We thank the Italian Neuroblastoma Foundation for the full financial support to this project.

NOTA: A taxa de transferência de tais sistemas de ensaio depende do equipamento de laboratório HTS disponível. Este protocolo é facilitada por um Tecan Freedom EVO 200 robô, que executa o manuseamento de líquidos em formato de 96 poços. A miniaturização para o formato de 384 poços é também possível. O sistema robótico de manuseamento de líquidos está posicionada sob uma câmara de fluxo laminar, a fim de manter as condições assépticas durante todos os passos experimentais. Se não automatização da movimentação de líquido está disponível, o protocolo pode ser facilmente adaptado para o formato de baixa taxa de transferência. Rastreio primário 1. Dia 1: Preparar e celulares das sementes NOTA: Semear as células para se obter 80% de confluência no tempo do ensaio de actividade de luciferase, ou seja, 48 horas após a sementeira. <ol><li> Ressuspender as células de neuroblastoma tratadas com tripsina CHP134-mycn3UTR a uma concentração de 2 x 10 5 células / ml em RPMI contendo 10% de FBS e 1% de L-glutamina. Por 27 placas preparar pelo menos 250 ml de<html> suspensão de células tendo em conta a manipulação de líquidos, bebedouros volumes mortos e passos repetidos pipetagem. Despeje a suspensão de células em reservatório estéril e colocá-lo sobre a mesa do robô. </li><li> Coloque 9 brancas de fundo plano placas de 96 poços com código de barras e uma caixa de 200 ul pontas de pipetas estéreis sobre a mesa do robô. Misture a suspensão de células por pipetagem antes de cada etapa de dispensação para evitar células sedimentação por gravidade. Dispensar 75 uL de células para cada poço de placas de 9 para obter uma densidade final de 1,5 x 10 4 culas por po. </li><li> Cobrir as placas com as tampas e deixá-los fora da incubadora durante 30 minutos para permitir que as células sedimentar para o fundo do poço. Isso irá minimizar os efeitos de borda. </li><li> Repita os passos 1.2 e 1.3, duas vezes, a fim de preparar um número total de 27 placas. </li><li> Colocar as placas a 37 ° C e 5% de CO 2 e incuba-se durante 24 horas. </li></ol> 2. Dia 2: tratar as células com compostos Biblioteca ntent &quot;&gt; NOTA: A biblioteca de moléculas pequenas Colecção Espectro consiste em 2000 compostos dispostos em 8 fileiras e 10 colunas em 25 placas de 96 poços a uma concentração de 10 mM em DMSO As cavidades sobre os primeiros e últimos colunas são deixados vazios para os controlos. ensaios de rastreio. Composto são tipicamente realizadas a uma concentração de composto 1-10 uM 8. O protocolo de rastreio aqui descrito corrige 2 uM como a concentração de trabalho e 24 horas como o ponto final do ensaio. <ol><li> Descongele 9 placas biblioteca de compostos à temperatura ambiente. </li><li> Prepare duas calhas com PBS estéril e soluções de DMSO PBS-0,5% e coloque-os sobre a mesa do robô. Para cada biblioteca de placa, preparar e rotular em conformidade uma placa de diluição - um polipropileno com fundo em U de placas de 96 poços com um volume de trabalho de pelo menos 400 ul. Encher cada poço de colunas 2-11 de placas de diluição de 398 mL de PBS estéril usando dicas fixos da manipulador de líquido. Preencha colunas 1 e 12 anos, com 50 mL de PBS estérilcom DMSO 0,5%, a fim de reproduzir a concentração do veículo nos poços de controlo (0,02%). </li><li> Coloque duas placas de biblioteca, as placas de diluição correspondentemente marcados, duas caixas de 50 l pontas de pipeta estéril e seis células placas sobre a mesa do robô. Descubra placas células. </li><li> Pipetar 2 uL da solução de stock 10 mM de um dos dois pratos de biblioteca na placa de diluição correspondente e misturar bem. Isto irá resultar numa concentração de compostos intermédios 50 uM. Utilizando o mesmo conjunto de pontas, dispensar 3 ul da diluição de 50 uM em 3 placas de 96 poços com células brancas com código de barras. Este esquema de diluição resulta em 2 uM de concentração de cada composto testado de trabalho. NOTA: Para evitar manipulações desnecessárias com as pontas, use um conjunto completo de 96 pontas, desde o início, apesar de as placas de biblioteca contêm apenas 80 compostos. Isto é possível uma vez que a primeira e as últimas colunas das placas da biblioteca estão vazias. </li><li> Substitua as pontas de pipeta e repita StEP 2.4 para a segunda placa de biblioteca. </li><li> Cobrir as placas de células e devolvê-las para a incubadora durante 24 h. </li><li> Repita os passos de 2,3-2,6 mais duas vezes para as placas de biblioteca restantes. </li></ol> 3. Dia 3: Realizar ensaio de luciferase NOTA: Antes de realizar o ensaio de luciferase, é possível multiplexar com um ensaio de viabilidade celular baseado na redução de resazurina, a fim de se obter um índice de viabilidade celular de cada poço 9. Multiplexing luciferase e ensaio de viabilidade ensaios resulta numa redução de sinal da luciferase que, no entanto, pode ser ignorado se as células fornecer um alto nível suficiente de actividade de luciferase. A actividade da luciferase pode ser detectada por uma variedade de reagentes do ensaio de luciferase 10,11 comerciais e caseiros com sinal luminescente estável. <ol><li> Equilibrar o reagente luciferase reconstituído de escolha para a temperatura ambiente. Verifique se o volume é suficiente para todas as placas ensaiadas. Para 27 de placas 170 ml de reagente luciferase serão necessárias, tendo em conta a manipulação de líquidos, bebedouros volume morto e passos repetidos