Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation IOS e IOS 0844948 1024811

Mantenha toda a água do mar ou água do mar artificial (SW), os animais adultos, e as culturas a 15 ° C, tanto quanto é prático. Assegurar ovos e zigotos são mantidos imersos em SW. Sais do mar preparados comercialmente reconstituídas com água destilada ou de osmose serve também como uma fonte de SW. Verifique salinidade utilizando um densímetro e ajustar sais ou água para atingir níveis ótimos. Manter os níveis de gravidade específica entre 1,020-1,025. Mantenha todos os vidros e de plástico separado de todos os outros materiais de laboratório para evitar a contaminação com produtos químicos. Limpo embrião grau laboratorial, por lavagem com água desionizada ou saturando ocasional em hipoclorito de sódio diluído seguido por lavagem várias vezes em água. 1 Obtenção e amadurecimento gâmetas provenientes Patiria miniata Adultos <ol><li> Selecione um animal para extirpar gônadas. Determinar o sexo após a excisão, procurando a presença de ovários ou testículos porque P. miniata não estão sexually dimórfico. </li><li> Cortar uma pequena abertura, não maior do que 1 cm, ao longo do lado de um braço de estrela do mar com uma lâmina de bisturi (Figura 1A). Usando pequenos fórceps encerrou-Blunt puxar para trás bordas da incisão para acessar o tecido gonadal e puxe o tecido gonadal através da incisão. NOTA: Evitar a puxar para fora o tecido intestinal, que é um tecido cinzento ou castanho solto (Figura 1B). Os ovários são tipicamente laranja, amarelo ou marrom claro (Figura 1C), enquanto que os testículos são brancas ou bege e quando perturbado fará com que a água do mar para se tornar leitosa ou um aspecto turvo (Figura 1D). </li><li> Voltar fêmeas para os aquários. Isolar machos para uma ou duas horas em um recipiente de SW desde o stress da manipulação pode induzir a desova. Animais curar ao longo do local da incisão e continuar a fornecer gametas por vários meses. </li><li> Recolhe testículos para um tubo Eppendorf de 1,5 ml com tão pouco quanto possível SW e armazenar em gelo até à utilização. Guarde todos os testículos não nosed no dia da coleta, a 4 ° C por até uma semana. </li><li> Colete ovários em uma pequena cultura prato de vidro em um vários mililitros de SW. Para libertar os oócitos a partir do tecido do ovário, desmembrar o tecido com dois pares de pinças até não permanecer pedaços grandes. NOTA: O ideal é que a maioria dos oócitos estão completamente desenvolvidos. Esses oócitos são grandes, redondos, e claro amarelo ou marrom claro com uma vesícula germinal distinta no oócito (Figura 2A), em comparação com o subconjunto de oócitos subdesenvolvidos que são menores, marrom, granulado e opaco (Figura 2B). Se for maior que cerca de 25% dos oócitos são da variedade subdesenvolvido, selecione uma mulher diferente para obter oócitos. </li><li> Despeje os oócitos ou tecido remanescente por meio de uma taça de filtro de malha com um tamanho de poro de 200 um e recolher fluir. Isto irá conter todas as variedades de oócitos, mas remover o tecido ovariano. Desalojar ovócitos remanescentes do tecido detectada pelo filtro pulverizando wom SW a partir de uma garrafa de esguicho. Copos de filtro são feitas utilizando um tubo de 50 ml (Figura 3A-A &#39;). </li><li> Verter o fluxo através do passo 1.6 por meio de uma taça de filtro de malha de 100 um. Descarte pequenos oócitos em fluxo através. Oócitos grandes plenamente desenvolvidos que estão prontos para a maturação vai ficar no filtro. Lavar os oócitos em uma limpeza 200 ml. </li><li> Adicionar 95 ml de SW para a proveta de vidro de 200 ml de oócitos. Adicionar 5 ml de 200 uM 1-metiladenina para uma concentração final de 10 uM. </li><li> Transferir os oócitos a uma grande placa de cultura e raso lugar a 15 ° C. Uma grande área de superfície para volume do prato de cultura permite a troca