Agradecemos a Michael Dübbert, Oliver Hoffmann, Hans Scharstein, Jan Sydow e Anne Wosnitza de assistência técnica excelente. Este estudo foi apoiado pelo DFG conceder Bu 857 / 8,10 a AB

1. A superfície de caminhada A superfície de caminhada preto é composto de duas placas de latão revestido de níquel permanentemente unidos, lado a lado e eletricamente isolados entre si por uma tira de dois milímetros de largura de 2 componentes cola epóxi (UHU plus, UHU GmbH, Alemanha), diretamente abaixo do eixo longitudinal do o animal. Eles produzem uma superfície total de 13.5x15.5cm (Figura 1). A separação dos planos metade para as pernas esquerda e direita permite a monitoração de contato tarsal independente para uma única perna em cada lado. <ol><li> A placa é lubrificada com uma mistura de glicerina / água na proporção de 95 partes de glicerina a 5 partes saturada de NaCl solução para transmitir escorregadio e condutividade elétrica; a viscosidade é de aproximadamente 430cStokes (Shankar e Kumar, 1994). </li><li> A mistura é aplicada diretamente sobre a superfície e se dispersa com um pedaço de tecido mole para assegurar uma espessura total de 0,1 0,2 milímetros. </li></ol> 2. Setup Estimulação óptica <ol><li> Episódios andar são extraídas usando dois projetores, como descrito por Scharstein (1989) para projetar um padrão listrado em dois redondos, telas de vidro moído (diâmetro 130mm, telas Marata, Linos Photonics, Göttingen, Alemanha), que estão posicionados a uma distância de aprox. 70 milímetros dos olhos, e em um ângulo de 45 ° na parte frontal esquerda e à direita do prato (Fig.1). O comprimento de onda do padrão listrado é mantida constante em λ = 21 °. A freqüência de contraste de estímulos em movimento pode ser variado entre 0,35, 0,72, 1,07 e 1.49Hz. Desde a reação dos animais depende apenas da freqüência ω contraste / λ (ω = velocidade angular, λ = comprimento de onda padrão) se o contraste padrão é alto o suficiente (Fermi e Reichhardt, 1963), não variam ao longo do λ experimentos . A luminosidade da faixas brilhantes do lado do animal é de aproximadamente 15cd/m2 eo contraste 0,8. O olho composto do inseto stick (Carausius morosus) tem 24 omatídeos no eixo dorso-ventral (Friza, 1928) e um pouco mais no eixo rostro-caudal. Como o ângulo de divergência do olho de inseto vara é, em média, 6,2 ° (Jander e Volk-Henrichs, 1970) comprimento de onda padrão de nossa era de aproximadamente 4 vezes o ângulo do omatídeos. Os experimentos são criados em uma gaiola de Faraday escurecida e realizadas em uma sala escura de 20-22 ° C. </li><li> Andar para a frente é induzida por um padrão progressivo em ambas as telas, onde as listras na tela de cada movimento para fora, ou um único feixe preto sobre fundo branco colocado entre as telas </li><li> Turning é induzida por listras que se deslocam na mesma direção em ambas as telas. Não encontramos uma correlação entre a velocidade do movimento e listras o ângulo da curva. Uma vez luminância do padrão listrado está definido para induzir a pé, que geralmente não requer ajuste adicional, mas pode ser ajustado para diferentes animais de acordo com a necessidade pela tensão das lâmpadas halógenas nos projetores. </li></ol> 3. Preparando o animal Experimental <ol><li> Insetos adultos do sexo feminino stick (Carausius morosus) são coladas (cimento dental, ProTempII, a 3M ESPE, Seefeld, Alemanha), lado ventral para baixo em um pedaço de pau balsa fina (3x5x100mm, WxHxL), que é inserido em um tubo de bronze que tem vários conectores. O animal é mantido pressionado por aproximadamente um minuto até que a cola é pelo menos parcialmente endurecido. </li><li> A cabeça e as pernas se projetam a partir da frente e do lado do pino para permitir a sua livre circulação. A área da coxas de todas as pernas, bem como a maior parte do abdômen tem que ser deixado livre de cola. </li><li> Cabeça de inseto, tórax e nas extremidades distais de cada fêmur e tíbia são marcadas com pigmentos fluorescentes (Dr. Kremer Farbmühle, Aichstetten, Alemanha) misturado com cimento dental para rastreamento de vídeo mais tarde. </li></ol> 4. Colocação de eletrodos EMG Atividade muscular dos músculos das pernas diferentes, tais como, neste exemplo, o transferidor e músculos coxas retrator, que estão localizados no tórax e protração causa (movimento para frente) e retração (movimento para trás) da perna, é registrado por meio de eletrodos EMG implantado no tórax. Todas as gravações são diferencialmente EMG amplificado. O sinal foi amplificado 100x em um pré-amplificador (eletrônica workshop, Zoological Institute, Colónia), band-pass filtrada, (100Hz-2000Hz), ainda mais ampliada (10x), e importado por meio de um conversor AD em Spike2 (Vers.5.05, CED, Cambridge, UK). <ol><li> Os eletrodos são feitos de fios de cobre revestido (Elektrisola, Eckernhagen, Alemanha; diâmetro externo 47μm). Para um eletrodo, dois fios são os primeiros untada com cola, então, os dois fios são trançados pegajosas em torno de si </li><li> Em uma extremidade do fio torcido extremidades são soldadas a uma mini-ficha. Na outra ponta