AB agradece a Fundação Nacional de Ciência para o financiamento no âmbito do programa de Cyber ​​sistemas físicos (1239243) e da Divisão de Educação de Graduação (1245680); e da Agência de Defesa de Projetos de Pesquisa Avançada (DARPA) para apoiar as fases iniciais deste trabalho. As etapas anteriores deste trabalho foi realizado por AB no laboratório do Prof Amit Lal da Universidade de Cornell. AB graças Ayesa Sinha e Prof Lal para orientação experimental e geração de idéias nessa fase. Manduca sexta (Linnaeus 1763) foram obtidos a partir de uma colônia mantida pelo Departamento de Biologia da Universidade de Duke, Durham, NC, EUA. Traças foram utilizadas no prazo de 5 dias da eclosão. Gostaríamos de agradecer Triângulo Biosystems Internacional, especialmente David Juranas e Katy Millay para sua assistência técnica excelente e uso de seu sistema Neuroware. Também gostaria de agradecer a Will Caffey por sua ajuda durante os experimentos.

NOTA: A fonte de os materiais e reagentes necessários para seguir o protocolo é fornecida na Tabela &quot;reagentes&quot; abaixo. 1. Preparar placas de circuito impresso (PCB) para Gravação Eletrodo Conexão NOTA: A fim de fornecer um procedimento experimental prático, eletrodos de fio são soldadas a uma PCB para inserir esses eletrodos em um conector FFC (cabo plano flexível). <ol><li> Corte um 0.5x5 cm 2 pedaço de cobre revestido de laminado. </li><li> Usando um marcador de ponta fina, faça três almofadas 0.1x5cm 2 retângulo como gravura padrões de máscara. </li><li> Etch o laminado exposto usando um etchant PCB dentro de uma área ventilada ou coifa. Cubra cerca de 1 cm de comprimento do corte laminado com fita não reativa. Encha um copo graduado com pelo menos 100 ml de etchant PCB e fita do corte laminado de cobre para o interior do copo graduado com fita adesiva. Metade do cutou laminado de cobret deve ser submerso no produto corrosivo PCB. </li><li> Colocar a proveta numa plataforma rotativa durante 20 min. </li><li> Remover o recorte do etchant e colocá-la num copo cheio de água por 10 min. </li><li> Usando um lenço de papel, aplique álcool isopropílico e remover as marcações para expor as pastilhas de cobre não gravadas. </li><li> Corte a placa de circuito impresso em pequenos quadrados de aproximadamente 1 cm de comprimento. </li><li> Corte dois pedaços de arame revestido, recozido, aço inoxidável (0,11 &quot;revestidos, 0.008&quot; desprotegidas), utilizando uma lâmina afiada para comprimentos de 3 cm cada. Esses pedaços de fio de aço inoxidável são os eletrodos ativos que serão inseridos no tórax do inseto. </li><li> Usando uma lâmina, remover a 4-5 mm do revestimento de plástico de cada uma das extremidades de cada fio. O uso de um microscópio é recomendada. </li><li> Corte um pedaço de 0,7 centímetros de fio de aço inoxidável isolada para criar uma extensão de ponta para o eletrodo de aterramento. Remova cuidadosamente o revestimento com uma lâmina ou derretê-lo com o calor de um ri de soldaem que realizada no passo 1.9. </li><li> Para a ligação à terra, corte um pedaço de flexível (Litz ou indutor) fio a uma distância de 4,5 cm. </li><li> Soldar o pedaço de 0,7 centímetros de aço inoxidável preparada no passo 1.10 ao fio de conexão terra preparada no passo 1.11. Uma ponta de aço inoxidável exposto deve estar na extremidade da ligação à terra. </li><li> Tape o tabuleiro eletrodo preparado com firmeza para o espaço de trabalho de solda usando uma fita não reativa. Use a fita para mascarar tudo, mas 1-2 mm das almofadas na placa onde os eletrodos serão soldados. Esta extremidade livre-solda mascarado das almofadas serão inseridos no conector FFC descrito no passo 4.1. </li><li> Alinhar os três fios de eléctrodos de tal modo que uma extremidade de cada um podem ser soldadas às almofadas correspondentes da placa do eléctrodo. Aplicar fluxo de aço inoxidável através das almofadas de eletrodo para facilitar a soldagem. </li><li> Solda cada um dos eletrodos expostos nas almofadas. </li><li> Mergulhar os eléctrodos em acetona e álcool isopropílico durante 10 mincada um de limpar os resíduos de solda. A utilização de um banho de ultra-sons melhora o desempenho de limpeza. </li></ol> 2. Inserção cirúrgica ao Manduca Sexta pupas NOTA: Os insetos serão mais ativos durante as transições entre dia e noite. Portanto, deve ser estabelecido um ciclo de dia / noite artificial dentro de uma câmara de inseto usando temporizadores automáticos de saída. Estes devem ser definidos para simular um escuro 7 horas e 17 horas ciclo de luz. <ol><li> Examine a sexta pupas Manduca diariamente para determinar um tempo de inserção apropriada. As pupas estão prontos para a inserção de aproximadamente um dia após as asas apresentam manchas escuras. </li><li> Para anestesiar as pupas, coloque-os na geladeira (4C) por cerca de 6 horas. </li><li> Prepare o espaço de trabalho de inserção. O espaço de trabalho deve incluir o álcool isopropílico, pinças afiadas, lâminas, e um G agulha hipodérmica 30. Como opção, o adesivo de cianoacrilato pode ser usado para melhorar a fixação do eléctrodo.