de oxigénio. Os ovócitos não amadurecem ou pode não se desenvolver bem, se eles estão superlotadas durante esta fase de maturação. Quebrar em vários pratos de SW mais 10 mM 1-methlyadenine até que a cultura é inferior a 200 ovócitos / ml. </li><li> Permitir que os ovócitos de amadurecer durante 45-90 minutos, mas não mais como isso vai tornar os oócitos incapazes de ser fertilized. Para determinar se a maturação for concluída, olhar para os oócitos sob um escopo dissecar. Os movimentos das vesículas germinais direção e funde com a membrana da célula durante a maturação. Em seguida, ele se rompe e, portanto, não é mais visível em oócitos maduros (Figura 2C). </li></ol> 2. fertilização dos ovócitos maduros <ol><li> Escolheu um pequeno aglomerado de tecido testicular, aproximadamente do tamanho de ervilha, e pique em um pequeno prato de cultura de vidro com aproximadamente 1 ml de SW. </li><li> Usar uma pipeta de Pasteur, para transferir 2-3 gotas da água do mar leitosa resultante para cerca de 100 ml de oócitos maduros e agita-se a placa de cultura para misturar. Evitar a transferência de peças de tecido testicular. Evite adicionar uma maior quantidade de esperma, pois isso pode resultar em poliespermia e desenvolvimento pobre subseqüente. </li><li> Depois de vários minutos, observar os oócitos sob um escopo de dissecação. Os ovos fertilizados, ou zigotos, tem um envelope de fertilização, que é um globo transparente que sobe fora do cell membrana (Figura 2D). NOTA: Não prossiga com a cultura se menos do que cerca de 90% de ovos de fertilizar uma vez que as taxas de fertilização pobres são uma indicação de uma cultura saudável que também pode não se desenvolver bem. </li><li> Após a fertilização é completa, alterar o SW em zigotos por vazamento através de um filtro de malha de 100 um e de lavagem para uma placa de cultura com SW fresco. É importante remover o excesso de esperma para evitar a fome de oxigénio. Colocar a placa de cultura a 15 ° C durante 15-30 min. </li></ol> 3 De-gelatinizante e Remo ovos fertilizados <ol><li> Preparar pratos de injecção, tendo a tampa a partir de um 60 x 15 mm numa caixa de Petri de poliestireno. <ol><li> Desenhar uma linha caneta marcador permanente na parte de trás do prato, em torno da área que coincide com o campo de visão do microscópio microinjecção. Isto assegura que todos os embriões remavam estão dentro do campo de visão do microscópio. </li><li> Use uma pipeta de Pasteur de vidro para marcar uma linha através do círculo, preferably para um lado do círculo (Figura 3B). Use esta linha depois de quebrar as agulhas de injecção (Passo 4.5). NOTA: Os reagentes comumente usados ​​para aderir embriões de ouriço do mar, por exemplo, sulfato de protamina ou poli-L-lisina, são desnecessários. De-gelatinoso P. zigotos miniata ficar muito bem ao plástico não revestido. Note que eles não aderem bem a recipientes de vidro. </li></ol></li><li> Adicionar cerca de 10 ml de SW para cada prato de modo a que a superfície é coberta, mas não a água em excesso vai salpicar no prato como este pode perturbar embriões remadas. </li><li> Remover o P. casaco geléia zigoto miniata com SW ácido antes de remo. Este casaco de geléia é mais extensa do que a observada para as espécies de ouriços-do-mar modelo. <ol><li> Prepare SW ácido na gama de pH 4,0-4,2. O pH é importante para permitir a remoção eficiente de revestimento geleia permitindo ao mesmo tempo o desenvolvimento normal. </li><li> Adicionar gotas individuais de 1 N (1 M) HCl em SW para um estoque de 1 L de SW. Permitir que cada gota para misturar completamentee monitorar o pH antes de adicionar mais HCl. Observação: Uma de alguns mililitros de HCl resulta no pH apropriado, mas não se adicionar a totalidade do volume de uma só vez. NOTA: Prepare 1 N HCl em hotte com SW e (M 12) HCl 12 N. </li><li> Remover SW em zigotos ao derramá-las para um filtro