Este trabalho foi apoiado pelo Prêmio Novo Inovador do Diretor do NIH DP2OD006466 (para K.C.H.). Os autores agradecem a Russell Monds por uma demonstração prática do método e pelas discussões científicas.

1. Cultivar culturas bacterianas em 2,5 ml de mídia durante a noite
Culturas de diluição de 1:100 em 250 ml de mídia fresca e crescem para OD600 de 0,7-0,8. Prepare uma solução de 6% de sulfato de dodecyl de sódio (SDS) na água.
ATENÇÃO: O pó SDS é perigoso - evite inalar pó SDS; usar uma máscara sobre o nariz e a boca.
2. Dia 1 - Culturas Bacterianas Lysing é Realizada ao longo de um dia e durante a noite
<ol><li>Enquanto culturas diluídas estão crescendo, configure um banho de água fervente em um prato quente em um béquer 1 L. Uma vez que a água esteja fervendo, aliquot 6 ml de 6% SDS em tubos de polipropileno de 50 ml, adicione uma pequena barra de agitação a cada tubo, fixe as tampas do tubo na mão apertada, coloque tubos no banho de água e ligue mexendo a 500 rpm na placa quente.</li>
	<li>Colher as culturas de 250 ml a 5.000 × g por 10 minutos à temperatura ambiente e resuspend as pelotas em 3 ml de mídia ou 1x salina tamponada com fosfato. Suspensões lentamente de células pipetas em tubos de 50 ml com SDS fervente de 6% para lise das células (concentração final de 4% SDS) enquanto os tubos estão submersos no banho de água fervente, e recuem as tampas para a mão apertada. As suspensões celulares devem ser rapidamente transferidas para SDS fervente uma vez resuspendidas. Mudanças ambientais abruptas devem ser evitadas, pois isso poderia causar alteração errônea da estrutura da paredecelular.
</li>
	<li>Cubra o banho de água fervente e deixe as células ferverem por 3 horas, verificando o nível de água periodicamente e reabastecendo o banho de água quando necessário. Depois de 3 horas, desligue o elemento de aquecimento da placa quente, e continue mexendo durante a noite a 500 rpm.</li>
</ol>3. Dia 2 - Digestões Enzimáticas são realizadas ao longo de um dia
<ol><li>Se o SDS tiver precipitado nos tubos de 50 ml durante a noite, coloque o banho de água para ferver por mais 1-2 horas. Ligue um bloco de calor a 60 °C. Prepare um estoque de 1 mg/ml de Pronase E em 10 mM Tris-HCl (pH 7.2) + 0,06% w/v NaCl e ative o Pronase E a 60 °C por pelo menos 30 min.</li>
	<li>Use um conjunto de ultracentrrifuagem a 400.000 × g para girar amostras por 20 minutos à temperatura ambiente, a fim de pellet os polímeros grandes PG e, assim, purificá-los de outros componentes celulares. Remova o supernatante cuidadosamente e, em seguida, resuspenque cada pelota em água ultrapura de temperatura ambiente. NOTA: O volume de resuspensão depende do volume dos tubos ultracentríficos utilizados; use um volume que encha os tubos pelo menos no meio do caminho, mas não excede o volume máximo dos tubos. Repita centrifugação/lavagem até que a água não forme bolhas durante a ressuspensão, indicando que o SDS foi totalmente removido (tipicamente três lavagens). Pare de lavar a pelota se um precipitado branco se formar, pois isso indica que os saccultos estão se agrupando. O clumping não é catastrófico, mas os aglomerados se ligam fortemente ao plástico e aos vidros, causando grande perda de amostras. Neste caso, proceda com o protocolo usando a amostra sacculi desajeitada.</li>
	<li>Na última etapa de centrifugação/lavagem, resuspenque as amostras em 900 μl de 10 mM Tris-HCl (pH 7.2) + 0,06% w/v NaCl e transfira para tubos de 2 ml anteriormente cutucados com furos no topo com uma pequena agulha. Adicione 100 μl de 1 mg/ml ativado Pronase E (100 μg/ml de concentração final) a cada amostra e incubar a 60 °C por 2 horas. Coloque um bloco de calor diferente para 100 °C.</li>
	<li>Pare a digestão Pronase E adicionando 200 μl de 6% de SDS a cada amostra e ferva as amostras no bloco de calor de 100 °C por 30 minutos. Defina um bloco de calor diferente para 37 °C e faça um estoque de 1 mg/ml de muramidase (mutanolysin) em tampão fosfato de 50 mM (pH 4.9).</li>
	<li>Como na etapa 3.2, use um conjunto de ultracentrífas a 400.000 × g para girar amostras por 20 minutos à temperatura ambiente e lavar com água ultrapura de temperatura ambiente até que o SDS seja totalmente removido (tipicamente três lavagens). O volume de resuspensão depende do volume dos tubos ultracentríficos utilizados; use um volume que encha os tubos pelo menos no meio do caminho, mas não excede o volume máximo dos tubos.</li>
