Este trabalho foi financiado pela Fundação Bill e Melinda Gates (projeto PneuCarriage, Grant 52099) e Programa de Apoio à Infra-Estrutura Operacional do Governo de Victoria. Graças à Eileen Dunne, Janet Strachan, e Kim Hare para a leitura crítica do manuscrito.

1. Preparação da suspensão de células para digitação <ol><li> Usando um circuito descartável 1 ml estéril, dê uma pequena varredura de fresco durante a noite pura cultura de pneumococos cultivadas em ágar sangue de cavalo não seletivo sólida e inocular 100 mL Heart Infusion (HI) caldo. A suspensão deve aparecer para ser apenas visivelmente turva. Agite suavemente o tubo para emulsionar. Nota: Outras mídias, como caldo Brain Heart Infusion também podem ser adequados. A adição de soro (por exemplo, uma concentração final de 10% (v / v) de soro de cavalo) e incubação a 37 ° C durante aproximadamente 1 hora antes da utilização pode ser usado para aumentar a reacção. </li></ol> 2. Verificando densidade de suspensão celular A suspensão de células, preparado no passo 1.1, também irá ser utilizada como controlo negativo, e deve ser verificada a densidade de células antes da adição de soros de digitação. <ol><li> Utilizando um ciclo de 1 ml, transferem uma gota de inoculo, preparado no passo 1.1 para um coposlides s microscópio. </li><li> Utilizando um par de pinças, colocar uma pequena lamela circular sobre a suspensão. </li><li> Usando o ajuste de contraste de fase, a preparação observar microscopicamente com uma ampliação de 400x, para verificar a densidade da suspensão (Figura 1A). <ol><li> Se o inoculo é demasiado pesada (Figura 2A), adicionar mais caldo para a suspensão de células feitas no passo 1.1 para a diluir. Delicadamente misture novamente. </li><li> Se o inóculo é muito leve, por exemplo, existem &lt;50 células visíveis no campo microscópico (Figura 2B), adicionar mais bactérias para a preparação da suspensão de células feitas no passo 1.1 e misturar suavemente. Nota: Com a experiência, a densidade da suspensão de células pode ser julgada pelo tremendo e segurando-se para a luz, onde ele deve aparecer para ser apenas visivelmente turva. </li></ol></li><li> Repita os passos 2,1-2,3 até que um número adequado de células estão disponíveis no campo do microscópio. Nota: lâminas de vidro e coverslips apresentar um risco de farelos. Após o uso, lâminas e lamínulas estão contaminados com material infeccioso e deve ser descartado em um recipiente biohazard farelos. </li></ol> 3. Datilografia <ol><li> Transferir ~ 1 ul do inoculo preparado (por exemplo, utilizando um ciclo de pi 1) sobre a lâmina de vidro de microscópio. Descarte o loop para o recipiente biohazard farelos. </li><li> Adicionar um volume igual (1 ml ansa cheia) de temperatura ambiente anti-soro para o slide e misturar os dois cai bem com o loop. </li><li> Usando um par de fórceps, coloque uma pequena lamela circular sobre a suspensão, tomando cuidado para não tocar a queda. Coloque a lamela sobre a suspensão imediatamente após a adição de anti-soros para impedir o líquido no diapositivo de secar. </li><li> Usando um microscópio, observe a suspensão nos termos de contraste de fase com aumento de 400X. Uma reacção negativa Quellung é observada quando pouco ou nenhum &quot;inchaço&quot; das células de pneumococos pode ser visto em 40Ampliação 0X, semelhante ao que é observado na suspensão de células de pneumococo, com anti-soros não adicionado (controlo negativo). Observou-se uma reacção positiva Quellung quando as células parecem alargada ou &quot;inchado&quot; e mais visível quando comparado com as células do controlo negativo. Nota: As reacções ambíguos devem ser investigada, por exemplo, examinando a reacção após 5-10 min de incubação à temperatura ambiente, ou por repetição da reacção com mais soro. </li><li> Conduzir sorotipagem pneumocócica com testes sucessivos de piscinas anti-soros individuais até uma reação positiva é observada. Alternativamente, piscinas pode ser aplicado em &#39;rodadas&#39;, dependendo da incidência local dos sorotipos. Nota: Testes em &#39;rodadas&#39; garante que as piscinas que contêm anticorpos para os sorotipos mais comuns são testados primeiro, minimizando o esforço e custo. Teste simultâneo de várias piscinas também fornece controles negativos adicionais, o que pode ser útil em interpretation. Se todas as piscinas em um &#39;round&#39; em particular são negativos, testar o isolado com rodadas subseqüentes de piscinas. </li><li> Testar o isolado usando o apropriado tipo ou grupo de soro contida na piscina reactivo. Se for o caso, use fator anti-soros para diferenciar ainda mais o sorotipo. Nota: Chaves para o anti-soros pneumocócica fornecidos pelo fabricante são usados ​​na seleção de piscina adequada, tipo, grupo ou fator anti-soros e interpretação dos resultados (incluindo quaisquer reações cruzadas). </li><li> Se os resultados negativos são obtidos com todas as piscinas, testar o isolado com reagente Omniserum (contém anticorpos contra 91 sorotipos 21). Se uma reacção positiva Quellung ainda não se observa ao testar uma pneumocócica isolar com o reagente omniserum, isto pode ser porque o isolado está expressando pouca ou nenhuma cápsula, ou que os anticorpos contra o serotipo não estão representados na omniserum. Esta última categoria pode incluir novos sorotipos. </li> &lt;/ Ol&gt;