de malha de 100 um. Enxágüe em um copo de 200 ml na menor quantidade possível de SW (aproximadamente 10 ml). Encha o copo até 150 ml com SW ácido (pH 4,0) e permitir que os zigotos para sentar-se no SW ácido por 3 min. </li></ol></li><li> Tira casaco geléia dos zigotos, derramando-lhes frente e para trás entre dois copos de 200 ml, a cada vez que passa os zigotos através de um filtro de malha de 200 m. Despeje os zigotos através do filtro em torno 5-10x durante cerca de uma janela de tempo de 2 min. </li><li> Remover SW ácido vertendo os zigotos para um filtro de malha de 100 um. Lave os zigotos em um pequeno prato de cultura de vidro com SW. Zigotos De-gomas podem ficar com pratos de plástico. Embriões linha imediatamente; eles começam a produzir mais jcasaco Elly que leva a fraca adesão aos pratos de plástico ao longo do tempo. </li><li> Usar uma pipeta (Figura 3C-C &#39;) para pegar zigotos da cultura prato de vidro e coloque-os em linhas retas sobre os pratos de injeção. Derreter o centro do lado fino de uma pipeta de Pasteur, sobre uma chama até que o vidro é mole. Rapidamente puxar as extremidades do vidro para além de produzir um estiramento muito fino do copo. Uma vez que o vidro é legal, quebre a pequena extremidade da pipeta Pasteur (para obter informações adicionais sobre a preparação de uma pipeta de boca ver Wessel et al., 2004 17 ou doce et al., 2004 18). <ol><li> Adicione uma pipeta de remo de tal modo que o diâmetro é apenas maior do que o diâmetro dos embriões de modo a que apenas um único zigoto vai entrar e sair da pipeta de cada vez. Isto vai permitir que uma única fileira de modo a formar. Pipetas de menor diâmetro podem retirar o envelope de fertilização e perturbar os zigotos como P. zigotos miniata não tem uma membrana hialina umand são bastante suaves. </li><li> Se os zigotos não ficar com o prato de plástico, mantê-los por um tempo adicional na SW ácido (até vários minutos). Alternativamente, uma pipeta de menor diâmetro pode ajudar na remoção de revestimento de gelatina para permitir que os zigotos para furar de forma mais eficaz. </li><li> Os zigotos são ligeiramente positivamente flutuante e tendem a flutuar ou passe um pouco acima do fundo do prato. Neste caso, a posição da pipeta de modo a que a remo dos zigotos são suavemente pressionadas contra a superfície do prato de medida que saem da pipeta (Figura 3D). NOTA:. É permitido ajustar muitas linhas sobre esses pratos P. membranas embrionárias miniata não se tornar mais difícil de penetrar ao longo do tempo e, portanto, pode-se injetar centenas de zigotos em um único prato. </li></ol></li></ol> 4 Injeção de zigotos <ol><li> Preparar soluções injectáveis ​​com concentrações adequadas de oligonucleotídeos antisense morf (MASO), mRNA, ou DNAs em uma concentração finalentration de KCl 200 mM. 400-800 uM MASO e 2,5 ng / mL de ADN tendem a produzir fenótipos morphant enquanto minimizando a toxicidade. A concentração final no ovo será 1/125 º a concentração de partida 14. Para soluções de injeção contendo MASOS, o calor a 65 ° C por 5 minutos imediatamente antes da utilização e guarde em temperatura ambiente. <ol><li> Para facilitar a triagem de embriões injectados, adicionar rodamina dextrano traçador à solução de injecção para se obter uma concentração de 0,1%. </li></ol></li><li> Preparar as agulhas de injecção puxando tubo capilar de vidro (1,0 mm de diâmetro externo x 0,75 mm ID, 100 mm de comprimento) de uma agulha que puxa instrumento seguindo as instruções do fabricante. Agulhas adequados para a injeção em ouriços do mar também funcionam bem para as estrelas do mar, portanto, use parâmetros similares 19. </li><li> Carregar cerca de 2 ml de solução de injecção de uma agulha de injecção, utilizando uma ponta de pipeta microloader. </li><li> Inserir a extremidade cega da agulha no manipulator. Definir Picospritzer a 100 mseg de pulso