	<li>Na última etapa de centrifugação/lavagem, resuspende amostras em 200 μl de tampão fosfato de sódio de 50 mM (pH 4,9). Este volume pode ser ajustado de acordo com a quantidade de peptidoglycan na amostra, podendo ser dependente de espécies. Se houver relatórios previamente publicados de análise do HPLC para as espécies de interesse, esse volume pode ser estimado com base nessas quantitações (uma compilação de estudos HPLC PG pode ser encontrada nas Informações Suplementares de referência7). Para outras espécies, a preparação do sacculus pode ser executada até esta etapa e, em seguida, diferentes quantidades de volumes de resuspensão podem ser adicionadas para replicar amostras, a fim de determinar o volume mínimo que permite que o PG permaneça em solução (consulte Discussão para novas estimativas). Se a amostra contiver mais peptidoglycan, aumente o volume de resuspensão; se a amostra tiver pouco peptidoglycan, reduza o volume de ressuspensão para um mínimo de 50 μl.</li>
	<li>Transfira amostras para tubos de 1,5 ml e adicione 1 mg/ml muramidase para dar uma concentração final de 40 μg/ml. Incubar 6-8 horas ou durante a noite a 37 °C.</li>
</ol>4. Dia 3 - Preparação de Amostras para UPLC é realizada no último dia
<ol><li>Ligue um bloco de calor a 100 °C. Ferva as amostras sem SDS por 5 minutos para parar a digestão da muramidase. Amostras centrífugas por 10 minutos a 16.000 × g em temperatura ambiente, em seguida, transfira o supernatante (muropeptídeos são agora solúveis) para tubos de vidro de 13 mm x 100 mm. Tente recuperar o máximo de supernasces possível, chegando muito perto da pelota sem perturbá-la.</li>
	<li>Ajuste o pH adicionando 500 mM de tampão de borate (pH 9) à amostra para uma concentração final de 100 mM tampão de borate. O tampão de borate é compatível com o boroidido de sódio do agente redutor. Adicione 1-2 grãos de boroidido de sódio para reduzir cada amostra e deixe a reação prosseguir por pelo menos 30 minutos à temperatura ambiente. ATENÇÃO: O boroidido de sódio é altamente reativo e perigoso de manusear - evite o contato com a pele (use luvas) e evite o contato com os olhos (use óculos de segurança).</li>
	<li>Ajuste as amostras para pH 3-4 (o ponto isoelétrico muropeptídeo é ~3,5) com ácido ortofosfórico de 50% v/v usando incrementos de 20 μl até pH 6, medido com papel indicador de pH, em seguida, usando incrementos de 2 μl. ATENÇÃO: O ácido ortofosfórico é corrosivo e perigoso de manusear - evite o contato com a pele (use luvas) e evite o contato com os olhos (use óculos de segurança). A amostra deve borbulhar em resposta à adição de ácido ortofosfórico; quando a amostra pára de borbulhar, isso normalmente indica que um pH de 6 foi atingido. Se não ocorrer borbulhante na amostra, isso pode indicar que a quantidade de boroidido de sódio adicionada era muito pequena. Neste caso, pare de baixar o pH, adicione cuidadosamente um ou dois grãos de boroidido de sódio, deixe reagir por 5-10 min e retome o ajuste de pH.</li>
	<li>Filtrar a amostra através de um filtro de seringa de 0,22 μm diretamente em um frasco UPLC. Se um precipitado se formar, aqueça o tubo com várias passagens através de uma chama antes de filtrar. Se a amostra não for injetada no instrumento UPLC dentro de um dia, congele a -20 °C durante a noite. As amostras podem ser armazenadas por até um ano a -80 °C. A amostra pode ser descongelada passando por uma chama várias vezes.</li>
	<li>Injete 10 μl de cada amostra em um instrumento UPLC equipado com uma coluna de fase invertida C18 1,7 μm e um detector de absorvência definido para monitorar 202-208 nm. As amostras são injetadas sequencialmente, mas os recursos do autosampler permitem que até 96 amostras sejam processadas em lote. Use fosfato de sódio de 50 mM (pH 4,35) + 0,4% v/v de azida de sódio para solvente A, e fosfato de sódio de 75 mM (pH 4,95) + 15% v/v de metanol para solvente B. NOTA: Azida de sódio é adicionada para compensar a absorção de 205 nm de metanol para evitar a deriva da linha de base. Defina o fluxo para 0,25 ml/min e use um gradiente linear acima de 25 min para alcançar 100% de solvente B e eluição sequencial de muropeptídeos dentro de 30 minutos. Se a espectrometria de massa for usada para caracterizar muropeptídeos após a UPLC, colete frações do pico de interesse em um coletor de frações e seque as frações usando um evaporador centrífuga.</li>
</ol>