<ol>
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Os autores não têm nada a revelar.

Um passo essencial na presente técnica é garantir uma cultura pura é usado para preparar a suspensão, juntamente com a adição de um número adequado de células bacterianas para o caldo. Deve notar-se que o crescimento da colónia e morfologia em placas de agar varia entre os diferentes isolados de pneumococos. Alguns produzem colônias seca e áspera, o que pode ser difícil de apanhar com um laço e não emulsionar bem no caldo. Por este motivo, uma varredura maior de bactérias pode ser requerida quando se prepara a suspensão de células. Em qualquer dos casos, é imperativo que as células individuais e não agregados, são evidentes no controlo negativo assim o seu tamanho relativo pode ser comparado com as células com anti-soro adicionado. Para além disso, muitas células bacterianas podem resultar numa reacção de falso negativo, onde um excesso de antigénio capsular podem inibir a reacção de Quellung 10. Por esta razão, é importante criar uma suspensão de bactérias com uma densidade de células adequada (Figura 1). A suspensão pode ser preservado por vários meses com a adição de algumas gotas de formol concentrado. Isso permite que os ensaios de lote mais fácil e também esteriliza o caldo reduzir o risco de infecções adquiridas em laboratório, embora isso deve ser pesado contra o risco de segurança de lidar com formol, que é tóxico, corrosivo, cancerígenas, sensibilizando e inflamável. Além disso, observou-se que alguns isolados mostram reacções fracas na presença de formalina (dados não mostrados). Reacções Quellung são examinados usando um microscópio. A utilização de contraste de fase aumenta a visibilidade da cápsula. Em alguns laboratórios, a reação é visto usando de imersão em óleo a 1.000 ampliação X 14, 16. Além disso, alguns laboratórios utilizam uma mancha contador (azul de metileno), para aumentar ainda mais a visibilidade de uma reacção positiva 10, 16, 22. O método aqui apresentado é visto sem óleo-immersion e sob aumento de 400X 15, 17. Este método é rápido, simples e relativamente fácil de ler 23. É importante manter bons procedimentos de controle interno de qualidade para garantir que os procedimentos de anti-soros, testes estão em ordem. A participação em um programa de garantia de qualidade externa é muitas vezes benéfico. Uma das principais limitações da reacção de Quellung para serotipagem de pneumococos é o elevado custo dos anti-soros é necessária. No entanto, este é minimizado no protocolo de cima, devido à pequena quantidade de anti-soro utilizado para cada reacção. Vários outros métodos têm sido descritos para serotipagem de pneumococos 23, 24. No entanto, Quellung continua sendo o padrão ouro eo desenvolvimento de novos métodos requer padronização contra a reação Quellung 23. Utilizando anti-soro apropriado, a reacção de Quellung, também pode ser utilizado para identificar e tipo de outros tampõesule bactérias produtoras 25. A reação Quellung é fundamental para a caracterização de sorotipos de pneumococo atuais e emergentes, bem como a prestação de informações sobre a eficácia da vacina e do impacto a longo prazo da vacinação no transporte e na doença.

