Este trabalho foi apoiado por subsídios AI064184 e AI76322 dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) e por Grant 61789-MA-MUR do Army Research Office para MST A pesquisa também foi apoiado por Welch Foundation Grant F1155 e NIH conceder R01GM103655 a JSB

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste protocolo temos detalhou o isolamento de espécies de um lipídio a partir de células inteiras de bactérias, e descreveu TLC ou métodos analíticos baseados MS caracterizar quimicamente o material isolado. Espectrometria de massa em tandem é uma estratégia poderosa para de novo caracterização estrutural de compostos biológicos, e é de valor inestimável para a caracterização química da panóplia de moléculas de um lipídio observadas na natureza. CID e UVPD são dois métodos de ativação co...

O lipopolissacárido (LPS) é a maior molécula de superfície externa de praticamente todos os organismos gram-negativas e consiste de três domínios: um moleculares polissacáridos distal-O antigénio, um núcleo de oligossacáridos, e o lipídicas associadas à membrana Um domínio depositado no folheto exterior da exterior da membrana em bicamada 1,2. O lípido A domínio consiste em 3-desoxi-D-mano-oct-2-ulosonic (Kdo) e resíduos de um lípido A de espécies moleculares, em que o lípido A pode ser definido como a porção solúvel em clorofórmio de LPS durante a hidrólise com ácido fraco 1, 2. O lípido padrão A molécula pode ser quimicamente definido como uma espinha dorsal diglucosamine que é fosforilado e bis-acilado-hexa; consistente com as espécies principais lípido A observados no modelo de organismo de Escherichia coli (E. coli), 1,2. Nove genes expressos constitutivamente, conservadas ao longo de bactérias gram-negativas, são responsáveis ​​pela produção do lípido A do domínio (Figura 1) 1,2. A maioria das bactérias têm um conjunto adicional de genes, que variam em grau de conservação filogenética, que participam de uma nova modificação química de lipídios A 3. Desfosforilação, a remoção de cadeias de acilo, e a adição de porções químicas, tais como os açúcares (por exemplo, idos aminoarabinose) e / ou fosfoetanolamina são as actividades mais comumente observados (Figura 1). Muitas das enzimas responsáveis ​​pela modificação do lípido A são directamente accionados por sinais ambientais, tais como catiões divalentes, ou a sua expressão é regulada por dois sistemas de resposta de regulador do componente 3. Reconhecimento de espécies de um lípido pelo sistema imune inato hospedeiro é mediada pelo receptor Toll-like factor de diferenciação 4/myeloid 2 (TLR4/MD2) co-receptor 4. Forças hidrofóbicas entre MD2 e o lípido A cadeias acilo, bem como entre TLR4 e dos grupos de fosfato 1 e 4 de lípido A promovem a forte associação do lábioUm ID com TLR4/MD2 4,5. As modificações que alteram estado acilação ou a carga negativa de lípido A de lípidos com base impacto TLR4/MD2 Um reconhecimento e a jusante da estimulação da resposta imune inata activadores do NF-kB e de mediadores da inflamação, tais como TNFa e IL-1-β 6,7. Modificações que mascarar a carga negativa de lípido A, também impedir que os péptidos antimicrobianos catiónicos bactericidas de ligação a bactérias gram-negativas superfícies celulares 3,8. Muitas modificações lipídico A são a hipótese de aumentar a aptidão de bactérias em condições ambientais específicas, como no interior do hospedeiro humano ou em um nicho ecológico. Por esta razão, muitas enzimas de modificação são alvos atraentes para o desenvolvimento racional de compostos antimicrobianos. A diversidade química das estruturas um lipídio, em relação ao organismo e / ou meio ambiente, e as implicações biológicas destas diversas estruturas fazer a caracterização estrutural de lipídios A um esforço importante em tele estudar de bactérias gram-negativas. Isolamento de moléculas de um lípido de bactérias inteiras envolve a extracção de LPS a partir da superfície celular bacteriana, um passo hidrolítico para libertar o lípido A, seguido de um procedimento de purificação final 9-11. O procedimento de extração mais citados LPS é o procedimento de extracção de água quente-fenol, introduzido pela primeira vez por Westphal e Jann 10. Depois de toda a extracção de LPS é submetido a hidrólise com ácido fraco, o qual separa quimicamente Kdo do 6&#39;-hidroxilo do açúcar glucosamina distal do lípido A (Figura 1). Existem numerosos perigos para o procedimento de água quente-fenol, incluindo o uso de um reagente de risco elevado, a necessidade de degradar os ácidos nucleicos extraídos de co-e proteínas, e vários dias são necessários para completar o protocolo de 10. Nosso laboratório desenvolveu ainda mais a extração e isolamento de lipídio A como o primeiro desenvolvido pela Caroff e Raetz 12,13. Em comparação com os procedimentos de água quente-fenol, o método aqui apresentado é mais rápida e eficiente e acomoda uma larga gama de volumes de cultura de 5 ml para vários litros. Além disso, ao contrário de extrações de água quente-fenol, o nosso método não seleciona para ásperas ou lisas-tipos de LPS, proporcionando ótima recuperação de espécies um lipídio. No nosso protocolo de lise química de células bacterianas inteiras é realizada utilizando uma mistura de clorofórmio, metanol e água, onde LPS pode ser sedimentado por centrifugação. Uma combinação de hidrólise com ácido fraco e extracções com solvente (Bligh-Dyer) são usados ​​para libertar o lípido A de polissacárido covalentemente ligado. O método de Bligh e Dyer foi aplicada primeiramente para a extracção de lípidos de espécies a partir de