<ol>
	<li>den Blaauwen, T., de Pedro, M. A., Nguyen-Disteche, M., Ayala, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+rod-shaped+sacculi.">Morphogenesis of rod-shaped sacculi.</a> FEMS Microbiol. Rev. 32, 321-344 (2008).</li><li>Holtje, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+the+stress-bearing+and+shape-maintaining+murein+sacculus+of+Escherichia+coli.">Growth of the stress-bearing and shape-maintaining murein sacculus of Escherichia coli.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 181-203 (1998).</li><li>Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+regulation+of+peptidoglycan+synthesis+to+bacterial+growth+and+morphology.">From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology.</a> Nat. Rev. Microbiol. 10, 123-136 (2011).</li><li>Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidoglycan+structure+and+architecture.">Peptidoglycan structure and architecture.</a> FEMS Microbiol. Rev. 32, 149-167 (2008).</li><li>Davis, K. M., Weiser, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifications+to+the+peptidoglycan+backbone+help+bacteria+to+establish+infection.">Modifications to the peptidoglycan backbone help bacteria to establish infection.</a> Infect. Immun. 79, 562-570 (2011).</li><li>Healy, V. L., Lessard, I. A., Roper, D. I., Knox, J. R., Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vancomycin+resistance+in+enterococci:+reprogramming+of+the+D-ala-D-Ala+ligases+in+bacterial+peptidoglycan+biosynthesis.">Vancomycin resistance in enterococci: reprogramming of the D-ala-D-Ala ligases in bacterial peptidoglycan biosynthesis.</a> Chem. Biol. 7, 109-119 (2000).</li><li>Desmarais, S. M., De Pedro, M. A., Cava, F., Huang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidoglycan+at+its+peaks:+how+chromatographic+analyses+can+reveal+bacterial+cell+wall+structure+and+assembly.">Peptidoglycan at its peaks: how chromatographic analyses can reveal bacterial cell wall structure and assembly.</a> Mol. Microbiol. 89, 1-13 (2013).</li><li>Glauner, B., Holtje, J., Schwarz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Composition+of+the+murein+of+Escherichia+coli.">The Composition of the murein of Escherichia coli.</a> J. Biol. Chem. 263, 10088-10095 (1988).</li><li>Glauner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+quantification+of+muropeptides+with+high-performance+liquid+chromatography.">Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography.</a> Anal. Biochem. 172 (2), 451-464 (1988).</li><li>Joseleau-Petit, D., Liebart, J. C., Ayala, J. A., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unstable+Escherichia+coli+L+forms+revisited:+growth+requires+peptidoglycan+synthesis.">Unstable Escherichia coli L forms revisited: growth requires peptidoglycan synthesis.</a> J. Bacteriol. 189, 6512-6520 (2007).</li><li>Hakenbeck, R., Holtje, J. V., Labischinski, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The target of penicillin: the murein sacculus of bacterial cell walls architecture and growth. , (1983).</li><li>Boylen, C. W., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratio+of+teichoic+acid+and+peptidoglycan+in+cell+walls+of+Bacillus+subtilis+following+spire+germination+and+during+vegetative+growth.">Ratio of teichoic acid and peptidoglycan in cell walls of Bacillus subtilis following spire germination and during vegetative growth.</a> J. Bacteriol. 96, 421-427 (1968).</li><li>Sutow, A. B., Welker, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+composition+of+the+cell+walls+of+Bacillus+stearothermophilus.">Chemical composition of the cell walls of Bacillus stearothermophilus.</a> J. Bacteriol. 93, 1452-1457 (1967).</li><li>Wang, W. S., Lundgren, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidoglycan+of+a+chemolithotrophic+bacterium,+Ferrobacillus+ferrooxidans.">Peptidoglycan of a chemolithotrophic bacterium, Ferrobacillus ferrooxidans.</a> J. Bacteriol. 95, 1851-1856 (1968).</li><li>de la Rosa, E. J., de Pedro, M. A., Vazquez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penicillin+binding+proteins:+role+in+initiation+of+murein+synthesis+in+Escherichia+coli.">Penicillin binding proteins: role in initiation of murein synthesis in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 5632-5635 (1985).</li><li>Kandler, O., Schleifer, K. H., Dandl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Streptococcus+faecalis+Andrewes+and+Horder+and+Streptococcus+faecium+Orla-Jensen+based+on+the+amino+acid+composition+of+their+murein.">Differentiation of Streptococcus faecalis Andrewes and Horder and Streptococcus faecium Orla-Jensen based on the amino acid composition of their murein.</a> J. Bacteriol. 96, 1935-1939 (1968).</li><li>Kumar, A., Saini, G., Nair, A., Sharma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UPLC:+a+preeminent+technique+in+pharmaceutical+analysis.">UPLC: a preeminent technique in pharmaceutical analysis.</a> Acta Poloniae Pharmaceutica. 69, 371-380 (2012).</li><li>Wilson, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+&amp;#34;ultra+performance&amp;#34;+liquid+chromatography+coupled+to+oa-TOF+mass+spectrometry+as+a+tool+for+differential+metabolic+pathway+profiling+in+functional+genomic+studies.">High resolution &amp;#34;ultra performance&amp;#34; liquid chromatography coupled to oa-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies.</a> J. Proteome Res. 4, 591-598 (2005).</li><li>Wieser, A., Schneider, L., Jung, J., Schubert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-TOF+MS+in+microbiological+diagnostics-identification+of+microorganisms+and+beyond+(mini+review).">MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics-identification of microorganisms and beyond (mini review).</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 93, 965-974 (2012).</li></ol>