pipetagem. Despeje o reagente luciferase em um reservatório e coloque-o sobre a mesa do robô. </li><li> Remover 9 placas com células da incubadora, coloque-os sobre a mesa robô, descobrir e esperar até atingir a temperatura ambiente. Adicionar 50 ul de reagente de luciferase por cavidade de placa de chapa. Entre as placas, introduzir um atraso igual ao tempo de leitura de luminescência de uma placa. Isto irá assegurar que todas as placas são medidos dentro de intervalo de tempo igual a partir da adição de reagente. </li><li> Após 30 minutos de incubação, colocar a primeira placa na luminometer e medir luminescência após um breve passo tremendo. Repita o procedimento para todas as placas. Grave o código de barras de cada placa e associá-lo ao arquivo de dados correspondente para evitar erros decorrentes de um grande número de placas manipulados. </li><li> Repita os passos de 3,2-3,3 duas vezes para os restantes 18 placas com células. </li&gt; <li> Recolhe-se o reagente de luciferase restante e armazená-lo a -20 ° C. </li></ol> 4. Dia 4: Análise de Dados <ol><li> Processar dados experimentais utilizando normalização de todas as amostras para a média dos controles na placa tratados com o veículo. Para cada composto biblioteca, calcular o valor de x média e SD sobre triplicados. </li><li> Selecione up-regulação e down-regulação sucessos, definindo um limite de X ± k × SD, onde o X valor médio e SD são computadas com todos os valores de ensaio processado, e k é uma constante definida. </li><li> Escolher um limite arbitrário de corte &lt;20% dos controlos tratados com o veículo quando uma redução do sinal da luciferase é mais provavelmente associados com a toxicidade do composto. Descartando os hits abaixo deste limiar irá reduzir significativamente uma série de visitas de falso-positivos no contra-triagem. NOTA: Em vez de normalização à base de controle, dados experimentais podem ser processados ​​aplicando pontuação Z ou o seu B s analógico robustanúcleo 12. Além disso, os métodos estatísticos alternativos para seleção hit estão disponíveis 12. </li></ol> 5. Counter-screening NOTA: Os compostos identificados no rastreio primário (rotulado &quot;hits&quot;) são confirmadas e avaliadas para a especificidade por um contra-rastreio. <ol><li> Cereja escolher os hits selecionados das alíquotas armazenados em tubos com código de barras 2D individuais e criar novo &quot;hit placas&quot;, salvando o layout correspondente. Não se esqueça de deixar posições livres para controles. NOTA: Na ausência de um sistema de cherry-picking eficiente, pode-se testar tanto o controle e 3 &#39;células portadoras UTR em paralelo na triagem primária. Neste caso, a selecção específica de compostos com efeitos dependentes apenas introduzido na UTR 3 &#39;será possível após o rastreio primário eliminando a necessidade de contra-rastreio. No entanto, o rastreio paralelo em duas linhas celulares vai dobrar o ensaiocustos. </li><li> Seguindo o protocolo para o rastreio primário (seção &quot;Dia 1: Preparar e celulares das sementes&quot;), para cada um &quot;hit placa&quot; preparar três placas de 96 poços de cada CHP134-mycn3UTR e CHP134-CTRL células estáveis. </li><li> Seguindo o protocolo para o rastreio primário (seção &quot;Dia 2: tratar as células com Biblioteca compostos&quot;), use cada placa hit para tratar de três CHP134-mycn3UTR e três placas CHP134-CTRL em 2 mM concentração de trabalho. NOTA: Enquanto o contador da tela aqui descrito é realizado em triplicado, com a dose única de 2 uM, pode ser benéfico para substituir as repetições padrão e testar as visitas em 3 concentrações de diluições de 10 vezes variando de 2 uM a 20 nM. A aplicação desta abordagem não só permitiria confirmar os dados do ecrã primário, mas também para obter dados preliminares de resposta à dose sobre as visitas primárias, minimizando taxas de falsos positivos. Neste caso, uma tubagem análise diferente deve ser aplied para processar os dados experimentais e confirmar os hits. </li><li> Seguindo o protocolo para o rastreio primário (seção &quot;Dia 3: Execute Luciferase Assay&quot;), medir a atividade da luciferase em todas as placas-CHP134 mycn3UTR e CHP134-CTRL. </li><li> Seguindo o protocolo para o rastreio primário (seção &quot;Dia 4: Análise de Dados&quot;), normalizar os dados experimentais de poços tratados com a média dos controles na placa tratados com veículo e calcular a média e SD sobre repetições. Para cada composto testado, calcular a alteração vezes a actividade de luciferase em CHP134-mycn3UTR versus células CHP134-CTRL. Selecione mudança vezes arbitrária cut-offs&gt; 1,5 e significância p-valores de &lt;0,01. NOTA: Nas configurações de ensaio descritas o parâmetro determinante para o sucesso especificidade é uma mudança vezes significativa da atividade da luciferase em CHP134-mycn3UTR vs. células CHP134-CTRL. Se necessário, pode-se também avaliar a toxicidade composto realizando simultaneamente um ensaio de viabilidade celular no SEcompostos selecionada. Isso pode ser especialmente benéfico se os hits primários são contra-selecionados em uma análise de resposta à dose. Para uma dose única, a experiência indica uma forte correlação da actividade da luciferase reduzida com a diminuição da viabilidade celular 6. Portanto, diminuição da actividade de luciferase em células-alvo bem como as células de controlo pode ser considerado como um indicador de toxicidade do composto na concentração testada. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