e uma pressão de ar de 40 psi. </li><li> Coloque um prato de embriões remavam no palco de microscópio e têm todos os embriões no campo de visão. Orientar o prato de modo a que a linha marcada está no lado mais próximo da agulha. Posicionar a agulha com um ângulo de aproximadamente 60 ° de modo que a ponta está perto do centro da linha e um pouco acima da superfície da água. </li><li> Concentre-se na linha demarcada e abaixe a agulha até que a ponta entra em foco. Abaixe a ponta um pouco mais e quebrá-lo aberto, executando-o suavemente para dentro dos cumes da linha demarcada. Levante a ponta para fora da superfície do prato e coloque-o no topo da primeira linha de zigotos e focar os zigotos. </li><li> Diminuir a ponta de modo que ela vai espetar o centro do zigoto vindo em torno de um ângulo de 60 °. A agulha penetra facilmente P. zigotos miniata. Passo sobre o pedal (ou outros meios de forçar o material a partir da agulha de injecção) para introduzir um bolus de injecção solução para o embrião. </li><li> Apontar para um bolus, que é de 20-30% do diâmetro do embrião, ou entre 25 e 80 pl. Se o bolo for maior ou menor do que esta, ajustar a duração da injecção no Picospritzer e injectar o embrião seguinte. Continue a ajustar a duração necessária para obter o tamanho desejado bolus. Comece a 100 ms de duração. Re-quebrar a agulha se maior do que cerca de 200 milissegundos é necessário introduzir o bolus apropriado. Descarte a agulha e preparar um novo se menos de 15-20 ms é necessário para obter esse tamanho bolus como o tamanho da agulha é muito grande e pode perturbar o desenvolvimento normal. </li><li> Prossiga para injetar os zigotos restantes no prato de injeção. Os embriões podem ser facilmente injetado até o início da clivagem e em blastômeros individuais após a primeira clivagem. Periodicamente levantar a agulha acima da superfície da água para remover os zigotos que aderem sobre a agulha. Se necessário re-quebrar a ponta da agulha, ou carregar uma nova agulha, se ocorre um bloqueio. </li></ol><ol><li> Permitir que os embriões para desenvolver a 15 ° C no sudoeste. Manter a elevada área superficial para volume das culturas para permitir a troca de oxigénio. Certifique-se de embriões não estão lotados; manter culturas a ou abaixo de 200 embriões / ml. Dependendo do estágio desejado de embrião, pretende coletar embriões injetados em torno de 20-24 horas pós-fertilização. NOTA: Este é frequentemente um momento ideal para classificar e coletar e porque os embriões em desenvolvimento normalmente são facilmente distinguidos morfologicamente, mas ainda não estão nadando. </li><li> Se os embriões têm eclodido, sal delicadamente choque para evitar nadar. Adicionar 200 ul de NaCl 5 M e 10 ml de SW no prato de injecção enquanto agita suavemente a SW. Depois de alguns minutos, os embriões vai cair para o fundo do prato. Colete estes e movê-los para SW salinidade normal. </li><li> Recolhe embriões injectados sob uma fonte de luz fluorescente adequado compatível com o marcador utilizado no injectiem solução. Se não foi utilizado nenhum marcador, classificar embriões para selecionar para a morfologia normal. </li><li> Usando uma pipeta de boca, desenhe fluorescentes embriões com uma quantidade mínima de SW e explodi-los em uma pequena placa de cultura cheio de SW. Pipetas boca Ideal tem uma abertura grande o suficiente para os embriões de ser puxado para dentro e para fora sem danificá-los, mas não tão grande que os embriões indesejados e SW estranhos também são puxados para cima. </li><li> Depois de todos os embriões desejados foram recolhidos para o novo prato, observar os embriões sob luz fluorescente e remover todos os embriões un injetado ou embriões pouco desenvolvidos. </li><li> Cultura classificadas embriões para estágios desejados em uma incubadora e prosseguir com imagens ou outros protocolos desejados. </li></ol>