uma variedade de animais e de tecidos vegetais 14, modificado aqui para separar polissacárido hidrolisada de lípido A. Nesta etapa final de separação, lípidos solúveis clorofórmio particionar selectivamente para a fase orgânica inferior fase. Para purificar ainda mais o lípido A, de fase inversa oucromatografia de coluna de troca aniónica pode ser usado 12. Após o isolamento de espécies de um lípido de células completas, uma série de métodos analíticos pode ser utilizado para caracterizar a estrutura química do material isolado, tais como RMN, TLC e análise baseada em MS. RMN permite a elucidação estrutural não-destrutiva, e fornece detalhe estrutural relacionada com ligações glicosídicas, atribuição inequívoca de posições cadeia acil e atribuição de pontos de ligação para modificações um lipídio como aminoarabinose ou phosphoethanolamine 15-17. A análise de RMN de lípido A não é discutido no nosso protocolo, mas foi descrito em outro lugar adequadamente 15,16. Para a análise rápida TLC com base métodos são frequentemente utilizados, mas não fornecem informação directa sobre a estrutura química fina. Protocolos baseados MS são o método mais empregado para caracterizar estruturas um lipídio 18,19. Matriz associada a laser dessorção por ionização (MALDI)-MS é muitas vezes usado para examinar inicialmente espécies intactas lipídico A. Íons de carga única são gerados a partir do analito preparadas de acordo com os nossos procedimentos de extração. Como é necessária a análise estrutural mais fina, métodos baseados em MS / MS provar mais informativo do que MALDI-MS. Acoplado a ionização electrospray (ESI) lipídico isoladamente ou multiplicar cobrada uma íons precursores são ainda mais fragmentado por colisão induzida dissociação (CID) ou fotodissociação ultravioleta (UVPD), para gerar íons produtos estruturalmente informativos 18,20,21. Produtos da perda neutra do lipídio A íons precursores também são freqüentemente gerados durante ESI-MS fornecer uma camada adicional de informações estruturais. Espectrometria de massa em tandem (MS / MS) provou ser um método indispensável e versátil para a elucidação da estrutura de um lípido. Durante a MS / MS, os iões são activados para proporcionar um padrão de fragmentação de diagnóstico que pode ser utilizado para elucidar a estrutura do ião precursor. O mais amplamente available método MS / MS é CID. Este método produz iões fragmento através de colisões ião precursor seleccionado com um gás inerte alvo, resultando em deposição de energia que leva à dissociação. CID provou uma ferramenta fundamental na atribuição de lípido A estrutura para uma ampla gama de espécies bacterianas 22-33. Embora CID é o método MS / MS mais universalmente implementado, ele gera um conjunto limitado de íons de produtos. 193 nm UVPD é uma alternativa e complementar método MS / MS. Este método utiliza um laser para irradiar iões, e a absorção de fotões resulta na activação dos iões e dissociação subsequente. Esta maior energia técnica MS / MS produz um conjunto mais diversificado de íons produtos que CID e, portanto, fornece padrões de fragmentação mais informativas. Em particular, UVPD oferece informações sobre mudanças sutis em espécie um lipídio com base em clivagens no glicosídica, amina, acil e CC ligado títulos 18,21,34.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C607</td>
			<td>HPLC Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A452</td>
			<td>HPLC Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Teflon FEP Centrifuge Bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-562-21</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Silica Gel 60 TLC Plates</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>5626-6</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Grade No. 3MM Chromatography Paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3030700</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Orbitrap Elite</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ExciStar XS Excimer Lasrer</td>
			<td>Coherent Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PicoTip Nanospray ESI emitters</td>
			<td>New Obectives</td>
			<td></td>
			<td>&ge; 30 &mu;m to reduce clogging</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Model 505 Pulse/Delay Generator</td>
			<td>Berkeley Nucleonics Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hot Plate Thermoylne 2200</td>
			<td>Barnstead/Thermolyne</td>
			<td>HPA2235MQ</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>16x125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes</td>
			<td>Corning Pyrex</td>
			<td>99449-16X</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415</td>
			<td>Corning </td>
			<td>9999-152</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Personal Molecular Imager System (phosphorimager)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-9400</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Autoradiography Cassette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FBCS810</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phosphorscreen SO230</td>
			<td>Kodak</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Peptide Mass Standards Kit</td>
			<td>Sequazyme</td>
			<td>P2-3143-00</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sonifier S250-A</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101063196</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1.5 ml 12x32 mm Tapered Base Screw Thread Vial</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C4000-V1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