os fios são cortados para fornecer termina limpa sem isolamento para a inserção no animal. </li><li> Os eletrodos EMG são Plugged no conector pequeno na extremidade do tubo de latão. </li><li> Um pino Minuten é usada para fazer furos pequenos na cutícula </li><li> As extremidades do corte do eletrodo são então separadas e inserido em um músculo em cerca de 1 milímetro de distância um do outro, que, em nossa experiência, dá um bom sinal-ruído. Cuidados devem ser tomados para não inserir os eletrodos muito profundo no músculo para evitar o seu dano. A Figura 2 mostra a localização dos eletrodos no tórax do animal. A Figura 3 mostra um animal com os fios de eletrodos no lugar. </li><li> Usamos uma pequena gota de cola histoacrylic (3M Vetbond, St.Paul, Minnesota, EUA) para manter os fios no lugar. </li><li> Um fio terra é inserida no abdômen. </li></ol> 5. Gravação do contato do tarso Contato do tarso é sempre gravado juntamente com traços EMG. Desde a superfície escorregadia é dividido em duas metades, um máximo de dois contralateral contatos tarsal pode ser registrado, ao mesmo tempo. Para este fim, a perna é usado como um &quot;interruptor&quot; para fechar um circuito entre a placa eo amplificador. Atual pode ser aplicado para as placas separadamente através de dois soquetes na base de cada prato. Podemos gerar dois sinais de onda quadrada com 2-4MV amplitudes com um gerador de pulsos (modelo MS501, eletrônica workshop, Zoological Institute, Colônia), que são de fase atrasada de 90 °. Os sinais são atenuados pela 60dB (/ 1000) e aplicado a as duas metades da superfície escorregadia. Neste experimento utilizamos apenas um dos dois sinais. É, simultaneamente, alimentados em uma fechadura-em-amplificador como um sinal de referência. O lock-in-amplificador de 2 fases (eletrônica workshop, Zoological Institute, Colónia) seletivamente apenas amplifica os sinais da mesma freqüência e fase do sinal de referência fornecidos. Um segundo canal só detecta o sinal de fase de 90 ° atrasada. Sinais de ruído de frequências de frequência de referência são rejeitadas e não afetam a medição. O sinal de saída do amplificador é alimentado em um conversor AD (Micro 1401k II, CED, Cambridge, UK) e Spike2 usando digitalizadas. Entre touch-down e levante-off do tarso para e da superfície escorregadia, a corrente flui através da placa de tarso e tíbia para o fio de cobre (ver abaixo: 5,3-5,8). O amplificador escolhido tem uma resistência de entrada elevada (1MΩ) eo sinal de tensão é muito pequena, a fim de evitar afetar o comportamento pé do animal. A passagem de corrente através tarso e tíbia é entre 2 e 4NA. O tempo de espera do sinal durante a touch-down, entre a entrada em que o lubrificante ea superfície de contato é menor que 1 ms. A transição do sinal de contato durante a decolagem é menos íngreme e mais atrasado. Isto é devido à ruptura atrasada do lubrificante do tarso por um efeito de ascensão capilar e devido ao movimento da perna, sem completar a decolagem em fase de balanço. <ol><li> O tubo de bronze com o pau de balsa para o qual o animal é colado é inserido em um micromanipulador para permitir o ajuste da altura do animal, entre 7 e 12 milímetros acima da superfície escorregadia, o que corresponde à altura durante a caminhada livre. </li><li> Para medir o fluxo de corrente sempre que o tarso inseto da perna é monitorado no chão, um fio (47μm de diâmetro) é cortado em cerca de 15cm longos pedaços. </li><li> O isolamento de um cobre é removido por queima-lo com álcool. </li><li> Um ciclo é formado com uma extremidade do fio e deslizou ao longo do tarso do animal </li><li> O laço é amarrado na extremidade distal da tíbia para proporcionar um bom contato entre o animal eo fio. </li><li> O fio é então fixado no tórax do animal com uma gota de cola de dois componentes (ProTempII, veja acima), e ligado ao amplificador diferencial através de uma pinça jacaré. </li><li> Para melhorar a condutividade do fio em suas extremidades, uma gota de creme é aplicado eletrodo (Marquette Hellige, Freiburg, Alemanha) nas áreas de contato. </li><li> A intensidade do sinal é então testada no monitor. Devido às propriedades filtro passa-baixa do lock-in-amplificador (10ms de tempo constante) eo lift-off/touch-down gradual do tarso, o sinal não é um sinal exata quadrados. Um, portanto, tem que definir limites adequados perto do ponto de transição para determinar o momento exato de contato tarsal e verificar manualmente cada evento determinado pelo software de digitalização. Com base no contato tarsal, que definiu o momento em que o tarso de uma perna dado estava no chão como posição e momento em que estava no ar como a fase de balanço. </li><li> O sinal de disparo para a câmera é gravada simultaneamente com o traçado EMG eo sinal de contato tarsal, e permite um quadro preciso por correlação de quadros de comportamento e traços gravados. </li></ol> 6. A gravação óptica de movimentos de pernas para Análise Digital A freqüência de aprofundamento da pau insetos em superfícies escorregadias pode chegar a 3-4Hz (Graham e Cruse, 