This protocol describes a cell-based reporter-gene assay aiming at the identification of modulators that target 3&#8217; UTR-dependent post-transcriptional processes. It encompasses the primary screening and the counter-screen and, if needed, can be accompanied by a cytotoxicity assay. The outcome of the primary screening is a number of valuable candidate compounds, whose reproducibility and specificity is further validated in the counter-screening.
The identification of primary hits is based ...

Durante um longo período de regulação de transcrição da expressão do gene foi pensada para desempenhar um importante papel, se não exclusiva no controlo da produção de proteína. Um acúmulo de evidências, no entanto, indica que a regulação pós-transcricional contribui tanto quanto, se não mais do que, a regulação da transcrição para determinar a abundância de proteína celular 1,2. Controle pós-transcricional da expressão do gene é muito mais complexo e elaborado do que se pensava anteriormente. Na verdade, todas as diversas fases de controle pós-transcricional surgiram para ser regulamentada, incluindo processamento de mRNA, localização, volume de negócios, a tradução 3, bem como o recém-descrita RNA metilação reversível 4. A partir de um número de processos de regulação pós-transcricional potencialmente afectados, o ensaio descrito a seguir concentra-se sobre aquelas envolvendo &quot;região não traduzida (3 &#39;UTR do mRNA 3). 3 &#39;UTR amplamente afeta destino mRNA, principalmente, via interação específica de ligação RNA-proteins e RNAs não-codificantes para as suas sequências reguladoras e / ou estruturas secundárias 5. Portanto, pequenas moléculas que alteram essas interações ou interferir com a montante vias de transdução de sinal vai mudar o equilíbrio que regula a abundância de proteínas. Esta abordagem terapêutica é de particular importância para patologias humanas em que existem evidências mostrando que os genes relevantes a doença estão sujeitos a regulação pós-transcricional, o qual representa, assim, um alvo potencial para a intervenção farmacológica. Portanto, os sistemas que permitam a triagem de moduladores níveis de mRNA &#39;através da interferência com os mecanismos de controle pós-transcricional em um formato de alto rendimento podem se tornar ferramentas valiosas na identificação de potenciais tratamentos novos. O ensaio do gene repórter baseado em células descrito permite a identificação de compostos capazes de modular destino ARNm através de mecanismos dependentes da sua extremidade 3 &#39;UTR. Consiste em várias diretor componentes (Figura 1) e requer poucos passos preliminares para validar a viabilidade do ensaio. Em primeiro lugar, a construção do repórter é concebido de modo a incluir a UTR 3 &#39;de um gene de interesse. A UTR 3 &#39;é fundido com a extremidade de um gene repórter, tal como luciferase de pirilampo (figura 1). Quaisquer alterações nos mecanismos de controle pós-transcricional exercidas através da inserida UTR 3 &#39;irá alterar a estabilidade e / ou a eficiência da tradução desta transcrição quimérico, resultando em níveis de luciferase variadas. Portanto, mudanças na atividade luciferase servir como medida indireta de regulação pós-transcricional afetada do gene de interesse. O segundo componente do sistema é uma construção repórter de controlo, um plasmídeo de expressão idênticos que expressa o mesmo gene repórter, mas não contém qualquer UTR 3 &#39;. Os dois plasmídeos repórter pode ser concebido no laboratório utilizando protocolos de biologia molecular convencionais ou adquiridos de fontes comerciais. A selecção de uma linha celular apropriada é essencial para a construção de ensaio. Qual linha celular é o modelo ideal depende de inúmeros fatores que vão desde a necessidade clínica, como semelhança máxima de patologia para questões apenas práticos como características disponibilidade, transfectabilidade, e de crescimento. É importante notar que antes de proceder se deve certificar-se de que a fusão da UTR 3 &#39;para o gene repórter tem um efeito esperado sobre o nível de transcrição quimérico. A ausência de diferença significativa no sinal da luciferase a partir do 3 &#39;UTR de suporte e controlo repórter construções transfectadas transientemente em células seleccionadas que indicaria que a UTR 3&#39; não é funcional neste modelo celular, o que levou para a pesquisa de outros alternativos. Para o formato de alto rendimento, os UTR 3 &#39;de suporte de controlo e de luciferase construções repórter deve ser integrado de forma estável na linha de células seleccionada. Usando um integrado de forma estável ao longo transfectadas transitoriamenteA linha