</li><li> Esterilizar a agulha, uma pinça, e os eléctrodos mergulhando-as para dentro ou para a limpeza com álcool isopropílico. </li><li> Retire a pupa do frigorífico e transferi-lo para o espaço de trabalho. </li><li> Determinar a localização no tórax que corresponde ao grupo de músculos de interesse. O foco do trabalho neste exemplo são os músculos responsáveis ​​pelo movimento dorsoventral asa movimento ascendente. </li><li> Usando uma lâmina afiada, risque suavemente um 1x1 cm 2 retângulo através da camada exocutical. Usando a pinça, lentamente descascar essas peças. </li><li> (Opcional) Utilizar um vácuo para remover o cabelo asa da região exposta do tórax. </li><li> Insira lentamente a agulha cerca de 5 mm no mesothorax onde as asas anexar ao tórax para criar dois pontos de inserção de segmentação do grupo muscular. </li><li> Com uma pinça, guiar os dois eletrodos de registro para os dois pontos de inserção. </li><li> (Opcional) Para aumentar a durabilidade mecânica, limpar o cabelo em torno dos eletrodose generosamente aplicar adesivo de cianoacrilato em torno de cada ponto de inserção no tórax com um aplicador de arame. </li><li> Prepare uma gaiola para emergência com material adequado (áspero e texturizado) que cobre as paredes eo teto, de modo que o inseto pode subir em cima de emergência. Podem ser usados ​​caixas de papelão perfuradas ou papel de embalagem. </li><li> Prepare uma vara rígida fixação com cerca de 6 cm de comprimento e 2 mm de diâmetro. Agitadores de plástico, um cotonete de algodão ou os fios de metal podem ser utilizados para esta etapa. </li><li> Deslize cuidadosamente esta vara pelo buraco debaixo da tromba protuberante. </li><li> Fix ambos os lados da vara na superfície de tal forma que a gaiola de pupa não pode rolar. Posicionar a pupa dentro da gaiola de tal modo que o mesothorax está virada para cima. Extensa movimento pode causar danos ao eletrodo, perda de hemolinfa, ou tornar a inserção inútil. </li></ol> 3. Inserir o eletrodo terra em Manduca sexta NOTA: O chão (consultecia) eléctrodo devem ser inseridas nas partes distais do abdómen ou do tórax para evitar acoplamento de sinal. Esta inserção pode ser feito tanto durante as fases posteriores do desenvolvimento de pupa ou depois do inseto emerge. A janela para o eletrodo terra tem que estar preparado na fase de pupa para qualquer um de pupa ou fase adulta inserção eletrodo terra. <ol><li> Para inserção fase de pupa: após o descascamento da cutícula mesotorácicas ao redor do eletrodo ativo (veja o passo 2.7), risque outro retângulo através da camada exocutical (cerca de 0.5x0.5 cm 2) no abdômen dorsal perto do tórax usando o G hipodérmica 30 agulha. Insira o eletrodo de aterramento para esta janela usando a técnica descrita na seção 2. </li><li> Para o adulto inserção eletrodo terra etapa: uma vez que o inseto surgiu, coloque-o na geladeira a 4 ° C por 6 a 24 horas para imobilizar. Os restantes passos são os mesmos para ambos pupa e inserções estágio adulto. </li><li> Prepare a inser<html> ção do espaço de trabalho, incluindo o álcool isopropílico, pinças afiadas, um G agulha hipodérmica 30, adesivo de cianoacrilato, um pedaço de arame para aplicação de cola, um cauterizador térmica (opcional), e um pau de cera dental (opcional). </li><li> Localize um ponto de inserção de aproximadamente 1-2 cm de distância dos eletrodos de registro ao longo do abdômen posterior. </li><li> Insira lentamente a agulha para perfurar o abdômen e proporcionar um local de inserção. </li><li> Com uma pinça inserir cuidadosamente o eléctrodo de terra para o local de inserção e aplicar pressão até que seja 3-4 mm de profundidade. Segurar o eléctrodo no lugar e usar um fio para aplicar cola em torno do local de inserção. </li><li> (Opcional) Para aumentar a resistência mecânica, utilize o cauterizador térmica e coletar uma pequena (2-3 mm) gota de cera na ponta. Coloque a ponta perto do local de inserção e aplicar calor de tal forma que a cera circunda o eletrodo e prende-lo firmemente no lugar. </li></ol> 4. Preparação do Conselho Adaptador ONTEÚDO &quot;&gt; NOTA:. Uma placa de adaptador é necessário para conectar a placa de eletrodo para o headstage gravação sem fio através de um conector FFC (cabo liso flexível) Para isso, um conselho semelhante à placa eletrodo precisa ser preparado seguindo os passos de 1,1 a 1,7 . <ol><li> Solde um conector FFC a uma das extremidades do tabuleiro preparado. </li><li> Solda três de 30 AWG (American Wire Gauge) ligar fios a três almofadas na outra extremidade. </li><li> Solda três conectores mini-aos três almofadas na placa adaptador para leituras do osciloscópio, conforme descrito na próxima fase. </li><li> Soldar a outra extremidade destes três fios para o conector headstage. </li><li> Fixe a placa