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Não há conflitos de interesse declarados pelos autores.

Existem dois passos críticos que são difíceis para os usuários novatos desta técnica, mas são essenciais para a criação de embriões com sucesso morphant. A primeira é selecionar ovócitos saudáveis ​​que vencem e fertilizar adequadamente. A percentagem de desenvolvimento normal em cultura depende da época do ano, a saúde do animal, e o número de vezes que os oócitos foram colhidas a partir de um único indivíduo. Oócitos tendem a ser de melhor qualidade a partir de abril a outubro. É importante olh...

A estrela de mar, Patiria miniata, (vulgarmente conhecida como a estrela bat) está emergindo como um sistema modelo interessante e versátil para uma variedade de celular 1 a 3, de desenvolvimento 4,5, evolutiva 6 a 8, e estudos ecológicos 9 a 11. Adulto P. miniata são distribuídos ao longo da costa do Pacífico a partir de Sitka, no Alasca a Baja, Califórnia 12 e são facilmente mantidos em aquários marinhos. Os oócitos são obtidos durante todo o ano e cada fêmea pode lançar dezenas de milhares de ovos. Os oócitos são facilmente maturados e fertilizados externamente 13. Os embriões resultantes são transparentes permitindo a fácil observação; elas se desenvolvem de forma síncrona, e requerem apenas água do mar para o desenvolvimento. Montagem do genoma inteiro e vários transcriptomas também estão disponíveis para P. miniata ( <a href="http://www.echinobase.org/Echinobase/">Echinobase.org</a> ). Essas vantagens tornam ideais para uma série de pesquisase fins de ensino. Nos últimos anos, P. miniata tornou-se um sistema modelo para rede de regulação genética do desenvolvimento analisa 14 a 16. O objetivo desses estudos é identificar todo o elogio de genes regulatórios e determinar a rede de suas interações. Grande parte deste trabalho envolve a expressão do gene perturbadora através da introdução de oligonucleotídeos antisense ou in vitro sintetizado mRNAs. Além disso, análises de regulação em cis são utilizadas para caracterizar a função de DNA regulador 15. Estas análises requerem introdução de reagentes de perturbação e / ou repórter DNA constrói em embriões. Além disso, para caracterizar os efeitos a jusante dessas perturbações, deve-se testar muitos embriões para alterações na expressão de genes de alvos potenciais. Técnicas de microinjeção de muitas centenas de zigotos são fundamentais para este trabalho. Equinodermes, incluindo P. miniata </em&gt;, exigem muitos meses para atingir a maturidade sexual. Devido a isto, não é geralmente prático para desenvolver e manter linhas transgénicas destes animais de experimentação. Portanto, a criação de adultos transgênicos não pode de forma eficiente criar embriões modificados. Em vez disso, perturbação deve ocorrer de novo através de microinjecção. Microinjecção oferece uma oportunidade para modificar os embriões com os reagentes que não são de células-permeável. O protocolo seguinte descreve um método para introduzir ADN, ARNm, marcadores de células, e os oligonucleótidos anti-sentido morfolino em centenas de ovos fertilizados num 2-3 hr sessão através de microinjecção. Isto produz material suficiente para uma variedade de experiências, incluindo a jusante, mas não se limitando a, qPCR, hibridação in situ, o RNA-Seq, e transferência de western.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="648">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
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		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">1-Methyladenine</td>
			<td style="width:147px;">Acros Organics (Fisher Scientific)</td>
			<td style="width:119px;">AC20131-1000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">190 micron nitex nylon filter</td>
			<td style="width:147px;">Small Parts (originally Sefar)</td>
			<td style="width:119px;">CMN-0185-C/5PK-05</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">100 micron nitex nylon filter</td>
			<td style="width:147px;">Small Parts (originally Sefar)</td>
			<td style="width:119px;">CMN-0105-C/5PK-05</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Polystyrene Petri Dishes, 60mm x 15mm</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875713A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Capillary tubing</td>
			<td style="width:147px;">FHC, Inc</td>
			<td style="width:119px;">30-30-0</td>
			<td style="width:167px;">For pulling microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Model P-97 Needle Puller</td>
			<td style="width:147px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">P-97</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:216px;">Dextran, Rhodamine Green</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D7163</td>
			<td style="width:167px;">If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Instant Ocean Sea Salt</td>
			<td style="width:147px;">Doctors Foster and Smith</td>
			<td style="width:119px;">CD-116528</td>
			<td style="width:167px;">Also available in many pet stores</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microloader Tips</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5242 956.003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for microinjection of patiria minata zygotes