Os custos de produção deste artigo foram patrocinados pela Waters Corporation.

Um passo crítico neste procedimento é a etapa 3.1 do segundo dia de preparação da amostra. Se o SDS precipitou durante a noite, ou se as amostras foram armazenadas em 4% de SDS por várias semanas em temperatura ambiente, as amostras devem ser rebovadas por pelo menos 1 hora para ressolar o SDS. Uma causa comum para a precipitação de SDS é o uso de mídia com sais de potássio, por isso o potássio deve ser evitado na mídia, se possível. Como mencionado na seção Resultados Representativos, também é fundament...

O objetivo do método aqui descrito é isolar paredes celulares bacterianas intactas (sacculi) e digerir o peptidoglycan (PG) de modo que a Cromatografia Líquida Ultra Performance (UPLC) possa ser usada para fornecer informações como a identidade dos componentes do muropeptídeo e suas concentrações, o comprimento médio dos fios glicanos e a fração do material envolvido em crosslinks entre fios. Para uma discussão detalhada das espécies de bioquímica e muropeptídeos de PG, existem várias excelentes revisões que descrevem a estrutura pg e seu papel na infecção, resistência, morfogênese e crescimento1-6. A Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC) para análise pg foi inicialmente desenvolvida por Glauner e Schwarz na década de 1980, e mais recentemente foi aprimorada e aplicada extensivamente nos laboratórios de Miguel de Pedro e Waldemar Vollmer. Métodos anteriores utilizaram análise de aminoácidos ou cromatografia de papel, técnicas demoradas e tediosas que não produzem avaliações precisas ou completas de componentes da parede celular.
A análise uplc pode ser facilmente implementada em qualquer laboratório de pesquisa básica que tenha acesso a um ultracentrifuge e UPLC. O método UPLC que apresentamos abaixo isola saccultos completos, fornecendo informações quantitativas e abrangentes sobre todas as espécies químicas nelas. Este método produz quantificação precisa de todos os muropeptídeos em uma população de bactérias, tudo dentro de uma corrida UPLC de 20 minutos. A implementação desse método envolve apenas habilidades básicas de laboratório, sem investimento financeiro significativo em materiais. Para executar as etapas deste método, os pesquisadores só precisam ser qualificados em pipetting, preparação de tampões e enzimas, e ajuste do pH, tornando-o acessível a uma ampla gama de disciplinas científicas. A escolha das enzimas utilizadas neste protocolo depende da espécie de bactéria a ser analisada; o protocolo descrito aqui é útil para Escherichia coli, e tem sido geralmente encontrado como adequado para isolar saccultos de outros organismos Gram-negativos. Recomenda-se consulta à literatura na aplicação deste método a bactérias Gram-positivas; nestas espécies, a purificação do sacculus tem sido tradicionalmente mais difícil. Em particular, este método pode ter que ser alterado em termos de escolha enzimática e tempo de digestão para acomodar as paredes mais grossas e polímeros acessórios, como ácidos teicóicos de bactérias Gram-positivas. A primeira enzima neste protocolo corta a lipoproteína da membrana externa (como a lipoproteína de Braun, ou Lpp) apego ao peptidoglycan, liberando assim todos, exceto o peptídeo C-terminal di-(ou tri-) do Lpp da parede celular. Esta etapa é necessária ao examinar enterobactérias, mas muitas outras bactérias Gram-negativas não têm equivalentes de Lpp, e portanto essa etapa pode ser ignorada. Uma segunda enzima especificamente se acovarda após o componente ácido murâmico do peptidoglycan, solubilizando a subunidade descaramento que forma a espécie muropeptídeo. Para fornecer uma avaliação precisa da arquitetura do PG, deve-se tomar cuidado ao digerir os saccultos para evitar o decote das pontes cruzadas ou qualquer outra parte da haste de peptídeo.
Embora as composições químicas de peptidoglycan de mais de 100 cepas de ~40 espécies bacterianas tenham sido analisadas pelo HPLC, nenhuma análise foi realizada com a tecnologia UPLC. Além disso, trabalhos anteriores caracterizaram peptidoglycan a partir de apenas uma pequena fração do domínio bacteriano, em parte limitado pelo rendimento do HPLC. Portanto, a disseminação desse método para o maior número possível de pesquisadores, e a implementação em plataformas UPLC, será fundamental para conduzir estudos fisiológicos da grande fração de espécies bacterianas cujo peptidoglycan ainda não foi categorizado.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="640">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">Pronase E</td>
