Este protocolo pode ser usado para abordar questões importantes em pesquisas fundamentais e clínicas, olhando para a expressão proteica em diferentes tecidos e pontos de tempo. Para realizar uma mancha ocidental quantitativa confiável, combinamos uma mancha de proteína total fluorescente com um controle interno de carregamento. Isso supera limitações que surgem ao comparar vários tecidos em condições experimentais.
Para extrair proteínas de amostras de células ou tecidos congelados, descongele as amostras de menos 80 graus no gelo antes de lavar as amostras conforme apropriado, de acordo com a tabela. Utilizando um homogeneizador elétrico portátil com um pilão de polipropileno, homogeneize as amostras lavadas, enxaguando o pilão em água duplamente destilada e secando com um tecido limpo entre as amostras. Deixe as amostras no gelo por 10 minutos, seguidas de centrifugação.
Em seguida, transfira o supernanato contendo proteínas para um novo tubo no gelo sem perturbar a pelota. Para quantificação da concentração proteica, configure padrões de albumina de soro bovino no aumento das concentrações em triplicado, e adicione um microliter de cada amostra de proteína em duplicação aos poços apropriados de uma placa óptica de 96 poços. Incubar a proteína em um bloco de calor de 60 graus Celsius por 10 minutos ou mais se a concentração de proteína for esperada para ser baixa e medir a absorção em 560 nanômetros em um leitor de placas.
Exporte as medidas do leitor de placas e calcule a concentração de proteína comparando os valores médios de absorção de cada amostra a uma curva padrão obtida utilizando o padrão proteico. Para normalizar a quantidade de proteína, prepare as diluições das amostras de proteína em tampão de amostras e água ultra-pura e incuba as amostras em um bloco de calor de 70 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, coloque as amostras no gelo antes de vórtices e centrifugando brevemente.
Para eletroforese, configure um gel de gradiente pré-moldado de quatro a 12% Bis-Tris no sistema de câmara de eletroforese gel e carregue 3,5 microlitres de um padrão de proteína no poço. Ao utilizar um padrão interno para normalização entre membranas, carregue uma quantidade igual às outras amostras nos três primeiros poços próximos à escada proteica e carregue 30 microgramas de cada amostra nos poços restantes. Em seguida, passe as amostras através do gel de empilhamento a 80 volts por 10 minutos seguido de 150 volts por um adicional de 45 a 60 minutos.
No final da eletroforese, para montar a pilha de transferência, coloque o gel de proteína na pilha inferior contendo a membrana de difluoreto polivinilidene seguida pelo papel filtro. Use o rolo de manchas para remover quaisquer bolhas de ar e coloque a pilha superior na parte superior do papel do filtro antes de rolar a pilha novamente para remover bolhas de ar. Transfira toda a pilha para o dispositivo de transferência com o eletrodo no lado esquerdo do dispositivo e coloque a esponja de gel na parte superior da pilha para que a esponja esteja alinhada com os contatos elétricos correspondentes no dispositivo.
Depois de fechar a tampa, selecione e inicie o programa apropriado. No final do programa, corte a membrana ao tamanho do gel e lave a membrana de corte rapidamente com água duplamente destilada antes de continuar com a mancha de proteína total. Para coloração total da proteína, enrole a membrana em um tubo de 50 mililitros com o lado da proteína voltado para dentro e rotule a membrana com cinco mililitros de solução de mancha de proteína em um rolo por cinco minutos à temperatura ambiente em uma capa de fumaça.
No final da incubação, lave a membrana rapidamente com cinco mililitros de solução de lavagem, devolvendo o tubo brevemente ao rolo entre as lavagens, seguido de uma breve lavagem com água ultra-pura. Adicione três mililitros de tampão de bloqueio à membrana e devolva a membrana ao rolo por 30 minutos à temperatura ambiente. Substitua o tampão de bloqueio pelo anticorpo primário de interesse na concentração otimizada apropriada e incubar a membrana no rolo durante a noite a quatro graus Celsius.
No dia seguinte, lave a membrana seis vezes por cinco minutos com cinco mililitros de PBS fresco por lavagem no rolo à temperatura ambiente. Após a última lavagem, incubar a membrana com a solução de anticorpos secundários apropriada no rolo durante uma hora em temperatura ambiente, seguida de três lavagens por 30 minutos por lavagem. Após a última lavagem, seque a membrana e use papel alumínio para manter a membrana protegida da luz.
Para aquisição de imagens, coloque a membrana no scanner com o lado da proteína voltado para baixo e selecione a área de digitalização no software. Em seguida, adquira imagens em ambos os canais e exporte as imagens para um programa de análise de imagem adequado. Exibir o canal de 700 nanômetros para mostrar o resultado total da coloração da proteína e Selecionar análise e desenhar retângulo para definir a área de interesse para a normalização.
Em seguida, copie e cole a primeira área de retângulo em cada amostra individual para garantir que a região definida seja do mesmo tamanho para todas as faixas analisadas. Para quantificar a concentração de proteínas em cada pista, copie os resultados tanto da mancha de proteína total quanto da proteína de interesse para um programa de planilha e determine o maior sinal total de mancha de proteína. Em seguida, divida o valor total do sinal de mancha de proteína por esse valor para obter o valor de carga de proteína normalizado e divida o valor do sinal de 800 nanômetros de cada amostra individual pelo seu valor proteico normalizado correspondente para calcular a razão relativa de expressão proteica em diferentes amostras.
Nestas manchas ocidentais representativas, as proteínas extraídas de tecidos obtidos no pós-natal cinco camundongos são comparadas com proteínas extraídas de camundongos adultos de 10 semanas. A quantificação da intensidade de fluorescência da mancha de proteína total foi alcançada medindo a intensidade da fluorescência dentro da caixa de retângulo em cada pista. Quando são analisadas pistas inteiras, a intensidade da fluorescência permanece relativamente semelhante entre as amostras, indicando que o uso da mancha de proteína total para normalização é adequado para este fim.
A mancha de proteína total fluorescente também pode ser usada para comparar níveis de proteína em diferentes pontos de tempo de desenvolvimento. Por exemplo, embora os níveis de proteína do neurônio motor de sobrevivência diminuam claramente com a idade em camundongos, a quantificação total manchada de proteína permanece constante. O uso de normas internas, normalização baseada em fluorescência e estatísticas adequadas aumenta a robustez da análise complexa da expressão proteica em diferentes condições.
Este protocolo se soma às técnicas tradicionais de manchas ocidentais, superando as questões dos controles e comparações de carregamento adequados em lotes experimentais e fornecendo flexibilidades para análise de expressão proteica. Essa abordagem pode ser estendida à comparação da expressão proteica em outras condições experimentais.