1981). <ol><li>Antes de gravar sequências de caminhar, um espelho é colocado em um ângulo de 45 ° para trás o animal para ter um monitor adicional visual para touch-down. A câmera é acionada externamente e imagens são alimentados em um PC através de uma interface FireWire. </li><li> Gravamos andando seqüências de cima com uma câmera de vídeo de alta velocidade (Marlin F-033C, a Allied Vision Technologies, Stadtroda, Alemanha) em 100fps para analisar os movimentos das pernas digitalmente, e correlacioná-los com a atividade EMG e entre em contato tarsal. </li><li> Durante a gravação de sequências de caminhar, o animal é iluminado com LED azul matrizes (30-50V DC, 24cd luminância, Eletrônica Workshop, Instituto Zoológico da Universidade de Colônia), que são ajustadas em intensidade para iluminar os marcadores fluorescentes. Segundo a literatura (Schlegtendal, 1934), bichos-pau não possuem visão de cores e não observamos um efeito adverso da iluminação de luz UV sobre a resposta de viragem. Um filtro amarelo na frente da lente da câmera suprime o comprimento de onda curta da luz de ativação e dá um maior contraste para as gravações de vídeo. </li><li> Os arquivos de vídeo podem ser analisados ​​usando o software de rastreamento de movimento (WINanalyze, Vers.1.9, Mikromak serviço, Berlim, Alemanha). </li></ol> 7. Gravação de seqüências Walking <ol><li> Como controle, primeiro de uma seqüência andar com um animal intacto é gravado. </li><li> A velocidade do padrão listrado está definido e padrão ea gravação de vídeo são iniciados aproximadamente ao mesmo tempo. </li><li> Se o animal não começar a locomoção espontânea, ele pode ser estimulado no abdômen com um pincel (Bassler e Wegener, 1983), ou por um sopro de ar para as antenas. Neste caso, os animais tocou no lado esquerdo do abdômen tendem a virar à esquerda e vice-versa. O padrão listrado é mantida em movimento até que o animal pára de andar ou até depois de 3 minutos de gravações contínuas. </li><li> A fim de testar até que ponto a atividade muscular em uma perna é dependente de estímulos sensoriais das pernas vizinhos, o animal é induzido a autotomize suas pernas. O site de autotomia fecha naturalmente dentro de segundos. Um exemplo de um animal com frente autotomized e patas traseiras é mostrado na Figura 3. </li><li> Por exemplo, para experimentos com animais com apenas uma perna do meio, que induzem autotomia das pernas pró e metathoracic apertando o fêmur proximal com um par de fórceps (Schmidt e Grund, 2003) ou cortar as pernas ao nível dos coxas após a gravação do animal intacto. Depois que um mínimo de 30min para o tempo de recuperação é dado ao animal. </li><li> Então novo recorde seqüências andar como antes. Em preparações reduzida, muitas vezes precisamos induzir andar usando pinceladas de tinta. </li></ol> 8. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 configuração Experimental; A:. Fotografia de um inseto de vara amarrada acima da superfície escorregadia, marcado com pigmentos fluorescentes para rastreamento perna e com fio para EMG de gravação e de medição de contato tarsal. B: Esquema de ligação dupla de gravação de contato tarsal da perna durante a caminhada sobre a superfície escorregadia. <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Posições para a colocação de eletrodos EMG nos músculos transferidor e retrator no tórax da perna meio pau de insetos. ML: perna média; FL: frente perna <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig3.jpg" alt="Figura 3" /> . Figura 3 Vara de insetos com fios de EMG nos músculos pró e afastador da perna meio no lugar, pernas da frente e traseiros foram retirados para estudar o efeito da presença de pernas vizinhos na cinemática e atividade muscular das pernas no meio a preparação reduzida. <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Traço Exemplo de afastador atividade EMG com sinal de referência de contato tarsal em uma perna dentro do meio durante a manobra. No início do trace (caixa azul em primeiro lugar) o retrator é ativo durante a postura, enquanto a perna tem contato com o solo (&quot;circuito fechado&quot;), indicando que a perna faz frente passos, depois de um interruptor de curto (caixa azul segundo), a retrator é ativo durante o balanço, enquanto que a perna está no ar (&quot;circuito aberto&quot;, caixa azul terceiros), mostrando a ocorrência de passos para trás dirigido. <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Captura de tela de uma gravação do transferidor (traço em cima) e retrator (traço médio) músculos e traços de contato gravados simultaneamente tarsal (traço inferior). Observe a atividade alternando nos traços EMG que corresponde à atividade dos dois músculos no ciclo de passo, que é a atividade transferidor imediatamente antes e duranteswing, quando o contato tarsal rastrear sinais de perda de contato com o solo e atividade retrator após e durante o touch-down do tarso, quando a perna está na postura. A inserção mostra o arquivo de vídeo correspondente correspondente a esta gravação que é usado para verificar o comportamento do animal.