isolation and chemical characterization of lipid a from gram-negative bacteria

O lipopolissacárido (LPS) é a maior molécula da superfície celular de bactérias gram-negativas, depositado em monocamada externa da bicamada da membrana externa. LPS pode ser subdividida em três domínios: o distal O-polissacáridos, oligossacáridos um núcleo, e o lípido A domínio constituído por um lípido A espécie molecular e radicais de ácido 3-desoxi-D-mano-oct-2-ulosonic (Kdo). O domínio de lípido A é o único componente essencial para a sobrevivência da célula bacteriana. Após a sua síntese, o lípido A é quimicamente modificado em resposta a tensões ambientais tais como o pH ou da temperatura, para promover a resistência a compostos antibióticos, e para evitar o reconhecimento por mediadores da resposta imune inata hospedeiro. O protocolo seguinte fornece detalhes sobre o isolamento em pequena e grande escala de lípido A de bactérias Gram-negativas. Isolado de material é, então, caracterizada quimicamente por cromatografia em camada fina (TLC) ou por espectrometria de massa (MS). Em adição à matriz assistida por laser de dessorção / ionização-tempo de fluz (MALDI-TOF) MS, que também descrevem em tandem protocolos MS para análise de lipídios A espécie molecular utilizando ionização por electrospray (ESI) acoplado a colisão induzida dissociação (CID) e fotodissociação ultravioleta recém-contratados (UVPD) métodos. Os nossos protocolos MS permitir a determinação inequívoca da estrutura química, fundamental para a caracterização de moléculas de um lípido que contêm modificações químicas únicas ou novos. Nós também descrevem a rotulagem radioisotópica, e posterior isolamento, de lipídios A partir de células bacterianas para análise por TLC. Em relação a protocolos baseados em MS, TLC fornece um método de caracterização mais económica e rápida, mas não pode ser utilizada para atribuir inequivocamente lípido A estrutura química, sem o uso de padrões de estrutura química conhecida. Ao longo das duas últimas décadas, o isolamento e caracterização de lípido A levou a numerosas descobertas interessantes que melhoraram a compreensão da fisiologia das bactérias gram-negativas, os mecanismos de resistência a antibióticoscia, a resposta imune inata humana, e forneceram muitos novos alvos para o desenvolvimento de compostos antibacterianos.

