Estudar como os micróbios regulam a composição química das bicamadas individuais informará nosso conhecimento sobre mecanismos de matança de antibióticos, resistência antimicrobiana e patogênese de doenças. Esta técnica divide o envelope celular de bactérias gram-negativas em duas frações definidas sem o uso de detergente. Portanto, os lipídios, proteínas e açúcares podem ser avaliados em um ambiente semi-nativo.
Algumas das etapas são dependentes do tempo e requerem foco e coordenação. Inicialmente, use uma ou duas amostras. Quando o nível de conforto aumenta, mais amostras podem ser adicionadas.
Não mais do que seis amostras devem ser manuseadas de uma só vez. Este é um procedimento de vários dias e os pontos de verificação visuais são úteis para avaliar a eficácia e o erro. Antes de realizar isso, às vezes os passos finais.
Listrar as bactérias de estoques de glicerol congelados em placas de ágar frescos. Uma vez que as colônias se desenvolvem, armazene as placas a quatro graus Celsius. Use uma única colônia para inocular um tubo de cinco mililitros cheio de mídia de caldo e cultivar as bactérias como desejado durante a noite.
Volte diluindo a cultura bacteriana da noite para o dia em um litro da mídia de caldo preferida e incubar os frascos. Quando a densidade óptica desejada for alcançada, remova os frascos da incubadora e coloque-os no gelo. Meça a densidade óptica da cultura em 600 nanômetros e calcule o volume de cultura que equivale entre seis e oito vezes 10 a 11 unidades formadoras de colônias bacterianas.
Adicione este volume de cultura a um tubo de centrífuga e certifique-se de que as culturas restantes permaneçam no gelo até que sejam usadas. Pellule as bactérias por centrifugação por 10 minutos em um ângulo fixo, centrífuga de alta velocidade a 7.000 a 10.000 vezes G e quatro graus Celsius. Decante cuidadosamente o supernasteante e descarte-o.
Resuspenque cada pelota de célula em 12,5 mililitros de buffer A.Adicione uma barra de agitação magnética à suspensão da célula. Adicione 180 microlitres de 10 miligramas por mililitro lysozyme a cada resuspensão celular. Depois de coletar a bactéria tratada edta lysozyme por centrifugação, adicione rapidamente o inibidor de protease, cloreto de magnésio e nuclease às bactérias e ressuspenque rapidamente as células no buffer B.Stir por dois minutos, mantendo as suspensões no gelo.
Em seguida, adicione 12,5 mililitros de solução EDTA mililitro de 1,5 mililitros a cada re-suspensão celular e continue mexendo no gelo por mais sete minutos. Decante as suspensões em tubos cônicos de 15 mililitros. Centrifugar as suspensões a 9.000 a 11.000 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius.
Descarte os supernantes em um recipiente de resíduos de risco biológico e retenha as pelotas no gelo. Adicione 25 mililitros de tampão B a cada pelota de célula. Em seguida, adicione 55 microlitadores de um cloreto de magnésio molar, um microliter de reagente rnase/dnase/nuclease e um microliter de coquetel inibidor de protease.
Resuspenda as pelotas na mistura. Vigorosamente pipeta e vórtice até que as soluções pareçam homogêneas. Guarde as suspensões no gelo.
Despeje a amostra no cilindro de amostra de homogeneizador e leve a célula a 20.000 PSI. Para evitar a aerossolização de patógenos, condicionar o aparelho pressurizado no buffer B e ajustar os níveis de pressão antes de adicionar suspensão bacteriana. Engaje a célula de pressão e aludir 10 mililitros de tampão B como precaução.
Colete o lisecelular em tubos cônicos de 50 mililitros no gelo, mantendo também as amostras no gelo. Para alcançar a lise completa, repita esse processo três a cinco vezes. Para pelotar o material celular restante, intacto, centrifugar as amostras bacterianas líficas a 6.169 vezes G e quatro graus Celsius por 10 minutos.
Distribua os supernacantes que agora contêm as membranas homogeneizadas, em frascos de policarbonato para ultracentrifugação. Ultracentrificar as células lysates a 184, 500 vezes G e quatro graus Celsius por pelo menos uma hora. Descarte os supernaciantes e retenha as pelotas de membrana no gelo.