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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Joint+coordination+during+walking+and+foothold+searching+in+the+Blaberus+cockroach+I.+Kinematics+and+electromyograms.">Multi-Joint coordination during walking and foothold searching in the Blaberus cockroach I. Kinematics and electromyograms.</a> J Neurophysiol. 83, 3323-3336 .</li><li>Tryba, A. K., Ritzmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Joint+coordination+during+walking+and+foothold+searching+in+the+Blaberus+cockroach.+II.+Extensor+motor+neuron+pattern.">Multi-Joint coordination during walking and foothold searching in the Blaberus cockroach. II. Extensor motor neuron pattern.</a> J Neurophysiol. 83, 3337-3350 .</li><li>Tsuchida, Y., Hama, N., Takahata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+telemetry+system+for+underwater+recording+of+electromyogram+and+neuronal+activity+from+non-tethered+crayfish.">An optical telemetry system for underwater recording of electromyogram and neuronal activity from non-tethered crayfish.</a> J Neurosci Methods. 137, 103-109 (2004).</li><li>Wang, H., Ando, N., Kanzaki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+control+of+free+flight+maneuvers+in+a+hawkmoth,+Agrius+convolvuli.">Active control of free flight maneuvers in a hawkmoth, Agrius convolvuli.</a> J Exp Biol. 211, 423-432 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós descrevemos uma configuração que permite a geração opticamente induzida de transformar o comportamento e permite um elevado grau de desacoplamento do neuronalmente gerada atividade pé do passivo efeitos causados ​​pelo deslocamento mecânico dos membros outras andando sobre o chão. Fluxo de informações de potencial entre as pernas através do sistema nervoso sobre as forças de reação do solo ou entre em contato tarsal, por outro lado, ainda é possível e permite que o pesquisador a estudar a influência de tais informações na elaboração reduzida. As principais vantagens da configuração incluem superfície escorregadia que os animais mostram uma tendência muito alta para caminhar, e ao contrário do pé ou pisar em uma treadwheel, o animal pode realizar balanço e movimentos fase de apoio em todas as direções de caminhada natural. Além disso, os graus de liberdade para todas as pernas que os animais possam realizar curva andando se é uma preparação intactas ou semi-intactas. Porque as pernas não podem ser passivamente movida simplesmente pelo movimento para a frente do animal ou do movimento do substrato por baixo, cada movimento reflete a saída do motor do que a perna (Cruse, 1976; Graham e Wendler, 1981). A configuração é muito adequado para investigar a base neuronal de comportamentos adaptativos, tais como o giro para trás ou para frente vs andando, porque pode-se combinar gravações eletrofisiológicas da atividade motora com a análise da cinemática movimentos dos membros. Usamos resposta optomotor o inseto bastão para provocar a pé. As respostas dos animais para o padrão de distribuição rotativa mostrar a sua disponibilidade para executar curva de caminhar enquanto amarrados sobre a superfície escorregadia. Mais surpreendente para nós, pernas único single-perna preparações qualitativamente mostram o mesmo padrão se movendo como no animal intacto. Temos, assim, razão para acreditar que o controle de andar curva pode funcionar em grande parte sem coordenação estímulos sensoriais das pernas vizinhos. Será importante para testar novas experiências em se a atividade dos neurônios motores das pernas removidas também é influenciada pelo padrão optomotor. A configuração pode ser facilmente modificado para permitir o estudo de outras tarefas, como para a frente e para trás, colocando a pé uma única faixa na frente do animal ou puxando as antenas. A medição precisa do contato com o solo nos permite correlacionar a atividade muscular e posição das pernas. A alta resolução temporal deste sinal de contato elétrico é melhor do que 1ms e nos leva a uma nova visão sobre o momento da mudança de balançar a fase de apoio. A resolução é pior para a postura para balançar transição devido ao atraso no corte do lubrificante condução e uma falta de necessidade de uma completa lift-off durante a protração na superfície escorregadia. No entanto, o conhecimento sobre o balanço preciso fazer a transição postura é uma etapa particularmente útil primeiro, se quisermos compreender os mecanismos que o tempo de controle muscular e as atividades coordenadas dos músculos da perna em diferentes contextos comportamentais (veja também: Büschges et al, 2008;. Büschges &amp; Gruhn 2008). Como exemplo, usamos o músculo retrator e coxas transferidor da perna do meio e precisamente relacionada a sua actividade com a mudança de balançar a fase de apoio, enquanto que, simultaneamente, monitorou o contexto comportamental em que a perna foi utilizado. Para este propósito, que induziu a pé e registrou a atividade muscular continuamente. Uma