de circuito headstage no topo do quadro de levitação. </li></ol> 5. Prerecording com osciloscópio (Opcional) NOTA: Para avaliar a confiabilidade dos eletrodos e observar a relação sinal-ruído, as gravações do osciloscópio tethered pode ser obtido antes de implantar o wirelsistema de gravação ess. Os conectores mini-fios na placa de adaptador deve ser utilizado para este. <ol><li> Conecte o osciloscópio a um amplificador de gravação neural extracelular. Defina os parâmetros do amplificador para uma frequência de corte passa-alta de 1 Hz, a frequência de corte passa-baixa de 20 kHz, e um ganho de 100. </li><li> Conecte cada um dos conectores de fio mini-femininos na placa adaptador para os canais de entrada do amplificador. </li><li> Retire o inseto com a placa do eletrodo implantado a partir da gaiola quando ele está em um estado ativo (durante o seu tempo de madrugada). Coloque um pedaço de papel de seda sob o inseto para que possa descansar antes de as medidas são tomadas. </li><li> Com uma pinça, deslize a placa de eletrodo para o receptor FFC na placa adaptadora. Observar uma linha de base plana e baixa tensão quando o inseto está em repouso ea geração de eletromiografia (EMG) picos como o inseto bate as asas. NOTA: Consulte a Seção 6: Observar vôo de insetos com o sistema de gravação sem fio para representative resultados osciloscópio. </li><li> Ajuste os parâmetros de exibição do osciloscópio, conforme necessário. Capture os dados sobre o osciloscópio e salvar os dados. </li></ol> 6. Observing Insect avião com o sistema de gravação sem fio NOTA: Uma plataforma de levitação eletromagnética pode ser construído para a gravação sem fio de sinais de EMG durante tethered vôo sexta Manduca. A plataforma de levitação consiste numa estrutura concebida para equilibrar um mecanismo de amarração. A levitação permite que o quadro, e, portanto, o inseto, a guinada durante o teste, sem a restrição de fios de amarração. O quadro pode ser rápida protótipo usando uma modelagem por fusão e deposição (FDM) máquina. Um íman deve ser ligado à parte inferior desta estrutura para ser levitado por uma série de imans na plataforma de base. O insecto está ligado ao conector do FFC suspensa a partir do topo da armação. Esta plataforma levitando está localizado dentro da Arena LED que foi construído usin60 g de painéis compostos por uma matriz de LEDs individuais 5x7. Este sistema foi baseado em métodos estabelecidos para o desenvolvimento de um meio para estimulação visual de moscas da fruta 15, 16, 17. A arena é controlado por um microcontrolador que permite a simulação de ambos os sentidos de rotação anti-horário, assim como o controle da velocidade de rotação. <ol><li> Configure o sistema de gravação sem fio, conectando o headstage ao conector da placa do adaptador na plataforma levitação. </li><li> Retire o inseto da gaiola quando ele está em um estado ativo de preferência durante o seu tempo de madrugada. </li><li> Com uma pinça, insira cuidadosamente a placa de eletrodo para o receptor FFC na moldura levitando de tal forma que o inseto está suspenso firmemente dentro do setup. </li><li> Coloque a varinha magnética perto da chave magnética no headstage para ativar a transmissão de dados sem fio. Uma luz azul acende, indicando que o headstage está ativo. </li><li> Desligue as luzes doespaço para a completa escuridão. Uma luz vermelha pode ser usado para adicionar a iluminação para a sala. Abra o software de coleta de dados de telemetria em um computador e selecione o arquivo de configuração pré-carregado apropriada, se fornecido. Iniciar a aquisição de dados para iniciar a visualização de sinais. </li><li> Selecione a interface de usuário relevante para a observação de sinais de EMG no sistema de gravação sem fio para garantir a operação de conexão e eletrodo sem fio confiável. </li><li> Ligue todos os componentes LED Arena: fonte de alimentação regulada e microcontroladores DC. O microcontrolador pode ajustar as rotações por minuto do padrão de luz cíclico e pode também controlar a direcção da rotação da luz. </li><li> Lentamente equilibrar a plataforma levitação dentro da arena. Alinhar a moldura acima do centro da base de levitação com cuidado, de outra forma a estrutura irá ser puxado rapidamente para o solo, possivelmente ferindo o insecto. </li><li> Iniciar o sistema de gravação de vídeo. </li><li> Selecione a guia de gravação relevante do softwareinterface. Designar o tempo de gravação e arquivo de save destino. Escolha as configurações de saída apropriadas para salvar os dados. Clique no botão Iniciar para iniciar uma sessão de gravação dentro do software. Isto irá salvar o arquivo de dados que pode ser importado para ambientes de computação numérica. </li><li> Observe que o insecto voa na direcção que corresponde ao movimento dos LEDs. Inverter o sentido dos LEDs e confirmar que o inseto inverte a direção. Realize esta como quantas vezes desejar. </li></ol>