celular é preferível por várias razões. Isso vai ampliar a escolha de um modelo de celular, incluindo linhas de células difíceis de transfecção, diminuir a variabilidade dos dados decorrentes de oscilações de eficiência de transfecção, diminuir os custos. Além disso, após a transfecção as células transientes são frequentemente muito sobrecarregada com um plasmídeo de ADN que conduz à saturação do sistema. Nestas configurações de um novo aumento na expressão repórter pode ser um desafio, resultando em diminuição da sensibilidade em relação a compostos upregulating potenciais. Finalmente, quando todos os componentes do ensaio são criados, é fundamental antes de se mudar para o formato de alto rendimento para determinar a viabilidade do ensaio, ou seja, se a atividade luciferase pode ser de fato para cima e para baixo-regulado especificamente através da inserido 3 &#39; UTR. Os melhores controlos seria pequenas moléculas relatados para modular a estabilidade do mRNA ou traductibilidade através da UTR 3 &#39;de interesse. Se tendo estes énão é possível, são aceitos controles substitutos imitando o efeito desejado. Estes poderiam ser miARNs ou proteínas de ligação a ARN conhecidos para exercer os seus efeitos através de ligação a UTR 3 &#39;de interesse. Avaliação de tais controlos antes da despistagem primária não só indica a funcionalidade do ensaio desenvolvido, mas também permite uma estimativa da sua gama dinâmica, sensibilidade e desempenho no formato de alto rendimento. Usando o protocolo descrito nós analisamos uma biblioteca de 2.000 composto 6. Neuroblastoma, o tumor sólido extracraniano mais comum da infância, foi usada como modelo biológico e a 3 &#39;UTR do oncogene MYCN, cuja amplificação prediz fortemente resultado adverso de neuroblastoma, como um gene alvo 7. A Figura 2 descreve o esquema experimental. A triagem foi dividida em três corridas com o tamanho do lote de 27 placas teladas em uma corrida. O lote de 27 placas incluído biblioteca Coleção Spectrumplacas n.1-n.8 + n.25 (primeira corrida), n.9-n.16 + n.25 (segunda corrida) e n.16-n.24 + n.25 (terceira pista), cada placa exibido em triplicado. Assim, uma placa de biblioteca (n.25) foi testada em todas as três corridas possibilitando comparação inter-run. O protocolo a seguir descreve uma única corrida de 9 placas de biblioteca testados em triplicado.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="786">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:239px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Culture plate 96-well White</td>
			<td style="width:239px;">PerkinElmer</td>
			<td align="right" style="width:119px;">6005688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">StorPlate 96-well U bottom (dilution plate)</td>
			<td style="width:239px;">PerkinElmer</td>
			<td align="right" style="width:119px;">6008190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">100 ml disposable trough for reagents</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td>10 613 048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">300 ml disposable robotic reservoir</td>
			<td style="width:239px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">PB12001301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Robot tips DITI 50&#956;L Sterile</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30038607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Robot tips DITI 200&#956;L Sterile</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30038617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right">3711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">ONE-Glo Luciferase Assay System&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E6120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">RPMI</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE12-918F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">PBS-1X, w/o Ca++, Mg++</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">L-Glutamine 200mM</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE17-605E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">FBS</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">DE14-801F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DMSO</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">The Spectrum collection (compound library)</td>
			<td style="width:239px;">MicroSource Discovery Systems</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Tecan Freedom EVO200 robot&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Tecan F200 multiplate reader&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening for chemical modulators of post-transcriptionally regulated genes