Usando um vidro, homogeneizador do Dounce, resuspenque as pelotas de membrana em um mililitro da solução de gradiente isofícnico de baixa densidade. Em seguida, use um copo, pipeta Pasteur para transferir a amostra homogeneizar para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e colocar o tubo no gelo. Para preparar o gradiente de sacarose, segure um tubo de polipropileno ou ultra-claro Open-Top em uma posição ligeiramente inclinada.
Adicione lentamente dois mililitros da solução de sacarose de maior densidade. Em seguida, adicione quatro mililitros da solução de sacarose de menor densidade. Ao preparar o gradiente de densidade, adicione a solução de sacarose lentamente para evitar misturar as camadas.
As camadas de sacarose devem ser ligeiramente visíveis e parecem geralmente definidas. Em seguida, adicione a fração total da membrana que foi anteriormente resuspended em um mililitro de baixa densidade, solução de sacarose isofícnica. Finalmente, encha o restante do tubo adicionando aproximadamente seis mililitros da solução de gradiente de sacarose isofícnica.
Ultracentrificar as amostras usando um rotor de balde balançando a 288.000 vezes G e quatro graus Celsius por 16 a 23 horas. Corte a ponta de uma ponta de pipeta P1000 a cerca de cinco mililitros do ponto. Depois que a centrifugação estiver completa, use a pipeta para remover a camada superior e marrom do tubo.
Transfira esta camada, que contém a fração interna da membrana, para um frasco de policarbonato para ultracentrifugação. Deixe cerca de dois mililitros da solução de sacarose acima da interface entre a sacarose de 53% e a sacarose de 73% para garantir que a fração de membrana externa mais baixa, branca e externa não conflite a fração da membrana interna. Novamente usando uma ponta de pipeta P1000 com a extremidade removida, remova a camada externa da membrana e transfira-a para um frasco de policarbonato.
Encha o vazio restante do frasco de policarbonato com tampão de armazenamento de membrana isolado e misture por inversão ou pippetting. Retenha as amostras no gelo. Para coletar as membranas, ultracentrize as garrafas de policarbonato a 184, 500 vezes G e quatro graus Celsius por uma hora.
Por fim, descarte os supernacantes e adicione 500 a 1.000 microliters de buffer de armazenamento. Resuspend as membranas pela homogeneização de Dounce. Colete as amostras em dois tubos de microcentrífuga mililitro.
As pelotas de membrana total foram raspadas, Dounce homogeneizada e ultracentrifada sobre gradientes de densidade de sacarose para separar as membranas internas e externas. Um gradiente de densidade de sacarose de 20%53%73% foi suficiente para particionar algumas cepas bacterianas. Mas não para particionar A.baumannii que foi particionado com sucesso usando um gradiente de 20%45%73%.
Para avaliar a eficiência da separação, foram testadas amostras de membrana para desidrogenase NADH, enzima localizada na membrana interna bacteriana. Uma diminuição da densidade óptica em 340 nanômetros indicou a presença da enzima. A densidade óptica foi medida para 50 amostras de microgramas de frações de membrana interna e externa do tipo selvagem S.typhimurium, E.coli K12 DH5a e galE mutante S.typhimurium.
Uma maior concentração de proteína foi adicionada ao avaliar a pureza das frações de membrana A.baumannii porque um ensaio inicial usando 50 microgramas sugeriu que os níveis relativos de desidrogenase NADH eram menores para A.baumannii do que para as outras cepas bacterianas. Para avaliar a contaminação cruzada das frações de membrana interna com frações de membrana externa, foram extraídos e visualizados LPS e LOS. Os extratos foram carregados em um gel de poliacrilamida e manchados com Pro-Q Emerald 300.
Acinetobacter baumannii é uma prioridade máxima, multi-resistente a medicamentos, patógeno humano. Este protocolo deve auxiliar os pesquisadores na compreensão dos papéis de lipooligosacarídeos, fosfolipídios e lipoproteínas nos mecanismos de resistência e virulência deste patógeno único e importante. Este método é ideal para a análise a jusante de fosfolipídios, glicolipídios carboidratos, proteínas e pequenas moléculas que normalmente existem dentro das membranas duplas de bactérias gram-negativas.