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Authors have no conflict of interest in this study.

Há vários passos críticos durante a inserção cirúrgica dos eletrodos de registro que afetam a capacidade de gravar dados nas etapas posteriores do protocolo. Os eletrodos de registro deve ser inserido na pupa um dia depois de expor pontos de asa para o lado dorsal. Se a inserção é feita de dois ou mais dias, após esse tempo, o tecido do insecto não terá tempo suficiente para se desenvolver em torno e estabilizar os eléctrodos inseridos. Isto poderia levar ao movimento dos eléctrodos implantados e gravaçõ...

Inserção de eletrodos, mesmo com sistemas eletrônicos ligados aos insetos para aplicações de gravação de telemetria, tem sido um importante método para compreender como os sistemas neurais função durante o vôo naturais 1. Colocar ou implantar sistemas artificiais em insetos tem colocado muitos desafios que envolvem o potencial de perturbar o vôo natural do inseto. Apego superficial ou inserção cirúrgica de plataformas artificiais sobre o inseto adulto não é confiável devido à possibilidade de deslocamento dos dispositivos inseridos causados ​​pela inércia e de estresse induzido por forças do corpo. Superficialmente anexado ou eletrodos inseridos cirurgicamente também são propensos a ser rejeitado pelos insetos como um corpo estranho. Além disso, a operação de implantação requer a remoção de escamas e pilhas em todo o exoesqueleto. A camada de cutícula espessa também precisa ser penetrado por inervações cirúrgicos que podem causar danos nos tecidos garantia, interferindo assim com o vôo natural do inseto. Todos os tstas fatores podem fazer uma operação de implante cirúrgico ou superficial uma tarefa desafiadora e delicado. A fim de aliviar estas preocupações envolvidas na fixação externamente sistemas de comando e sensores para os insetos, uma nova metodologia que envolve o crescimento metamórfico serão descritos neste artigo. O desenvolvimento de insectos metamórfica holometabolic começa com a transformação da larva (ou ninfa) para um adulto com uma fase de pupa intermédia (Figura 1). O processo envolve um grande metamorfose reprogramação tecido incluindo degeneração seguido de remodelação. Esta transformação vira uma larva terrestre para um adulto inseto demonstrando vários comportamentos complexos 2,3. A sobrevivência dos insetos após cirurgias parabiótico extremas tem sido demonstrado que as cirurgias foram realizadas durante os primeiros estágios metamórficos 4,5. Nestas cirurgias, as caus histogênese de desenvolvimentoferidas cirúrgicas ed para ser reparado em períodos mais curtos. Seguindo essas observações, uma nova técnica foi desenvolvida, onde a implantação de eletrodos eletricamente condutivo foi realizada durante os primeiros estágios de crescimento metamórfico (Figura 1). Isso permite que um anexo biomecanicamente seguro sobre o inseto 6. Uma interface altamente confiável também é presa com neural do inseto e os sistemas neuromusculares 7. Esta técnica é conhecida como &quot;Early Metamorphosis Inclusão Tecnologia&quot; (EMIT) 8. Após a reconstrução do sistema de tecido inteiro, estruturas inseridas na pupa emergir com o inseto adulto. Grupos musculares aéreas perfazer a 65% da massa total do corpo torácica e, portanto, é um alvo relativamente conveniente para o procedimento de EMIT 9. Durante a batida de asa básica, as mudanças na morfologia do vôo ligando dorsolongitudinal (dl) e dorsoventral (dv) músculos com que a asa articulatgeometria íon para gerar sustentação 10. Por isso, a coordenação funcional dos músculos dl e dv tem sido um tema de pesquisa ativa em neurofisiologia vôo. Insetos amarrados em ambientes visuais programados eletronicamente tem sido o método mais comum para estudar a neurofisiologia de comportamentos locomotores complexos 11,12. Arenas cilíndricos compostos de emissores de luz de diodo painéis têm sido usados ​​por esses ambientes de realidade virtual, onde os insetos voadores são amarrados no meio eo movimento é simulado, atualizando dinamicamente a exibição visual panorâmica envolvente. No caso dos insectos menores, tais como mosca da fruta Drosophila, amarrar é conseguido ligando um pino de metal para o tórax dorsal do insecto e colocar o pino sob um íman permanente 13,14. Este método só permite a quantificação das respostas motoras através de observações visuais com câmeras de alta velocidade, sem qualquer análise eletrofisiológica. Além disso, este metod tem sido ineficiente para suspender o corpo maior e mais pesado de Manduca sexta. Para resolver este problema, beneficiaram de quadros magneticamente levitando onde peso leve armações com ímãs ligados à sua parte inferior são levitado por meio de forças eletromagnéticas. Quando combinado com amplificadores neurais disponíveis comercialmente e matrizes de LED, este fornece uma plataforma para controlar a saída de vôo-motor e registrar a eletrofisiologia relacionado de Manduca sexta.

<table><tbody><tr><td>Coated stainless steel wire</td><td>A-M Systems</td><td>791900</td><td>0.008&amp;rsquo;&amp;rsquo; bare, 0.011&amp;rsquo;&amp;rsquo; coated, annealed</td></tr><tr><td>Flexible electrode wire</td><td></td><td></td><td>Litz or inductor wire can be used.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Surface-mount FFC connector</td><td>Hirose Connector</td><td>FH28E-20S-0.5SH(05)</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>Grobet USA</td><td></td><td>Clean with 70% alcohol before use on the insect.</td></tr><tr><td>Kim-Wipes</td><td>Kimberly-Clark Worldwide</td><td>34155</td><td>Any size delicate-wipe tissues can be used.</td></tr><tr><td>Teflon tape</td><td></td><td></td><td>5 mm width Teflon tape.</td></tr><tr><td>Hypodermic Needle</td><td>Becton Dickinson &amp;amp; Co.</td><td>30511</td><td>20-30 G hypodermic needle can be used. Video showed 30 G.</td></tr><tr><td>Rigid fixation stick</td><td></td><td></td><td>Variety of materials can be used (&lt;em&gt;e.g&lt;/em&gt;., coffee stirrers)</td></tr><tr><td>Insect emergence cage</td><td></td><td></td><td>Plastic pet cage lined with packing paper or similar padding. Ventilation holes are needed.</td></tr><tr><td>Thermal cauterizer</td><td>Advanced Meditech International</td><td>CH-HI CT2103 (tip)</td><td>Optional equipment used for application of dental wax.</td></tr><tr><td>Dental wax</td><td>Orthomechanics LC., Broken Arrow, Oklahoma</td><td></td><td>Optional material used for stabilizing the electrodes on the insect.</td></tr><tr><td>Magnetic levitation platform</td><td></td><td></td><td>Custom designed frame fabricated in-house with 3D prototyping.</td></tr></tbody></table>