Ambos transcrição e regulação pós-transcricional ter um impacto profundo sobre a expressão dos genes. No entanto, comumente adotadas testes de rastreio baseados em células se concentrar em regulação da transcrição, sendo essencialmente por objectivo a identificação de moléculas-alvo do promotor. Como um resultado, os mecanismos de pós-transcrição são em grande parte a descoberto pela expressão de genes de desenvolvimento de drogas específicas. Descrevemos aqui um ensaio de base celular com o objectivo de investigar o papel da &quot;região não traduzida (3 &#39;UTR a 3) na modulação do destino do seu mRNA, e a identificação de compostos capazes de modificar. O ensaio baseia-se no uso de uma construção repórter da luciferase contendo a UTR 3 &#39;de um gene de interesse integrado de forma estável numa linha celular relevante doença. O protocolo é dividido em duas partes, com o foco inicial no rastreio primário destinado à identificação de moléculas que afectam a actividade de luciferase depois de 24 horas de tratamento. A segunda parte do protocolodescreve o contra-rastreio necessário para discriminar compostos que modulam especificamente a actividade da luciferase por meio da UTR 3 &#39;. Em adição ao protocolo detalhado e os resultados representativos, nós fornecemos considerações importantes sobre o desenvolvimento do ensaio e a validação da batida (s) sobre o alvo endógeno. O ensaio do gene repórter baseado em células descrito vai permitir que os cientistas para identificar moléculas que modulam os níveis de proteína através de mecanismos de pós-transcrição dependentes de uma UTR 3 &#39;.