			<td style="width:115px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">E629</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mutanolysin from Streptomyces</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M9901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Sodium borohydride (NaBH4)&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">452882</td>
			<td>Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orthophosphoric acid&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">79607</td>
			<td>Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric acid</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">31146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2002</td>
			<td>Sodium azide is a poison</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium tetraborate</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">221732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Millex 0.22 &#956;m syringe filters</td>
			<td style="width:115px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">SLGVR04NL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pH strips (pH range 0-6)</td>
			<td style="width:115px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">M95863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml polypropylene Falcon tubes</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">13 mm x 100 mm glass tubes</td>
			<td style="width:115px;">Kimble Chase</td>
			<td style="width:119px;">60CM13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial</td>
			<td style="width:115px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186000327C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:115px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM9820</td>
			<td>SDS powder is hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">Instrumentation</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Waters Acquity UPLC H-Class system, including:</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Acquity UPLC BEH C18 1.7 &#181;m column</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acquity UPLC PDA Detector</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Waters Fraction Collector III</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and preparation of bacterial cell walls for compositional analysis by ultra performance liquid chromatography

A parede celular bacteriana é fundamental para a determinação da forma celular durante o crescimento e divisão, e mantém a integridade mecânica das células diante das pressões turgor várias atmosferas em magnitude. Através das diversas formas e tamanhos do reino bacteriano, a parede celular é composta de peptidoglycan, uma rede macromolecular de fios de açúcar cruzados por peptídeos curtos. A importância central do peptidoglycan para a fisiologia bacteriana está por trás de seu uso como alvo antibiótico e motivou estudos genéticos, estruturais e biológicos celulares de como ele é fortemente montado durante o crescimento e divisão. No entanto, investigações extensas ainda são necessárias para caracterizar plenamente as principais atividades enzimáticas na síntese peptidoglycan e na composição química das paredes celulares bacterianas. A Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC) é um poderoso método analítico para quantificar diferenças na composição química das paredes de bactérias cultivadas sob uma variedade de condições ambientais e genéticas, mas sua produção é muitas vezes limitada. Aqui, apresentamos um procedimento simples para o isolamento e preparação de paredes celulares bacterianas para análises biológicas de peptidoglycan via HPLC e Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), uma extensão do HPLC que utiliza bombas para fornecer pressões ultra-altas de até 15.000 psi, em comparação com 6.000 psi para HPLC. Em combinação com a preparação de paredes celulares bacterianas apresentadas aqui, os injetores de amostra de baixo volume, detectores com altas taxas de amostragem, volumes amostrais menores e tempos de execução mais curtos de UPLC permitirão alta resolução e throughput para novas descobertas de composição peptidoglycan e biologia celular bacteriana fundamental na maioria dos laboratórios biológicos com acesso a um ultracentrifuge e UPLC.