perna dado pode ser um interior ou um perna de fora, dependendo do sentido de rotação. Na perna pisando meio, atuando como uma perna dentro, no sentido funcional, pode-se observar que os músculos afastador e transferidor tanto pode funcionar como músculos postura funcional, pois a perna para trás de forma intermitente produz passos, além de um passo à frente dirigido (ver Fig.4 ). A eletromiografia (EMG) de ambos os músculos foram retificados e normalizados para o momento do toque para baixo e da latência dos picos primeiro músculo foi calculada. Curiosamente, as latências de ambos os músculos em relação ao lift-off e touch-down dependem da função do músculo como balanço respectivos ou postura músculo (ver Fig.4) e não no próprio músculo, e mostrar apenas pequenas alterações na calendário de início de atividade. A maioria das explicações para a mudança de estado de balançar a postura assume que os sinais sensoriais de gatilho de contato tarsal o início da postura. A questão interessante de como as latências curtas entre pousar e ativação muscular no bicho-pau são trazidas e em que a informação sensorial que eles dependem agora podem ser tratadas com a configuração modificada. Em resumo, nós mostramos uma configuração de superfície escorregadia que nos permite obter de forma confiável andando em linha reta e curva em bichos-pau parado. Cinemática, atividade muscular eo tempo de tarso touch-down e decolagem podem ser monitorados e correlacionados nos dois diferentes c comportamentaisontexts ao mesmo tempo. Isso nos dá uma excelente ferramenta para estudar a ligação detalhada entre atividade muscular e contexto comportamental para uma única perna, bem como no animal intacto e os mecanismos subjacentes.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>2-component epoxy glue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>UHU plus, UHU GmbH, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>glass screens (diameter 130mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Marata screens, Linos Photonics, G&#246;ttingen, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dental cement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ProTemp II, 3M ESPE, Seefeld, Germany</td>
<td>3M Id : 70-2011-0358-0 Catalog Number : 46430</td>
<td>Available through 3M (<a href="http://www.3m.com/">http://www.3m.com/</a>)or dental suppliers</td>
</tr>
<tr>
<td>fluorescent pigments </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dr. Kremer Farbm&#252;hle, Aichstetten, Germany</td>
<td>Cat.#s: i.e 56200 Fluorescent Pigment Golden Yellow 56350 Fluorescent Pigment Flame Red</td>
<td><a href="http://kremer-pigmente.de/en">http://kremer-pigmente.de/en</a> or <a href="http://www.kremerpigments.com/
">http://www.kremerpigments.com/</a>
</td>
</tr>
<tr>
<td>histoacrylic glue </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>3M Vetbond, St.Paul, MN, USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>supplier: WPI</td>
</tr>
<tr>
<td>coated copper wire</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Elektrisola Eckernhagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.elektrisola.com/">http://www.elektrisola.com/</a></td>
</tr>
<tr>
<td>electrode cream </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Marquette Hellige, Freiburg, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Product is now discontinued, we suggest for example: <a href="www.grasstechnologies.com">www.grasstechnologies.com</a></td>
</tr>
<tr>
<td>pulse generator </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Model MS501, electronics workshop, Zoological Institute, Cologne, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>lock-in-amplifier </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>electronics workshop, Zoological Institute, Cologne, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>AD converter </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Micro 1401k II, CED, Cambridge, UK</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>preamplifier </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>electronics workshop, Zoological Institute, Cologne, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>high speed video camera </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Marlin F-033C, Allied Vision Technologies, Stadtroda, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UV LED arrays </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>30-50V DC, electronics workshop, Zoological Institute, Cologne, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&lambda;390-395nm 
Luminance 24cd</td>
</tr>
<tr>
<td>Digitalizing software Spike2 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vers.5.05, CED, Cambridge, UK</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>motion tracking software </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>(WINanalyze, Vers.1.9, Mikromak service, Berlin, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

