A cromatografia de exclusão de tamanho é uma abordagem útil para separar as subpopulações de vesículas bacterianas de tamanho heterogêneo e para remover ácidos nucleicos e proteínas de supernanatos bacterianos. A cromatografia de exclusão de tamanho é menos cara, mais rápida e mais reprodutível do que outras técnicas de separação, incluindo a ultracentrifugação de gradiente de densidade. Demonstramos o potencial dessa abordagem usando vesículas a.actinomycetemcomitans, mas esperamos que ela possa ser aplicada a outras populações de vesículas bacterianas de tamanho heterogêneo também.
Certifique-se de desargar adequadamente todas as soluções de tampão e contas e para pipetar a solução lentamente sem introduzir bolhas, mas rapidamente o suficiente para que as contas embalam homogêneamente sem secar. Para começar, use uma haste de vidro para misturar uma garrafa de caldo de meio de filtragem de gel e despeje o volume necessário para encher a coluna mais aproximadamente 50% de excesso em uma garrafa de vidro. Permita que as contas se resolvam e decantem o excesso de líquido.
Resuspenda as contas no buffer de elução para uma solução final de aproximadamente 70% de gel e 30% de buffer e desgas a solução sob vácuo. Monte a coluna em um suporte de anel na posição vertical e encha a coluna com tampão de eluição para molhar as paredes antes de drenar o buffer até que apenas cerca de um centímetro permaneça. Em seguida, pipete cuidadosamente as contas de gel na coluna enquanto drena simultaneamente o excesso de tampão para evitar que as contas se instalem até que a coluna seja embalada a uma altura de aproximadamente dois centímetros abaixo da parte inferior do reservatório da coluna.
Antes de carregar a amostra, desgas o tampão de eluição sob vácuo. Lave a coluna com aproximadamente duas vezes o volume da coluna de tampão de eluição. Uma vez que o buffer atinja o topo da camada de gel, adicione cuidadosamente dois mililitros de uma amostra de vesícula de membrana externa de 100 a 200 nanomolar por litro em cima da camada de gel sem perturbar a superfície e deixe a amostra entrar no gel.
Adicione lentamente o tampão de elução à coluna sem perturbar a camada de gel e coloque um tubo de 50 mililitros sob a coluna. Para evitar que a coluna seque, adicione simultaneamente o tampão de elução na parte superior da coluna. Depois de coletar 20 mililitros de elunato, coloque um rack de tubos de 1,5 mililitro sob a coluna.
Colete um total de 96 frações de um mililitro em cada tubo. Ao coletar as amostras, adicione continuamente o tampão de elução à coluna. Para limpar a coluna, execute um volume de coluna de hidróxido de sódio molar de 0,1 através da coluna seguido de dois volumes de coluna de tampão de eluição.
Para medir as concentrações lipídicas, pipeta 50 microliters de cada fração em uma placa de 96 poços. Adicione 2,5 microliters de corante lipofílico a cada poço. Após 15 segundos, meça a intensidade de floresnce.
Para medir a concentração de uma proteína de interesse, adicione 100 microlitres de cada fração em poços individuais de uma placa imunogênica ELISA. Depois de três horas a 25 graus Celsius, decante o conteúdo da placa. Lave a placa cinco vezes com 200 microliters de tampão de lavagem ELISA por lavagem decantando a placa após cada lavagem.
Adicione 200 microliters de tampão de bloqueio a cada poço para uma incubação de uma hora a 25 graus Celsius. No final da incubação, decante a placa e adicione 100 microliters de anticorpo primário no bloqueio de tampão para uma incubação noturna a quatro graus Celsius. No dia seguinte, decante a placa e lave a placa cinco vezes com tampão de lavagem ELISA como demonstrado.
Após a última lavagem, adicione 100 microliters de anticorpo secundário no tampão de lavagem ELISA a cada poço para uma incubação de uma hora a 25 graus Celsius. No final da incubação, lave a placa como demonstrado e adicione 100 microliters de solução TMB a cada poço para uma incubação de 15 a 30 minutos à temperatura ambiente. Quando uma cor azul se desenvolver, adicione 50 microliters de solução de parada a cada poço e meça a absorvância em 450 nanômetros.
Após a purificação da coluna de exclusão de tamanho de um supernatário da cultura A.actinomycetemcomitans, como demonstrado, foram observados dois picos lipídes distintos lipídios, correspondendo às grandes e pequenas vesículas de membrana externa produzidas por esta cepa. A análise ELISA das frações amostrais revelou que a toxina está associada principalmente à subpopulação de grandes vesículas de membrana externa. A análise da mancha imunoiúm doença deu resultados semelhantes, mas mais barulhentos, indicando que essa abordagem é menos sensível que a ELISA.
Como observado, esta técnica de cromatografia é capaz de remover quantidades significativas de proteínas livres das preparações das vesículas da membrana externa. No entanto, é importante notar que a concentração total de proteínas não se correlaciona necessariamente com a concentração de proteínas específicas. É importante ter muito cuidado durante a embalagem e funcionamento da coluna para evitar bolhas e evitar que a coluna seque.
Dispersão dinâmica de luz, rastreamento de partículas e bicroscopia podem ser realizadas após a cromatografia de exclusão de tamanho para determinar o tamanho e outras características das vesículas separadas da membrana externa.