Utilizando o procedimento descrito na Figura 1,a amostra final deve consistir em pelo menos 200 μl de solução clara que foi filtrada diretamente em um frasco UPLC (etapa 4.4). A separação uplc dos vários muropeptídeos em uma amostra bacteriana baseia-se em sua solubilidade relativa entre a fase móvel líquida e a fase estacionária da coluna. As colunas C18 de fase invertida fornecem uma matriz fortemente hidrofóbica para separar as espécies de muropeptídeos à base de hidroofobidade e tamanho...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography at JoVE.com

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

A parede celular bacteriana é composta de peptidoglycan, uma rede macromolecular de fios de açúcar cruzados por peptídeos. A Cromatografia Líquida Ultra Performance fornece alta resolução e throughput para novas descobertas da composição peptidoglycan. Apresentamos um procedimento para o isolamento das paredes celulares (sacculi) e sua posterior preparação para análise via UPLC.

Isolamento e Preparação de Paredes Celulares Bacterianas para Análise Composicional por Cromatografia Líquida de Ultra Desempenho

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

isolation-preparation-bacterial-cell-walls-for-compositional-analysis

Research

JoVE Journal

Chemistry

16.0K visualizações.  Stanford University. A parede celular bacteriana é composta de peptidoglycan, uma rede macromolecular de fios de açúcar cruzados por peptídeos. A Cromatografia Líquida Ultra Performance fornece alta resolução e throughput para novas descobertas da composição peptidoglycan. Apresentamos um procedimento para o isolamento das paredes celulares (sacculi) e sua posterior preparação para análise via UPLC.

Vídeo: Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. The approach offers an unbiased and in-depth analysis that can enable the development of diagnostic tests, novel therapies, and further our understanding of disease processes. The inherent chemical diversity of the metabolome creates significant analytical challenges and there is no single experimental approach that can detect all metabolites. Additionally, the biological variation in individual metabolism and the dependence of metabolism on environmental factors necessitates large sample numbers to achieve the appropriate statistical power required for meaningful biological interpretation. To address these challenges, this tutorial outlines an analytical workflow for large scale non-targeted metabolite profiling of serum by UPLC-MS. The procedure includes guidelines for sample organization and preparation, data acquisition, quality control, and metabolite identification and will enable reliable acquisition of data for large experiments and provide a starting point for laboratories new to non-targeted metabolite profiling by UPLC-MS.

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. This article outlines a typical workflow utilized for non-targeted metabolite profiling of serum including sample organization and preparation, data acquisition, data analysis, quality control, and metabolite identification.

Grande Escala Profiling não-alvo metabolômica de soro por cromatografia líquida de ultra-espectrometria de massa (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Química

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first separated into polar and non-polar fractions by a liquid-liquid phase extraction, and partially purified to facilitate downstream analysis. Both aqueous (polar metabolites) and organic (non-polar metabolites) phases of the initial extraction are processed to survey a broad range of metabolites. Metabolites are separated by different liquid chromatography methods based upon their partition properties. In this method, we present microflow ultra-performance (UP)LC methods, but the protocol is scalable to higher flows and lower pressures. Introduction into the mass spectrometer can be through either general or compound optimized source conditions. Detection of a broad range of ions is carried out in full scan mode in both positive and negative mode over a broad m/z range using high resolution on a recently calibrated instrument. Label-free differential analysis is carried out on bioinformatics platforms. Applications of this approach include metabolic pathway screening, biomarker discovery, and drug development.

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Untargeted metabolomics provides a hypothesis generating snapshot of a metabolic profile. This protocol will demonstrate the extraction and analysis of metabolites from cells, serum, or tissue. A range of metabolites are surveyed using liquid-liquid phase extraction, microflow ultraperformance liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) coupled to differential analysis software.

Metabolomics irrelevantes de fontes biológicas Usando UltraPerformance cromatografia líquida de alta resolução Espectrometria de Massa (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, yielding results with high accuracy and high reproducibility. In metabolic and nutrition studies GC allows assessment of changes in fatty acid concentrations following interventions or during changes in physiological state such as pregnancy. Solid phase extraction (SPE) using aminopropyl silica cartridges allows separation of the major lipid classes including triacylglycerols, different phospholipids, and cholesteryl esters (CE). GC combined with SPE was used to analyze the changes in fatty acid composition of the CE fraction in the livers of virgin and pregnant rats that had been fed various high and low fat diets. There are significant diet/pregnancy interaction effects upon the omega-3 and omega-6 fatty acid content of liver CE, indicating that pregnant females have a different response to dietary manipulation than is seen among virgin females.