studying the neural basis of adaptive locomotor behavior in insects

Estudando a base neural de andar comportamento, muitas vezes um enfrenta o problema que é difícil separar a saída neuronalmente produzido pisar daqueles movimentos de pernas, que resultam das forças passiva e interações com outras pernas por meio do contato com o substrato comum. Se queremos entender, que parte de um dado movimento é produzido pela saída do sistema nervoso motor, análise cinemática dos movimentos de pisar, portanto, precisa ser complementado com gravações eletrofisiológicas da atividade motora. O registro da atividade neuronal ou muscular em um animal se comportando é muitas vezes limitada pelo equipamento eletrofisiológicas que podem restringir o animal em sua capacidade de mover-se com graus de liberdade como muitos como possível. Isto pode ser evitado pelo uso de eletrodos implantáveis ​​e depois ter o movimento de animais em uma corda longa (ie Clarac et al, 1987;. Duch &amp; Pflüger, 1995; Böhm et al, 1997;. Gruhn &amp; Rathmayer, 2002) ou por transmissão os dados usando dispositivos de telemetria (Kutsch et al, 1993; Fischer et al, 1996;. Tsuchida et al 2004;. Hama et al, 2007;.. Wang et al, 2008). Ambos os métodos elegantes, que são utilizados com sucesso em artrópodes maiores, muitas vezes, difícil de aplicar em insetos menores andando que nem facilmente se enredar na corda longa ou são prejudicadas pelo peso do dispositivo de telemetria e suas baterias. Além disso, em todos estes casos, ainda é impossível distinguir entre a base puramente neuronal de locomoção e os efeitos exercidos por acoplamento mecânico entre as pernas andando através do substrato. Uma solução para este problema é a realização de experimentos em um animal amarrado, que é livre para andar no local e que é localmente suspensos, por exemplo, sobre uma superfície escorregadia, o que efetivamente remove mecânica contato mais chão. Isso tem sido usado para estudar as respostas de fuga (camhi e Nolen, 1981; camhi e Levy, 1988), transformando (Tryba e Ritzman, 2000a, b;. Gruhn et al, 2009a), para trás a pé (Graham e Epstein, 1985) ou mudanças na velocidade (Gruhn et al., 2009b) e permite que o experimentador facilmente combinar intra e extracelulares fisiologia com análises cinemáticas (Gruhn et al., 2006). Nós usamos uma configuração de superfície escorregadia para investigar o tempo de músculos da perna no bicho-pau se comportando em relação ao touch-down e levante-off em diferentes paradigmas comportamentais, tais como andar para a frente e curvas em preparações intactas e reduzida.

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Studying the Neural Basis of Adaptive Locomotor Behavior in Insects

Nós descrevemos um método de registro da atividade motora, programado para o sinal de contato tarsal eletricamente gravado em um inseto amarrado, andando sobre uma superfície escorregadia. Isto é usado para estudar as bases neurais do comportamento adaptativo sob a influência reduzida de interação mecânica entre as pernas através do substrato.

Estudando a base neural do Comportamento Locomotor Adaptive em Insetos

Studying the neural basis of walking behavior, one often faces the problem that it is hard to separate the neuronally produced stepping output from those ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.7K visualizações.  University of Cologne. Nós descrevemos um método de registro da atividade motora, programado para o sinal de contato tarsal eletricamente gravado em um inseto amarrado, andando sobre uma superfície escorregadia. Isto é usado para estudar as bases neurais do comportamento adaptativo sob a influência reduzida de interação mecânica entre as pernas através do substrato.