early metamorphic insertion technology for insect flight behavior monitoring

Early Metamorphosis Insertion Technology (EMIT) is a novel methodology for integrating microfabricated neuromuscular recording and actuation platforms on insects during their metamorphic development. Here, the implants are fused within the structure and function of the neuromuscular system as a result of metamorphic tissue remaking. The implants emerge with the insect where the development of tissue around the electronics during pupal development results in a bioelectrically and biomechanically enhanced tissue interface. This relatively more reliable and stable interface would be beneficial for many researchers exploring the neural basis of the insect locomotion with alleviated traumatic effects caused during adult stage insertions. In this article, we implant our electrodes into the indirect flight muscles of Manduca sexta. Located in the dorsal-thorax, these main flight powering dorsoventral and dorsolongitudinal muscles actuate the wings and supply the mechanical power for up and down strokes. Relative contraction of these two muscle groups has been under investigation to explore how the yaw maneuver is neurophysiologically coordinated. To characterize the flight dynamics, insects are often tethered with wires and their flight is recorded with digital cameras. We also developed a novel way to tether Manduca sexta on a magnetically levitating frame where the insect is connected to a commercially available wireless neural amplifier. This set up can be used to limit the degree of freedom to yawing &#8220;only&#8221; while transmitting the related electromyography signals from dorsoventral and dorsolongitudinal muscle groups.

Um diagrama esquemático do processo global EMIT é apresentado na Figura 1, mostrando as principais etapas no ciclo metamórfica do hawkmoth e os passos de inserção do eléctrodo correspondentes. A inserção do eléctrodo deve ser realizada na fase de pupa tardia 4 a 7 dias antes da eclosão. Isto permite que as fibras musculares para desenvolver em torno dos eléctrodos e fixar o implante no insecto. O resultado típico de uma fase de pupa tardia inserção concluído q...

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Early Metamorphic Insertion Technology for Insect Flight Behavior Monitoring

We present a novel surgical procedure to implant electrodes in Manduca sexta during its early metamorphic stages. This technique allows mechanically stable and electrically reliable coupling with the neuromuscular tissue to study flight neurophysiology dynamics. We also present a novel magnetic levitation platform for tethered studies of insect yaw.

Cedo metamórfica de Inclusão Tecnologia para o Comportamento de Monitoramento de insetos de vôo

Early Metamorphosis Insertion Technology (EMIT) is a novel methodology for integrating microfabricated neuromuscular recording and actuation platforms on ...

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Research

JoVE Journal

Behavior

14.5K visualizações.  North Carolina State University. We present a novel surgical procedure to implant electrodes in Manduca sexta during its early metamorphic stages. This technique allows mechanically stable and electrically reliable coupling with the neuromuscular tissue to study flight neurophysiology dynamics. We also present a novel magnetic levitation platform for tethered studies of insect yaw.

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Studying the Neural Basis of Adaptive Locomotor Behavior in Insects

Studying the neural basis of walking behavior, one often faces the problem that it is hard to separate the neuronally produced stepping output from those leg movements that result from passive forces and interactions with other legs through the common contact with the substrate. If we want to understand, which part of a given movement is produced by nervous system motor output, kinematic analysis of stepping movements, therefore, needs to be complemented with electrophysiological recordings of motor activity. The recording of neuronal or muscular activity in a behaving animal is often limited by the electrophysiological equipment which can constrain the animal in its ability to move with as many degrees of freedom as possible. This can either be avoided by using implantable electrodes and then having the animal move on a long tether (i.e. Clarac et al., 1987; Duch &amp; Pfl&uuml;ger, 1995; B&ouml;hm et al., 1997; Gruhn &amp; Rathmayer, 2002) or by transmitting the data using telemetric devices (Kutsch et al, 1993; Fischer et al., 1996; Tsuchida et al. 2004; Hama et al., 2007; Wang et al., 2008). Both of these elegant methods, which are successfully used in larger arthropods, often prove difficult to apply in smaller walking insects which either easily get entangled in the long tether or are hindered by the weight of the telemetric device and its batteries. In addition, in all these cases, it is still impossible to distinguish between the purely neuronal basis of locomotion and the effects exerted by mechanical coupling between the walking legs through the substrate. One solution for this problem is to conduct the experiments in a tethered animal that is free to walk in place and that is locally suspended, for example over a slippery surface, which effectively removes most ground contact mechanics. This has been used to study escape responses (Camhi and Nolen, 1981; Camhi and Levy, 1988), turning (Tryba and Ritzman, 2000a,b; Gruhn et al., 2009a), backward walking (Graham and Epstein, 1985) or changes in velocity (Gruhn et al., 2009b) and it allows the experimenter easily to combine intra- and extracellular physiology with kinematic analyses (Gruhn et al., 2006).
We use a slippery surface setup to investigate the timing of leg muscles in the behaving stick insect with respect to touch-down and lift-off under different behavioral paradigms such as straight forward and curved walking in intact and reduced preparations.