Streptococcus pneumoniae (pneumococo) é responsável pela morte de cerca de 800 mil crianças menores de cinco anos de idade, anualmente, com o fardo da doença caindo predominantemente em países com poucos recursos 1. Doenças pneumocócicas variar em gravidade de infecções localizadas, como a otite média aguda a infecções fatais graves, como septicemia, meningite e pneumonia 2. Mais de 90 serótipos capsulares de pneumococos têm sido descritas 3, 4. Vacinas pneumocócicas actuais proporcionam protecção contra os serótipos que são responsáveis ​​pela maioria das doenças invasivas 5, 6. No entanto, o uso difundido de vacinas tem sido associada com a substituição de serotipos incluídos na vacina por serotipos não vacinais, tanto na nasofaringe e doença invasiva 7, 8. Isso ressalta a importância de sorotipagem para epidemiológicavigilância e impacto da vacina a longo prazo estuda 9. O método padrão-ouro para a digitação pneumocócica é o teste de reação capsular, conhecida como a reação Quellung, descrita pela primeira vez por Neufeld, em 1902 (ver austríaco 10). Foi encontrado um elevado grau de concordância entre laboratórios, e entre a reacção de Quellung e outros métodos de sorotipagem 11-13. Existem várias variações da reacção de Quellung, 10, 14-16. O método aqui descrito não requer a utilização de um contador de manchas ou a lente de imersão em óleo, em vez disso, uma gota de amostra preparada é misturada com o soro de tipagem e examinadas imediatamente sob uma ampliação de 400X. A reacção de Quellung, é geralmente realizada usando anti-soros disponíveis comercialmente. O método descrito aqui utiliza anti-soros menos em comparação com alguns dos outros métodos 16, 17, tornando-se mais rentável. Uma vez que um isoladorComeram é identificado como um pneumococo, é sequencialmente testados com anti-soros piscinas até uma reacção positiva é observada. Cada soro piscina contém diferentes misturas de anti-soros produzidos contra 91 sorotipos de pneumococo 18. Uma vez que a piscina está estabelecido, o tipo de indivíduo e grupo anti-soros que são incluídos na associação reactiva são testados individualmente em sequência. Tipo soros geralmente reagem com um único sorotipo (por exemplo, tipo 1 soro reage com o sorotipo 1), enquanto que os anti-soros grupo reagir com todos os sorotipos de um grupo específico (por exemplo, Grupo 22 anti-soro reage com sorotipos 22F e 22A). Alguns sorotipos dentro dos grupos são mais diferenciadas com fator anti-soros (por exemplo sorotipo 22F reage com fator 22b, 22c, mas não). Neste caso o teste é continuado com todos os anti-soros factor relevante é determinada até serótipo 19, 20. A reacção de Quellung, é simples e rápida e 14 pode ser realizada em qualquer laboratory que está equipado com um microscópio de boa qualidade e um conjunto adequado de anti-soros.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1305">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pneumococcus (Neufeld) antisera</td>
			<td>SSI Diagnostica</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a> 
			Bring all antisera to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pneumococcus (Omni) antiserum</td>
			<td>SSI Diagnostica</td>
			<td>2438</td>
			<td>Bring all antisera to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Optical Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica DML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calibrated Disposable Inoculating Loops 1 &#181;l</td>
			<td>Copan</td>
			<td>CD175S01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Horse Blood Agar (HBA) plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PP2001</td>
			<td><a href="http://www.thermofisher.com.au/">http://www.thermofisher.com.au/</a> 
			Bring to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heart Infusion (HI) broth</td>
			<td>Media Preparation Unit (MPU), The University of Melbourne</td>
			<td>40HIN</td>
			<td>Bring to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass microscope slides 76 mm x 26 mm</td>
			<td>Lomb Scientific</td>
			<td>7101</td>
			<td>Sharps hazard: Dispose in a biohazard sharps container</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Circular glass coverslips</td>
			<td>NeuVitro&#160;</td>
			<td>GG-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">*Excluding the antisera, all other materials can be purchased from alternative suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;">*Plates prepared from defibranated sheep blood are suitable but blood plates prepared from citrated blood or human blood are not</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capsular serotyping of streptococcus pneumoniae using the quellung reaction