Utilizando a abordagem descrita, que rastreada uma biblioteca de 2.000 composto de potenciais moduladores de mecanismos de controlo pós-transcricional exercida através da 3 &#39;UTR do gene MYCN. A Figura 3 mostra os resultados da despistagem primária exemplificado por uma placa única biblioteca. Sinal da luciferase apresentada como percentagem de controlos tratados com veículo foi obtida por medição da actividade de luciferase em placas em triplicado de células CHP134-mycn3UTR tratados...

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High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Rastreio de alto rendimento para moduladores químicos de Genes Post-transcriptionally Regulamentados

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

high-throughput-screening-for-chemical-modulators-post

Research

JoVE Journal

Biology

9.1K visualizações.  University of Trento. Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3’ UTR.

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High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

Alto rendimento Triagem e Biossensoriais com Fluorescente C. elegans Cepas

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Biologia

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

High Throughput Screening da atividade endoglucanase de fungos em Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

Alto rendimento Assay Sacarificação para materiais lignocelulósicos

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

Um ensaio de rastreio fluorescente para identificação Moduladores de Canais GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

High-throughput screening para pequenas moléculas Moduladores de canais de potássio Interiores retificador

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

De alta capacidade de Triagem funcional usando um caseiro Dual-brilho ensaio de luciferase

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

De alta capacidade de Titulação de luciferase expressando recombinantes Vírus

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Recuperação de Zebrafish Adulto Corações para aplicações de alto rendimento

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identificação de pares Kinase-substrato utilizando High Throughput Screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food applications or in the replacement of petro-based chemicals. We describe an analytical platform to be automated on a liquid handling system that allows the fast and reliable analysis of the type and the amount of EPS produced by microorganisms. It enables the user to identify novel natural microbial exopolysaccharide producers and to analyze the carbohydrate fingerprint of the corresponding polymers within one day in high-throughput (HT). Using this platform, strain collections as well as libraries of strain variants that might be obtained in engineering approaches can be screened. The platform has a modular setup, which allows a separation of the protocol into two major parts. First, there is an automated screening system, which combines different polysaccharide detection modules: a semi-quantitative analysis of viscosity formation via a centrifugation step, an analysis of polymer formation via alcohol precipitation and the determination of the total carbohydrate content via a phenol-sulfuric-acid transformation. Here, it is possible to screen up to 384 strains per run. The second part provides a detailed monosaccharide analysis for all the selected EPS producers identified in the first part by combining two essential modules: the analysis of the complete monomer composition via ultra-high performance liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection (UHPLC-UV-ESI-MS) and the determination of pyruvate as a polymer substituent (presence of pyruvate ketal) via enzymatic oxidation that is coupled to a color formation. All the analytical modules of this screening platform can be combined in different ways and adjusted to individual requirements. Additionally, they can all be handled manually or performed with a liquid handling system. Thereby, the screening platform enables a huge flexibility in order to identify various EPS.

We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.