We describe a method to record motor activity, timed to the electrically recorded tarsal contact signal in a tethered insect, walking on a slippery surface. This is used to study the neural basis of adaptive behavior under reduced influence of mechanical interaction between legs through the substrate.

Estudando a base neural do Comportamento Locomotor Adaptive em Insetos

Studying the neural basis of walking behavior, one often faces the problem that it is hard to separate the neuronally produced stepping output from those ...

Neurociência

Measuring the Flight Ability of the Ambrosia Beetle, Platypus Quercivorus (Murayama), Using a Low-Cost, Small, and Easily Constructed Flight Mill

The ambrosia beetle, Platypus quercivorus (Murayama), is the vector of a fungal pathogen that causes mass mortality of Fagaceae trees (Japanese oak wilt). Therefore, knowing the dispersal capacity may help inform trapping/tree removal efforts to prevent this disease more effectively. In this study, we measured the flight velocity and duration and estimated the flight distance of the beetle using a newly developed flight mill. The flight mill is low cost, small, and constructed using commonly available items. Both the flight mill arm and its vertical axis comprise a thin needle. A beetle specimen is glued to one tip of the arm using instant glue. The other tip is thick due to being covered with plastic, thus it facilitates the detection of rotations of the arm. The revolution of the arm is detected by a photo sensor mounted on an infrared LED, and is indicated by a change in the output voltage when the arm passed above the LED. The photo sensor is connected to a personal computer and the output voltage data are stored at a sampling rate of 1 kHz. By conducting experiments using this flight mill, we found that P. quercivorus can fly at least 27 km. Because our flight mill comprises cheap and small ordinary items, many flight mills can be prepared and used simultaneously in a small laboratory space. This enables experimenters to obtain a sufficient amount of data within a short period.

Measuring the Flight Ability of the Ambrosia Beetle, Platypus Quercivorus Murayama, Using a Low-Cost, Small, and Easily Constructed Flight Mill

We developed a low cost and small flight mill, constructed with commonly available items and easily used in experimentation. Using this apparatus, we measured the flight ability of an ambrosia beetle, Platypus quercivorus.

Medir a capacidade de voo do besouro Ambrosia, ornitorrinco Quercivorus (Murayama), usando um baixo custo, pequeno e voo facilmente construído moinho

The ambrosia beetle, Platypus quercivorus (Murayama), is the vector of a fungal pathogen that causes mass mortality of Fagaceae trees (Japanese oak wilt). ...

Ambiente

A Wind Tunnel for Odor Mediated Insect Behavioural Assays

Olfaction is the most important sensory mechanism by which many insects interact with their environment and a wind tunnel is an excellent tool to study insect chemical ecology. Insects can locate point sources in a three-dimensional environment through the sensory interaction and sophisticated behavior. The quantification of this behavior is a key element in the development of new tools for pest control and decision support. A wind tunnel with a suitable flight section with laminar air flow, visual cues for in-flight feedback and a variety of options for the application of odors can be used to measure complex behaviour which subsequently may allow the identification of attractive or repellent odors, insect flight characteristics, visual-odor interactions and interactions between attractants and odors lingering as background odors in the environment. A wind tunnel holds the advantage of studying the odor mediated behavioural repertoire of an insect in a laboratory setting. Behavioural measures in a controlled setting provide the link between the insect physiology and field application. A wind tunnel must be a flexible tool and should easily support the changes to setup and hardware to fit different research questions. The major disadvantage to the wind tunnel setup described here, is the clean odor background which necessitates special attention when developing a synthetic volatile blend for field application.

Here, we describe the construction and use of a wind tunnel for odor mediated behavioural assays with insects. The wind tunnel design facilitates the release of odor sources by several methods, with and without visual stimuli. Wind tunnel experiments are important methods to identify behaviorally active volatile chemicals.

Um túnel de vento para Odor mediada insetos ensaios comportamentais

Olfaction is the most important sensory mechanism by which many insects interact with their environment and a wind tunnel is an excellent tool to study ...

Comportamento

Flying Insect Detection and Classification with Inexpensive Sensors

An inexpensive, noninvasive system that could accurately classify flying insects would have important implications for entomological research, and allow for the development of many useful applications in vector and pest control for both medical and agricultural entomology. Given this, the last sixty years have seen many research efforts devoted to this task. To date, however, none of this research has had a lasting impact. In this work, we show that pseudo-acoustic optical sensors can produce superior data; that additional features, both intrinsic and extrinsic to the insect&#8217;s flight behavior, can be exploited to improve insect classification; that a Bayesian classification approach allows to efficiently learn classification models that are very robust to over-fitting, and a general classification framework allows to easily incorporate arbitrary number of features. We demonstrate the findings with large-scale experiments that dwarf all previous works combined, as measured by the number of insects and the number of species considered.

We proposed a system that uses inexpensive, noninvasive pseudo-acoustic optical sensors to automatically and accurately detect, count, and classify flying insects based on their flying sound.

Vôo Detecção e Classificação Insect com sensores baratos

An inexpensive, noninvasive system that could accurately classify flying insects would have important implications for entomological research, and allow ...

