ganho de função e perda de reagentes de função. Corante fluorescente ou colorimétrica é adicionado à solução injectada para permitir a visualização instantânea de entrega eficiente, bem como uma ferramenta para a normalização fiável da quantidade de solução apresentadas. O método descrito permite microinjeção de 100-400 mar ouriço-do-zygotes dentro de 10-15 minutos.

GFP e mCherry construções repórter foi transcrito in vitro e microinjectado em ovos recentemente fertilizados. Os embriões foram incubados a 15 ° C durante 24 horas (até a fase de blástula) e fotografada usando Zeiss Observador Z1 microscópio. Injecção de construções repórter não conduziu a quaisquer defeitos do desenvolvimento (Figura 6). Para a quantificação dos sinais fluorescentes, a aquisição de imagem foi realizada a baixa ampliação (100X) para capturar maximamente pix...

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High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

A microinjecção é uma técnica comum usada para fornecer estruturas de ADN, ARNm, oligonucleidos morfolino anti-sentido ou outros tratamentos em ovos, embriões, e as células de várias espécies.

High Throughput microinjeções de ouriço do mar zigotos

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

high-throughput-microinjections-of-sea-urchin-zygotes

Research

JoVE Journal

Biology

14.4K visualizações.  University of Delaware.  A microinjecção é uma técnica comum usada para fornecer estruturas de ADN, ARNm, oligonucleidos morfolino anti-sentido ou outros tratamentos em ovos, embriões, e as células de várias espécies. 

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Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Microinjeções intravenosa de larvas do peixe para o Estudo de lesão renal aguda

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Biologia

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

Alto rendimento Yeast Tela superexpressão Plasmid

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

Alto rendimento Assay Sacarificação para materiais lignocelulósicos

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

De alto rendimento de purificação de afinidade com tag Proteínas Recombinantes

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

Purificação Citometria de Fluxo com base em<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zigotos

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

De alta capacidade de Titulação de luciferase expressando recombinantes Vírus

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and evolution of developmental processes. The sea star, Patiria miniata, is gaining prevalence as a model system for these types of studies which were previously performed almost exclusively in the sea urchins, Strongylocentrotus purpuratus and Lytechinus variegatus. An advantage of these model systems is the ease of producing modified embryos in which a particular gene is up or downregulated, labeling a group of cells, or introducing a reporter gene. A single microinjection method is capable of creating a wide variety of such modified embryos. Here, we present a method for obtaining gametes from P. miniata, producing zygotes, and introducing perturbing reagents via microinjection. Healthy morphant embryos are subsequently isolated for quantitative and qualitative studies of gene function. The availability of genome and transcriptome data for this organism has increased the types of studies that are performed and the ease of executing them.

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Methods that produce morphant embryos are essential to study developmental mechanisms and gene regulatory networks. The sea star Patiria miniata is an emerging model system for these studies. Here we present a protocol for obtaining gametes, producing cultures of embryos, and rapid microinjection of zygotes from this species.

Um Método para microinjeção de<em&gt; Patiria minata</em&gt; zigotos

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Recuperação de Zebrafish Adulto Corações para aplicações de alto rendimento

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Rastreio de alto rendimento para moduladores químicos de Genes Post-transcriptionally Regulamentados

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identificação de pares Kinase-substrato utilizando High Throughput Screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...