Equinodermos têm sido um sistema modelo favorito para estudos de reprodução e desenvolvimento, e, mais recentemente, para o estudo da regulação de genes e evolução dos processos de desenvolvimento. A estrela de mar, Patiria miniata, está ganhando prevalência como um sistema modelo para estes tipos de estudos que foram anteriormente realizadas quase que exclusivamente nos ouriços do mar, Strongylocentrotus purpuratus e Lytechinus variegatus. Uma vantagem destes sistemas modelo é a facilidade de produção de embriões modificados em que um gene particular é para cima ou reprimidos, rotular um grupo de células, ou a introdução de um gene repórter. Um método de microinjecção único é capaz de criar uma grande variedade de tais embriões modificados. Aqui, apresentamos um método para a obtenção de gametas a partir de P. miniata, produzindo zigotos, e introdução de reagentes perturbadores via microinjeção. Embriões morphant saudáveis ​​são posteriormente isolado para estudos quantitativos e qualitativos da gefunção ne. A disponibilidade de dados do genoma e transcriptoma para este organismo aumentou os tipos de estudos que são realizados e da facilidade de executá-los.

O objetivo deste protocolo é a introdução de reagentes em embriões. Demonstramos a eficácia do protocolo através da injeção de uma construção repórter DNA que dirige a expressão da proteína verde fluorescente (GFP). Embriões injectados expressar a GFP em manchas clonais (Figura 4A-B), tal como o ADN incorpora durante a clivagem inicial. Muitos reagentes que são desejáveis ​​para introduzir em embriões são tóxicos em quantidades elevadas e lotes subóptimas de embriões. Manifestos...

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A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Métodos que produzem embriões morphant são essenciais para estudar mecanismos de desenvolvimento e redes de regulação gênicas. A estrela do mar Patiria miniata é um sistema modelo emergente para estes estudos. Aqui apresentamos um protocolo para a obtenção de gametas, produzindo culturas de embriões, e microinjeção rápida de zigotos de esta espécie.

Um Método para microinjeção de<em&gt; Patiria minata</em&gt; zigotos

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

10.9K visualizações.  Carnegie Mellon University.  Métodos que produzem embriões morphant são essenciais para estudar mecanismos de desenvolvimento e redes de regulação gênicas. A estrela do mar Patiria miniata é um sistema modelo emergente para estes estudos. Aqui apresentamos um protocolo para a obtenção de gametas, produzindo culturas de embriões, e microinjeção rápida de zigotos de esta espécie. 

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Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microinjeção de embriões A. aegypti obter mosquitos transgênicos

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Biologia

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Geração de transgênicos Estável C. elegans Usando microinjeção

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Método para a Cultura de Embriões início pintainho ex vivo (Nova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microinjeção de embriões Medaka para uso como um organismo modelo genético

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Análise de Cinética mRNA Nuclear Exportação em células de mamíferos por microinjeção

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

Purificação Citometria de Fluxo com base em<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zigotos

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

We describe here how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells, and provide some useful tips. We expect that this paper will help everyone to evaluate the degree of cellular coupling due to functional gap junctions. Everything described here could be, in principle, adapted to other fluorescent dyes with molecular weight below 1,000 Daltons.

Microinjeção de uma única célula para análise da comunicação celular

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

High Throughput microinjeções de ouriço do mar zigotos

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

In Vivo microinjeção e Eletroporação de testículos de camundongo

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotoxina microinjeção no peixe-zebra ao modelo de lesão renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...