Bioengenharia

Using Flight Mills to Measure Flight Propensity and Performance of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera (LeConte)

The western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera (LeConte) (Coleoptera: Chrysomelidae), is an economically important pest of corn in the northern United States. Some populations have developed resistance to management strategies including transgenic corn that produces insecticidal toxins derived from the bacterium Bacillus thuringiensis (Bt). Knowledge of western corn rootworm dispersal is of critical importance for models of resistance evolution, spread, and mitigation. Flight behavior of an insect, especially over a long distance, is inherently difficult to observe and characterize. Flight mills provide a means to directly test developmental and physiological impacts and consequences of flight in the laboratory that cannot be obtained in field studies. In this study, flight mills were used to measure the timing of flight activity, total number of flights, and the distance, duration, and speed of flights taken by female rootworms during a 22-h test period. Sixteen flight mills were housed in an environmental chamber with programmable lighting, temperature, and humidity control. The flight mill described is of a typical design, where a flight arm is free to rotate about a central pivot. Rotation is caused by flight of an insect tethered to one end of the flight arm, and each rotation is recorded by a sensor with a time-stamp. Raw data are compiled by software, which are subsequently processed to provide summary statistics for flight parameters of interest. The most difficult task for any flight mill study is attachment of the tether to the insect with an adhesive, and the method used must be tailored to each species. The attachment must be strong enough to hold the insect in a rigid orientation and to prevent detachment during movement, while not interfering with natural wing motion during flight. The attachment process requires dexterity, finesse, and speed, making video footage of the process for rootworms of value.

Using Flight Mills to Measure Flight Propensity and Performance of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera LeConte

Flight mills are important tools for comparing how age, sex, mating status, temperature, or various other factors may influence an insect&#8217;s flight behavior. Here we describe protocols to tether and measure the flight propensity and performance of western corn rootworm under different treatments.

Usando flight mills para medir a propensão de vôo e desempenho do west corn rootworm, diabrotica virgifera virgifera (LeConte)

The western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera (LeConte) (Coleoptera: Chrysomelidae), is an economically important pest of corn in the northern ...

Building an Enhanced Flight Mill for the Study of Tethered Insect Flight

Makerspaces have a high potential of enabling researchers to develop new techniques and to work with novel species in ecological research. This protocol demonstrates how to take advantage of the technology found in makerspaces in order to build a more versatile flight mill for a relatively low cost. Given that this study extracted its&#160;prototype from flight mills built in the last decade, this protocol focuses more on outlining divergences made from the simple, modern flight mill. Previous studies have already shown how advantageous flight mills are to measuring flight parameters such as speed, distance, or periodicity. Such mills have allowed researchers to associate these parameters with morphological, physiological, or genetic factors. In addition to these advantages, this study discusses the benefits of using the technology in makerspaces, like 3D printers and laser cutters, in order to build a more flexible, sturdy, and collapsible flight mill design. Most notably, the 3D printed components of this design allow the user to test insects of various sizes by making the heights of the mill arm and infrared (IR) sensors adjustable. The 3D prints also enable the user to easily disassemble the machine for quick storage or transportation to the field. Moreover, this study makes greater use of magnets and magnetic paint to tether insects with minimal stress. Lastly, this protocol details a versatile analysis of flight data through computer scripts that efficiently separate and analyze differentiable flight trials within a single recording. Although more labor-intensive, applying the tools available in makerspaces and on online 3D modeling programs facilitates multidisciplinary and process-orientated practices and helps researchers avoid costly, premade products with narrowly adjustable dimensions. By taking advantage of the flexibility and reproducibility of technology in makerspaces, this protocol promotes creative flight mill design and inspires open science.

This protocol uses three-dimensional (3D) printers and laser cutters found in makerspaces in order to create a more flexible flight mill design. By using this technology, researchers can reduce costs, enhance design flexibility, and generate reproducible work when constructing their flight mills for tethered insect flight studies.

Construindo uma usina de voo aprimorada para o estudo do voo de insetos amarrados

Makerspaces have a high potential of enabling researchers to develop new techniques and to work with novel species in ecological research. This protocol ...

Engenharia

Electroantennography-based Bio-hybrid Odor-detecting Drone using Silkmoth Antennae for Odor Source Localization

Small drones with chemical or biosensor devices that can detect airborne odorant molecules have attracted considerable attention owing to their applicability in environmental and security monitoring and search-and-rescue operations. Small drones with commercial metal-oxide-semiconductor (MOX) gas sensors have been developed for odor source localization; however, their real-time-odor-detection performance has proven inadequate. However, biosensing technologies based on insect olfactory systems exhibit relatively high sensitivity, selectivity, and real-time response with respect to odorant molecules compared to commercial MOX gas sensors. In such devices, excised insect antennae function as portable odorant biosensor elements and have been found to deliver excellent sensing performance. This study presents experimental protocols for odorant-molecule detection in the air using a small autonomous bio-hybrid drone based on a mountable electroantennography (EAG) device incorporating silkmoth antennae.
We developed a mountable EAG device including sensing/processing parts with a Wi-Fi module. The device was equipped with a simple sensor enclosure to enhance the sensor directivity. Thus, odor source localization was conducted using the spiral-surge algorithm, which does not assume an upwind direction. The experimental bio-hybrid odor-detecting drone identified real-time odorant-concentration differences in a pseudo-open environment (outside a wind tunnel) and localized the source. The developed drone and associated system can serve as an efficient odorant molecule-detection tool and a suitable flight platform for developing odor source localization algorithms owing to its high programmability.