Lipídico Canonical A do E. coli e Salmonella enterica serovar Typhimurium é um dissacárido acilado-hexa de glucosamina com os grupos de fosfato nas posições 1 - e 4 &#39;-posições. Durante o crescimento em meios ricos (por exemplo, Luria Broth) uma porção do lípido A contém um grupo de pirofosfato na posição 1, obtendo-se um tris-fosforilada espécies 36 (Figura 1). Kdo (-D-mano-3-desoxi octulosonic ácido), está ligado na posição 6...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria at JoVE.com

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Isolamento e caracterização do domínio de lípido A do lipopolissacárido (LPS) da bactéria gram-negativa proporciona uma visão sobre os mecanismos da superfície celular com base de resistência ao antibiótico, a sobrevivência das bactérias e forma, e como quimicamente lípido A diversidade de espécies moleculares diferencialmente hospedeiras modular respostas imunitárias inatas.

Isolamento e Caracterização química do lípido A de bactérias Gram-negativas

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

isolation-chemical-characterization-lipid-from-gram-negative

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Biochemistry

SCIENTISTS IN ACTION

31.5K visualizações.  The University of Texas at Austin.  Isolamento e caracterização do domínio de lípido A do lipopolissacárido (LPS) da bactéria gram-negativa proporciona uma visão sobre os mecanismos da superfície celular com base de resistência ao antibiótico, a sobrevivência das bactérias e forma, e como quimicamente lípido A diversidade de espécies moleculares diferencialmente hospedeiras modular respostas imunitárias inatas. 

Vídeo: Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Free Radicals in Chemical Biology: from Chemical Behavior to Biomarker Development

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological processes. This subject embraces diverse scientific areas, spanning from physical, biological and bioorganic chemistry to biology and medicine, with applications to the amelioration of quality of life, health and aging. Multidisciplinary skills are required for the full investigation of the many facets of radical processes in the biological environment and chemical knowledge plays a crucial role in unveiling basic processes and mechanisms. We developed a chemical biology approach able to connect free radical chemical reactivity with biological processes, providing information on the mechanistic pathways and products. The core of this approach is the design of biomimetic models to study biomolecule behavior (lipids, nucleic acids and proteins) in aqueous systems, obtaining insights of the reaction pathways as well as building up molecular libraries of the free radical reaction products. This context can be successfully used for biomarker discovery and examples are provided with two classes of compounds: mono-trans isomers of cholesteryl esters, which are synthesized and used as references for detection in human plasma, and purine 5',8-cyclo-2'-deoxyribonucleosides, prepared and used as reference in the protocol for detection of such lesions in DNA samples, after ionizing radiations or obtained from different health conditions.

Radical-based biomimetic chemistry has been applied to building-up libraries necessary for biomarker development.

Radicais Livres em Biologia Química: de comportamento químico para o Desenvolvimento de biomarcadores

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological ...

Química

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both stimuli and cargo can be tailored according to specific needs. Here we describe the DNA nanorobot fabrication protocol, with the use of the DNA origami technique. The procedure initiates by mixing short single-strand DNA staples into a stock mixture which is then added to a long, circular, single-strand DNA scaffold in presence of a folding buffer. A standard thermo cycler is programmed to gradually lower the mixing reaction temperature to facilitate the staples-to-scaffold annealing, which is the guiding force behind the folding of the nanorobot. Once the 60 hr folding reaction is complete, excess staples are discarded using a centrifugal filter, followed by visualization via agarose-gel electrophoresis (AGE). Finally, successful fabrication of the nanorobot is verified by transmission electron microscopy (TEM), with the use of uranyl-formate as negative stain.

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

Dobragem e Caracterização de um robô Bio-responsivo a partir de ADN de Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

The traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the use of solid-phase synthesis by appending suitably modified phosphoramidite precursors to the nascent chain. However, the conditions used during the synthesis and the restriction to rather short sequences hamper the applicability of this methodology. On the other hand, modified nucleoside triphosphates are activated building blocks that have been employed for the mild introduction of numerous functional groups into nucleic acids, a strategy that paves the way for the use of modified nucleic acids in a wide-ranging palette of practical applications such as functional tagging and generation of ribozymes and DNAzymes. One of the major challenges resides in the intricacy of the methodology leading to the isolation and characterization of these nucleoside analogues.
	