Pregnancy leads to significant changes to the fatty acid composition of maternal tissues. Lipid profiles can be obtained via gas chromatography to allow identification and quantification of fatty acids in individual lipid classes among rats fed various high and low fat diets during pregnancy.

O uso de cromatografia gasosa para analisar composicional Alterações de ácidos graxos no tecido de fígado de rato durante a gravidez

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, ...

Synthesis and Catalytic Performance of Gold Intercalated in the Walls of Mesoporous Silica

As a promising catalytically active nano reactor, gold nanoparticles intercalated in mesoporous silica (GMS) were successfully synthesized and properties of the materials were investigated. We used a one pot sol-gel approach to intercalate gold nano particles in the walls of mesoporous silica. To start with the synthesis, P123 was used as template to form micelles. Then TESPTS was used as a surface modification agent to intercalate gold nano particles. Following this process, TEOS was added in as a silica source which underwent a polymerization process in acid environment. After hydrothermal processing and calcination, the final product was acquired. Several techniques were utilized to characterize the porosity, morphology and structure of the gold intercalated mesoporous silica. The results showed a stable structure of mesoporous silica after gold intercalation. Through the oxidation of benzyl alcohol as a benchmark reaction, the GMS materials showed high selectivity and recyclability.

Here, we present a protocol with a sol-gel process to synthesize gold intercalated in the walls of mesoporous materials (GMS), which is confirmed to possess a mesoporous matrix with gold intercalated in the walls imparting great stability and recyclability.

Síntese e desempenho catalítico de ouro intercalados nas paredes de mesoporosos Silica

As a promising catalytically active nano reactor, gold nanoparticles intercalated in mesoporous silica (GMS) were successfully synthesized and properties ...

Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Pós Coluna A derivação utilizando a reação Fluxo cromatografia líquida de alta Colunas

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

Radiomarcação e quantificação dos níveis celulares de Fosfoinositídeos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplado Fluxo de Cintilação

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans. De-starched wheat endosperm cell walls were isolated as an alcohol-insoluble residue (AIR)1 and sequentially extracted with water (W-sol Fr) and 1 M KOH containing 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) as described by Ratnayake et al. (2014)2. Two different approaches (see summary in Figure 1) are adopted. In the first, intact W-sol AXs are treated with 2AB to tag the original RE backbone chain sugar residue and then treated with an endoxylanase to generate a mixture of 2AB-labelled RE and internal region reducing oligosaccharides, respectively. In a second approach, the KOH-sol Fr is hydrolyzed with endoxylanase to first generate a mixture of oligosaccharides which are subsequently labelled with 2AB. The enzymically released ((un)tagged) oligosaccharides from both W- and KOH-sol Frs are then methylated and the detailed structural analysis of both the native and methylated oligosaccharides is performed using a combination of MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS and ESI-MSn. Endoxylanase digested KOH-sol AXs are also characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) that also provides information on the anomeric configuration. These techniques can be applied to other classes of polysaccharides using the appropriate endo-hydrolases.

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).

Sequenciamento de parede planta heteroxilanos Usando enzimática, química (metilação) e físico (espectrometria de massa, ressonância magnética nuclear) Técnicas

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring high sensitivity and a wide dynamic range. Mass spectrometry-based quantification assays for proteins typically involve protein digestion followed by the selective reaction monitoring/multiple reaction monitoring (SRM/MRM) quantification of peptides using a low-resolution (Rs ~1,000) tandem quadrupole mass spectrometer. One of the limitations of this approach is the interference phenomenon observed when the peptide of interest has the "same" precursor and fragment mass (in terms of m/z values) as other co-eluting peptides present in the sample (within a 1-Da window). To avoid this phenomenon, we propose an alternative mass spectrometric approach, a high selectivity (HS) MRM assay that combines the ion mobility separation of peptide precursors with the high-resolution (Rs ~30,000) MS detection of peptide fragments. We explored the capabilities of this approach to quantify low-abundance peptide standards spiked in a monoclonal antibody (mAb) digest and demonstrated that it has the sensitivity and dynamic range (at least 3 orders of magnitude) typically achieved in HCP analysis. All six peptide standards were detected at concentrations as low as 0.1 nM (1 femtomole loaded on a 2.1-mm ID chromatographic column) in the presence of a high-abundance peptide background (2 &#181;g of a mAb digest loaded on-column). When considering the MW of rabbit phosphorylase (97.2 kDa), from which the spiked peptides were derived, the LOQ of this assay is lower than 50 ppm. Relative standard deviations (RSD) of peak areas (n = 4 replicates) were less than 15% across the entire concentration range investigated (0.1-100 nM or 1-1,000 ppm) in this study.