Vídeo: Studying the Neural Basis of Adaptive Locomotor Behavior in Insects

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Único Recordings Sensillum na Insetos Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Neurociência

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus throughout life. Previous reports have shown that adult hippocampal neurogenesis is associated with diverse brain disorders, including epilepsy, schizophrenia, depression and anxiety (1). Deciphering the process of normal and aberrant adult-born neuron integration may shed light on the etiology of these diseases and inform the development of new therapies.
SGZ adult neurogenesis mirrors embryonic and post-natal neuronal development, including stages of fate specification, migration, synaptic integration, and maturation. However, full integration occurs over a prolonged, 6-week period. Initial synaptic input to adult-born SGZ dentate granule cells (DGCs) is GABAergic, followed by glutamatergic input at 14 days (2). The specific factors which regulate circuit formation of adult-born neurons in the dentate gyrus are currently unknown.
Our laboratory uses a replication-deficient retroviral vector based on the Moloney murine leukemia virus to deliver fluorescent proteins and hypothesized regulatory genes to these proliferating cells. This viral technique provides high specificity and resolution for analysis of cell birth date, lineage, morphology, and synaptogenesis.
A typical experiment often employs two or three viruses containing unique label, transgene, and promoter elements for single-cell analysis of a desired developmental process in vivo. The following protocol describes a method for analyzing functional newborn neuron integration using a single green (GFP) or red (dTomato) fluorescent protein retrovirus and patch-clamp electrophysiology.

A way to study the integration of newborn dentate granule cells in adult animals is described. This technique uses an engineered retrovirus to label newborn neurons, followed by electrophysiological recordings to determine in vivo functional integration.

Estudar a Integração da Adult-nascido Neurônios

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

De alta resolução de imagem ao vivo de comportamento de células no desenvolvimento neuroepitélio

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Co-analysis of Brain Structure and Function using fMRI and Diffusion-weighted Imaging

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when studying the brain, as the functional role that a brain area fulfills may be largely defined by its connections to other brain areas. In this report, we describe a novel, non-invasive approach for relating brain structure and function using magnetic resonance imaging (MRI). This approach, a combination of structural imaging of long-range fiber connections and functional imaging data, is illustrated in two distinct cognitive domains, visual attention and face perception. Structural imaging is performed with diffusion-weighted imaging (DWI) and fiber tractography, which track the diffusion of water molecules along white-matter fiber tracts in the brain (Figure 1). By visualizing these fiber tracts, we are able to investigate the long-range connective architecture of the brain. The results compare favorably with one of the most widely-used techniques in DWI, diffusion tensor imaging (DTI). DTI is unable to resolve complex configurations of fiber tracts, limiting its utility for constructing detailed, anatomically-informed models of brain function. In contrast, our analyses reproduce known neuroanatomy with precision and accuracy. This advantage is partly due to data acquisition procedures: while many DTI protocols measure diffusion in a small number of directions (e.g., 6 or 12), we employ a diffusion spectrum imaging (DSI)1, 2 protocol which assesses diffusion in 257 directions and at a range of magnetic gradient strengths. Moreover, DSI data allow us to use more sophisticated methods for reconstructing acquired data. In two experiments (visual attention and face perception), tractography reveals that co-active areas of the human brain are anatomically connected, supporting extant hypotheses that they form functional networks. DWI allows us to create a "circuit diagram" and reproduce it on an individual-subject basis, for the purpose of monitoring task-relevant brain activity in networks of interest.

We describe a novel approach for simultaneous analysis of brain function and structure using magnetic resonance imaging (MRI). We assess brain structure with high-resolution diffusion-weighted imaging and white-matter fiber tractography. Unlike standard structural MRI, these techniques allow us to directly relate anatomical connectivity to functional properties of brain networks.

Co-análise de estrutura e função cerebral usando ressonância magnética funcional e imagem ponderada em difusão

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

Vivo em dois fótons de imagem de experiência dependentes de alterações moleculares em neurônios corticais

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

Determinação da atividade locomotora espontânea em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy and cheap methods to distinguish between individuals in a trial. A standard technique for this is CO2 anaesthesia and then labelling or wing clipping each fly. However, this is invasive and has been shown to affect behavior. Other techniques have used coloration to identify flies. This article presents a simple and non-invasive method for labelling Drosophila that allows them to be individually identified within experiments, using food coloring. This method is used in trials where two males compete to mate with a female. Dyeing allowed quick and easy identification. There was, however, some difference in the strength of the coloration across the three species tested. Data is presented showing the dye has a lower impact on mating behavior than CO2 in Drosophila melanogaster. The impact of CO2 anaesthesia is shown to depend on the species of Drosophila, with D. pseudoobscura and D. subobscura showing no impact, whereas D. melanogaster males had reduced mating success. The dye method presented is applicable to a wide range of experimental designs.