	In this video article, we present a detailed protocol for the synthesis of these modified analogues using phosphorous(III)-based reagents. In addition, the procedure for their biochemical characterization is divulged, with a special emphasis on primer extension reactions and TdT tailing polymerization. This detailed protocol will be of use for the crafting of modified dNTPs and their further use in chemical biology.

The protocol described herein aims to explain and abridge the numerous obstacles in the way of the intricate route leading to modified nucleoside triphosphates. Consequently, this protocol facilitates both the synthesis of these activated building-blocks and their availability for practical applications.

Nucleosídeos Trisfosfatos - Da síntese à Caracterização Bioquímica

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

An Inverse Analysis Approach to the Characterization of Chemical Transport in Paints

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in understanding contaminant mass transport and the ability to decontaminate materials. If a material is contaminated, over time, the transport of highly toxic chemicals (such as chemical warfare agent species) out of the material can result in vapor exposure or transfer to the skin, which can result in percutaneous exposure to personnel who interact with the material. Due to the high toxicity of chemical warfare agents, the release of trace chemical quantities is of significant concern. Mapping subsurface concentration distribution and transport characteristics of absorbed agents enables exposure hazards to be assessed in untested conditions. Furthermore, these tools can be used to characterize subsurface reaction dynamics to ultimately design improved decontaminants or decontamination procedures. To achieve this goal, an inverse analysis mass transport modeling approach was developed that utilizes time-resolved mass spectroscopy measurements of vapor emission from contaminated paint coatings as the input parameter for calculation of subsurface concentration profiles. Details are provided on sample preparation, including contaminant and material handling, the application of mass spectrometry for the measurement of emitted contaminant vapor, and the implementation of inverse analysis using a physics-based diffusion model to determine transport properties of live chemical warfare agents including distilled mustard (HD) and the nerve agent VX.

In this paper, a procedure for quantifying the mass transport parameters of chemicals in various materials is presented. This process involves employing an inverse-analysis based diffusion model to vapor emission profiles recorded by real-time, mass spectrometry in high vacuum.

Uma abordagem de análise inversa à caracterização dos Transportes Química em Tintas

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and technological applications. Their signature property is their ultrahigh porosity, which however imparts a series of challenges when it comes to both constructing them and working with them. Securing desired MOF chemical and physical functionality by linker/node assembly into a highly porous framework of choice can pose difficulties, as less porous and more thermodynamically stable congeners (e.g., other crystalline polymorphs, catenated analogues) are often preferentially obtained by conventional synthesis methods. Once the desired product is obtained, its characterization often requires specialized techniques that address complications potentially arising from, for example, guest-molecule loss or preferential orientation of microcrystallites. Finally, accessing the large voids inside the MOFs for use in applications that involve gases can be problematic, as frameworks may be subject to collapse during removal of solvent molecules (remnants of solvothermal synthesis). In this paper, we describe synthesis and characterization methods routinely utilized in our lab either to solve or circumvent these issues. The methods include solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries, and materials activation (cavity evacuation) by supercritical CO2 drying. Finally, we provide a protocol for determining a suitable pressure region for applying the Brunauer-Emmett-Teller analysis to nitrogen isotherms, so as to estimate surface area of MOFs with good accuracy.

Synthesis, activation, and characterization of intentionally designed metal-organic framework materials is challenging, especially when building blocks are incompatible or unwanted polymorphs are thermodynamically favored over desired forms. We describe how applications of solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries and activation via supercritical CO2 drying, can address some of these challenges.