Há mais de 90 diferentes sorotipos capsulares de Streptococcus pneumoniae (pneumococo). Além de ser uma ferramenta para a compreensão da epidemiologia pneumocócica, sorotipagem capsular pode fornecer informações úteis para os estudos de eficácia da vacina e de impacto. A reação Quellung é o método padrão-ouro para pneumocócica sorotipagem capsular. O método envolve o teste de uma suspensão de células com anti-soros de pneumococos em pool e específico dirigido contra o polissacarídeo capsular. As reacções antigénio-anticorpo são observadas ao microscópio. O protocolo tem três passos principais: 1) preparação de uma suspensão de células bacterianas, 2) mistura de células e anti-soros sobre uma lâmina de vidro, e 3) a leitura da reacção de Quellung, usando um microscópio. A reacção de Quellung é razoavelmente simples de realizar e pode ser aplicada sempre que um microscópio e os anti-soros adequados estão disponíveis.

<html> Uma reacção positiva ocorre quando Quellung anticorpo específico para o tipo de liga-se a cápsula do pneumococo, levando a uma mudança no seu índice de refracção 10. Quando visto sob um microscópio, as bactérias parecem &#39;inchado&#39; e mais visível 14. Figura 1A mostra células pneumocócicas em caldo de HI. Quando anti-soro específico do tipo é adicionada à suspensão bacteriana, os pneumococos aparecer &quot;inchado&quot;, de refracção e mais arredondada (Figura 1B). Muitas células bacterianas adicionados ao caldo pode resultar em agregação de células ou de uma reacção de falso negativo. Figura 2 mostra inóculos de células em caldo de IC pneumococos que são &quot;demasiado pesado&quot; (Figura 2A) ou &quot;muito leve&quot; (Figura 2B). 08fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51208/51208fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Quellung reação negativa e positiva. Preparações de sorotipo 9V pneumocócica isolar sem soro (1A) e com o grupo de 9 anti-soro (1B), eram vistos sob aumento de 400X. Este último mostra o &#39;inchaço&#39; e arredondamento das células bacterianas, tipicamente visto em uma reação positiva Quellung. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51208/51208fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51208/51208fig2.jpg" /> Figura 2. Inóculos muito pesado e muito clara. Preparações de suspensões de células de pneumococos que são demasiado pesadas (2A) ou muito clara (2B), quando vistos sob aumento de 400X.

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Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

A reação Quellung é a técnica padrão ouro para sorotipagem Streptococcus pneumoniae. Esta técnica utiliza um microscópio e anti-soros específicos pneumocócica e é comumente usado em referência e laboratórios de pesquisa em todo o mundo.

A sorotipagem capsular de<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Usando o Reaction Quellung

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

capsular-serotyping-streptococcus-pneumoniae-using-quellung

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

45.2K visualizações.  Murdoch Childrens Research Institute.  A reação Quellung é a técnica padrão ouro para sorotipagem Streptococcus pneumoniae. Esta técnica utiliza um microscópio e anti-soros específicos pneumocócica e é comumente usado em referência e laboratórios de pesquisa em todo o mundo. 