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.

Tingimento Insetos para Comportamentais Ensaios: o comportamento de acasalamento dos anestesiado<em&gt; Drosophila</em

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

Aumento Time-dependente na resposta da rede à estimulação de culturas de pilha neuronais em matrizes do micro-elétrodo

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other neurological diseases at an increasing speed. However, little is known about the molecular mechanisms that underlie these disorders. The genetic, molecular, and behavioral toolbox of Drosophila melanogaster makes this model organism particularly useful to characterize new disease genes and mechanisms in a high-throughput manner. Nevertheless, high-throughput screens require efficient and reliable assays that, ideally, are cost-effective and allow for the automatized quantification of traits relevant to these disorders. The island assay is a cost-effective and easily set-up method to evaluate Drosophila locomotor behavior. In this assay, flies are thrown onto a platform from a fixed height. This induces an innate motor response that enables the flies to escape from the platform within seconds. At present, quantitative analyses of filmed island assays are done manually, which is a laborious undertaking, particularly when performing large screens.
This manuscript describes the &#34;Drosophila Island Assay&#34; and &#34;Island Assay Analysis&#34; algorithms for&#160;high-throughput, automated data processing and quantification of island assay data. In the setup, a simple webcam connected to a laptop collects an image series of the platform while the assay is performed. The &#34;Drosophila Island Assay&#34; algorithm developed for the open-source software Fiji processes these image series and quantifies, for each experimental condition, the number of flies on the platform over time. The &#34;Island Assay Analysis&#34; script, compatible with the free software R, was developed to automatically process the obtained data and to calculate whether treatments/genotypes are statistically different. This greatly improves the efficiency of the island assay and makes it a powerful readout for basic locomotion and flight behavior. It can thus be applied to large screens investigating fly locomotor ability, Drosophila models of movement disorders, and drug efficacy.

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

The island assay is a relatively new, cost-effective assay that can be used to evaluate the basic locomotor behavior of Drosophila melanogaster. This manuscript describes algorithms for automatic data processing and objective quantification of island assay data, making this assay a sensitive, high-throughput readout for large genetic or pharmacological screens.

Análise do elevado-throughput de comportamento Locomotor no ensaio de ilha de Drosophila

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

Measuring Neural Mechanisms Underlying Sleep-Dependent Memory Consolidation During Naps in Early Childhood

Sleep is critical for daily functioning. One important function of sleep is the consolidation of memories, a process that makes them stronger and less vulnerable to interference. The neural mechanisms underlying the benefit of sleep for memory can be investigated using polysomnography (PSG). PSG is a combination of physiological recordings including signals from the brain (EEG), eyes (EOG), and muscles (EMG) that are used to classify sleep stages. In this protocol, we describe how PSG can be used in conjunction with behavioral memory assessments, actigraphy, and parent-report to examine sleep-dependent memory consolidation. The focus of this protocol is on early childhood, a period of significance as children transition from biphasic sleep (consisting of a nap and overnight sleep) to monophasic sleep (overnight sleep only). The effects of sleep on memory performance are measured using a visuospatial memory assessment across periods of sleep and wakeful-rest. A combination of actigraphy and parent report is used to assess sleep rhythms (i.e., characterizing children as habitual or non-habitual nappers). Finally, PSG is used to characterize sleep stages and qualities of those stages (such as frequencies and the presence of spindles) during naps. The advantage of using PSG is that it is the only tool currently available to assess sleep quality and sleep architecture, pointing to the relevant brain state that supports memory consolidation. The main limitations of PSG are the length of time it takes to prepare the recording montage and that recordings are typically taken over one sleep bought. These limitations can be overcome by engaging young participants in distracting tasks during application and combining PSG with actigraphy and self/parent-report measures to characterize sleep cycles. Together, this unique combination of methods allows for investigations into how naps support learning in preschool children.

This protocol describes methods used to examine neural mechanisms underlying sleep-dependent memory consolidation during naps in early childhood. It includes procedures for examining the effect of sleep on behavioral memory performance, as well as the application and recording of both polysomnography and actigraphy.

Medição de mecanismos neurais subjacentes à consolidação da memória dependente do sono durante cochilos na primeira infância

Sleep is critical for daily functioning. One important function of sleep is the consolidation of memories, a process that makes them stronger and less ...