Síntese e caracterização de funcionalizados metal-organic frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

Preparando células aderentes para fluorescência de raios-X Imagem por Chemical Fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical properties for applications in photonics, drug delivery and coating technology. Here we present a new family of colloidal building blocks, coined supramolecular colloids, whose self-assembly is controlled through surface-functionalization with a benzene-1,3,5-tricarboxamide (BTA) derived supramolecular moiety. Such BTAs interact via directional, strong, yet reversible hydrogen-bonds with other identical BTAs. Herein, a protocol is presented that describes how to couple these BTAs to colloids and how to quantify the number of coupling sites, which determines the multivalency of the supramolecular colloids. Light scattering measurements show that the refractive index of the colloids is almost matched with that of the solvent, which strongly reduces the van der Waals forces between the colloids. Before photo-activation, the colloids remain well dispersed, as the BTAs are equipped with a photo-labile group that blocks the formation of hydrogen-bonds. Controlled deprotection with UV-light activates the short-range hydrogen-bonds between the BTAs, which triggers the colloidal self-assembly. The evolution from the dispersed state to the clustered state is monitored by confocal microscopy. These results are further quantified by image analysis with simple routines using ImageJ and Matlab. This merger of supramolecular chemistry and colloidal science offers a direct route towards light- and thermo-responsive colloidal assembly encoded in the surface-grafted monolayer.

A protocol for the synthesis and characterization of colloids coated with supramolecular moieties is described. These supramolecular colloids undergo self-assembly upon the activation of the hydrogen-bonds between the surface-anchored molecules by UV-light.

Síntese e Caracterização de Supramoleculares Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables the silk proteins to be compact and ordered by shearing and elongation forces. Here, a biomimetic microfluidic channel was designed to mimic the specific geometry of the spinning duct of the silkworm. Regenerated silk fibroin (RSF) spinning doped with high concentration, was extruded through the microchannel to dry-spin fibers at ambient temperature and pressure. In the post-treated process, the as-spun fibers were drawn and stored in ethanol aqueous solution. Synchrotron radiation wide-angle X-ray diffraction (SR-WAXD) technology was used to investigate the microstructure of single RSF fibers, which were fixed to a sample holder with the RSF fiber axis normal to the microbeam of the X-ray. The crystallinity, crystallite size, and crystalline orientation of the fiber were calculated from the WAXD data. The diffraction arcs near the equator of the two-dimensional WAXD pattern indicate that the post-treated RSF fiber has a high orientation degree.

A protocol for the microfluidic spinning and microstructure characterization of regenerated silk fibroin monofilament is presented.

Microfluidic seco-fiação e caracterização de fibras regeneradas da fibroína de seda

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables ...

Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of this compound commences from [Ru(NH3)5Cl]Cl2 in 1 M NH4OH in a closed container, yielding a green solution. Purification is accomplished with cation-exchange chromatography. This compound is characterized and verified to be pure by UV-vis and IR spectroscopy. The mitochondrial calcium uptake inhibitory properties are assessed in permeabilized HeLa cells by fluorescence spectroscopy.

A protocol for the synthesis, purification, and characterization of a ruthenium-based inhibitor of mitochondrial calcium uptake is presented. A procedure to evaluate its efficacy in permeabilized mammalian cells is demonstrated.

Síntese e avaliação de um inibidor de absorção de cálcio mitocondrial rutênio-baseado

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of ...

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control cellular functions. The reversal of DNA methylation, or DNA demethylation, is mediated by the ten-eleven translocation (TET) protein family of dioxygenases. Although it has been widely reported that aberrant DNA methylation and demethylation are associated with developmental defects and cancer, how these epigenetic changes directly contribute to the subsequent alteration in gene expression or disease progression remains unclear, largely owing to the lack of reliable tools to accurately add or remove DNA modifications in the genome at defined temporal and spatial resolution. To overcome this hurdle, we designed a split-TET2 enzyme to enable temporal control of 5-methylcytosine (5mC) oxidation and subsequent remodeling of epigenetic states in mammalian cells by simply adding chemicals. Here, we describe methods for introducing a chemical-inducible epigenome remodeling tool (CiDER), based on an engineered split-TET2 enzyme, into mammalian cells and quantifying the chemical inducible production of 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) with immunostaining, flow cytometry or a dot-blot assay. This chemical-inducible epigenome remodeling tool will find broad use in interrogating cellular systems without altering the genetic code, as well as in probing the epigenotype&#8722;phenotype relations in various biological systems.

Detailed protocols for introducing an engineered split-TET2 enzyme (CiDER) into mammalian cells for chemical inducible DNA hydroxymethylation and epigenetic remodeling are presented.