This study introduces experimental protocols for a bio-hybrid odor-detecting drone based on silkmoth antennae. The operation of an experimental electroantennogram device with silkmoth antennae is presented, in addition to the structure of a bio-hybrid drone designed for odor source localization using the spiral-surge algorithm.

Drone bio-híbrido de detecção de odor baseado em eletroantennografia usando antenas de seda para localização de fonte de odor

Small drones with chemical or biosensor devices that can detect airborne odorant molecules have attracted considerable attention owing to their ...

A Simple Flight Mill for the Study of Tethered Flight in Insects

Flight in insects can be long-range migratory flights, intermediate-range dispersal flights, or short-range host-seeking flights. Previous studies have shown that flight mills are valuable tools for the experimental study of insect flight behavior, allowing researchers to examine how factors such as age, host plants, or population source can influence an insects' propensity to disperse. Flight mills allow researchers to measure components of flight such as speed and distance flown. Lack of detailed information about how to build such a device can make their construction appear to be prohibitively complex. We present a simple and relatively inexpensive flight mill for the study of tethered flight in insects. Experimental insects can be tethered with non-toxic adhesives and revolve around an axis by means of a very low friction magnetic bearing. The mill is designed for the study of flight in controlled conditions as it can be used inside an incubator or environmental chamber. The strongest points are the very simple electronic circuitry, the design that allows sixteen insects to fly simultaneously allowing the collection and analysis of a large number of samples in a short time and the potential to use the device in a very limited workspace. This design is extremely flexible, and we have adjusted the mill to accommodate different species of insects of various sizes.

Flight in insects is influenced by a number of factors and the propensity to disperse is an important variable in understanding insect ecology and biological control strategies. We describe the construction and use of a simple, relatively inexpensive, and flexible flight mill for measuring parameters of tethered flight in insects.

Um simples vôo Mill para o Estudo da Amarrados no vôo Insetos

Flight in insects can be long-range migratory flights, intermediate-range dispersal flights, or short-range host-seeking flights. Previous studies have ...

Insect-machine Hybrid System: Remote Radio Control of a Freely Flying Beetle (Mercynorrhina torquata)

The rise of radio-enabled digital electronic devices has prompted the use of small wireless neuromuscular recorders and stimulators for studying in-flight insect behavior. This technology enables the development of an insect-machine hybrid system using a living insect platform described in this protocol. Moreover, this protocol presents the system configuration and free flight experimental procedures for evaluating the function of the flight muscles in an untethered insect. For demonstration, we targeted the third axillary sclerite (3Ax) muscle to control and achieve left or right turning of a flying beetle. A thin silver wire electrode was implanted on the 3Ax muscle on each side of the beetle. These were connected to the outputs of a wireless backpack (i.e., a neuromuscular electrical stimulator) mounted on the pronotum of the beetle. The muscle was stimulated in free flight by alternating the stimulation side (left or right) or varying the stimulation frequency. The beetle turned to the ipsilateral side when the muscle was stimulated and exhibited a graded response to an increasing frequency. The implantation process and volume calibration of the 3 dimensional motion capture camera system need to be carried out with care to avoid damaging the muscle and losing track of the marker, respectively. This method is highly beneficial to study insect flight, as it helps to reveal the functions of the flight muscle of interest in free flight.

Insect-machine Hybrid System: Remote Radio Control of a Freely Flying Beetle Mercynorrhina torquata

This protocol describes the process of constructing an insect-machine hybrid system and carrying out wireless electrical stimulation of the flight muscles required to control the turning motion of a flying insect.

Insect-máquina Sistema Híbrido: Controle de rádio remoto de um Beetle Livremente Aeronáutica (<em&gt; Torquata Mercynorrhina</em&gt;)

The rise of radio-enabled digital electronic devices has prompted the use of small wireless neuromuscular recorders and stimulators for studying in-flight ...

Insect-controlled Robot: A Mobile Robot Platform to Evaluate the Odor-tracking Capability of an Insect

Robotic odor source localization has been a challenging area and one to which biological knowledge has been expected to contribute, as finding odor sources is an essential task for organism survival. Insects are well-studied organisms with regard to odor tracking, and their behavioral strategies have been applied to mobile robots for evaluation. This "bottom-up" approach is a fundamental way to develop biomimetic robots; however, the biological analyses and the modeling of behavioral mechanisms are still ongoing. Therefore, it is still unknown how such a biological system actually works as the controller of a robotic platform. To answer this question, we have developed an insect-controlled robot in which a male adult silkmoth (Bombyx mori) drives a robot car in response to odor stimuli; this can be regarded as a prototype of a future insect-mimetic robot. In the cockpit of the robot, a tethered silkmoth walked on an air-supported ball and an optical sensor measured the ball rotations. These rotations were translated into the movement of the two-wheeled robot. The advantage of this "hybrid" approach is that experimenters can manipulate any parameter of the robot, which enables the evaluation of the odor-tracking capability of insects and provides useful suggestions for robotic odor-tracking. Furthermore, these manipulations are non-invasive ways to alter the sensory-motor relationship of a pilot insect and will be a useful technique for understanding adaptive behaviors.

The capability to localize an odor source is necessary for insect survival and is expected to be applicable to artificial odor-tracking. The insect-controlled robot is driven by an actual silkmoth and enables us to evaluate the odor-tracking capability of insects through a robotic platform.

Robô controlado por insetos: uma plataforma móvel Robot avaliar a capacidade Odor-tracking de um inseto

Robotic odor source localization has been a challenging area and one to which biological knowledge has been expected to contribute, as finding odor ...