Here, we describe a chromatographic assay coupled with the ion mobility separation of peptide precursors followed by the high-resolution (~30,000) MS-detection of peptide fragments for the quantification of spiked peptide standards in a monoclonal antibody digest.

Um ensaio de HS-MRM para a quantificação de proteínas de célula hospedeira em biofármacos de proteínas por espectrometria de massa líquida cromatografia iônica mobilidade QTOF

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography (HPLC)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil quality, food flavoring, and human health. The biological activity of glucosinolates is released upon tissue damage, when they are mixed with the enzyme myrosinase. This results in the formation of pungent and toxic breakdown products, such as isothiocyanates and nitriles. Currently, more than 130 structurally different glucosinolates have been identified. The chemical structure of the glucosinolate is an important determinant of the product that is formed, which in turn determines its biological activity. The latter may range from detrimental (e.g., progoitrin) to beneficial (e.g., glucoraphanin). Each glucosinolate-containing plant species has its own specific glucosinolate profile. For this reason, it is important to correctly identify and reliably quantify the different glucosinolates present in brassicaceous leaf, seed, and root crops or, for ecological studies, in their wild relatives. Here, we present a well-validated, targeted, and robust method to analyze glucosinolate profiles in a wide range of plant species and plant organs. Intact glucosinolates are extracted from ground plant materials with a methanol-water mixture at high temperatures to disable myrosinase activity. Thereafter, the resulting extract is brought onto an ion-exchange column for purification. After sulfatase treatment, the desulfoglucosinolates are eluted with water and the eluate is freeze-dried. The residue is taken up in an exact volume of water, which is analyzed by high-pressure liquid chromatography (HPLC) with a photodiode array (PDA) or ultraviolet (UV) detector. Detection and quantification are achieved by conducting comparisons of the retention times and UV spectra of commercial reference standards. The concentrations are calculated based on a sinigrin reference curve and well-established response factors. The advantages and disadvantages of this straightforward method, when compared to faster and more technologically advanced methods, are discussed here.

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography HPLC

Here, we describe in great detail an established and robust protocol for the extraction of glucosinolates from ground plant materials. After an on-column sulfatase treatment of the extracts, the desulfoglucosinolates are eluted and analyzed by high-pressure liquid chromatography.

Um método simples para glucosinolatos Extracção e análise com cromatografia líquida de alta pressão (HPLC)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil ...

Liquid-cell Transmission Electron Microscopy for Tracking Self-assembly of Nanoparticles

Drying a nanoparticle dispersion is a versatile way to create self-assembled structures of nanoparticles, but the mechanism of this process is not fully understood. We have traced the trajectories of individual nanoparticles using liquid-cell transmission electron microscopy (TEM) to investigate the mechanism of the assembly process. Herein, we present the protocols used for liquid-cell TEM studies of the self-assembly mechanism. First, we introduce the detailed synthetic protocols used to produce uniformly sized platinum and lead selenide nanoparticles. Next, we present the microfabrication processes used to produce liquid cells with silicon nitride or silicon windows and then describe the loading and imaging procedures of the liquid-cell TEM technique. Several notes are included to provide helpful tips for the entire process, including how to manage the fragile cell windows. The individual motions of nanoparticles tracked by liquid-cell TEM revealed that changes in the solvent boundaries caused by evaporation affected the self-assembly process of nanoparticles. The solvent boundaries drove nanoparticles to primarily form amorphous aggregates, followed by flattening of the aggregates to produce a 2-dimensional (2D) self-assembled structure. These behaviors are also observed for different nanoparticle types and different liquid-cell compositions.

Here we introduce experimental protocols for the real-time observation of a self-assembly process using liquid-cell transmission electron microscopy.

Microscopia eletrônica de transmissão de líquido-celular para rastreamento auto-montagem de nanopartículas

Drying a nanoparticle dispersion is a versatile way to create self-assembled structures of nanoparticles, but the mechanism of this process is not fully ...