O objetivo geral deste procedimento é produzir uma vacina glicoconjugate homogênea, combinando incorporação de aminoácidos não canônicos e click-química. A expansão do código genético é uma ferramenta poderosa para incorporar aminoácidos não naturais em proteínas para modificar suas características, estudar ou criar novas funções proteicas, ou ter acesso a conjugados proteicos. Um método de supressão de códons emergiu como o método mais popular para incorporar aminoácidos não naturais em diferentes posições.
Esta metodologia será aqui aplicada à produção de um portador de proteínas contendo um aminoácido não natural que abriga um grupo funcional bioortogonal. Esta alça reativa pode ser usada em seguida para enxertar especificamente e eficientemente um oligossacarídeo sintético hapten para fornecer uma vacina glicoconjugate homogênea. A propargyl-lysine, PrK, é sintetizada em duas etapas do comercial Boc-lysine.
No primeiro passo, o grupo amino desprotegido da Boc-lysine é convertido em cloroformato propargino. Em um segundo passo, o grupo alfa amino é des protegido. Para sintetizar o N(alfa)Boc-propargyl-lysine, primeiro dissolva 500 miligramas de Boc-lisina na mistura de cinco mililitros de naOH molar aquoso e cinco mililitros de THF em um frasco e encaixe o frasco com um septo de silício.
Esfrie o frasco em um banho de gelo e espere o pó ser dissolvido. Em seguida, adicione a gota de clorofórmio propargyl durante um período de dois a três minutos em agitação. Aqueça a mistura de reação à temperatura ambiente e continue a agitação por 10 horas.
Esfrie as soluções de éter dietil, ácido hidrocrídrico molar e acetato etílico. Esfrie a mistura de reação bruta em um banho de gelo. Despeje a mistura em um funil separador.
Extrair uma mistura com cinquenta mililitros de éter dietil. A extração pode resultar em um acúmulo de pressão, certifique-se de liberar qualquer acúmulo de pressão com frequência. Colete a fase aquosa e descarte a camada orgânica.
Adicione cautelosamente, cinquenta mililitros de um ácido clorídrico molar à fase aquosa no funil de separação. Em seguida, extraia a camada aquosa duas vezes usando trinta mililitros de acetato etílico. Colete a fase orgânica, Verifique a presença do seu composto pelo TLC.
Nesta fase, deve estar em fase orgânica. Seque as camadas orgânicas combinadas sobre sulfato de magnésio. Filtrar a fase sólida.
E concentre o filtrado sob pressão reduzida em um evaporador rotativo. Dissolver a amostra do n(alfa)Boc-propargyl-lysine em clorofórmio desuterado e controlar sua identidade pela RMN. Para sintetizar o propargyl-L-lysine, introduza o N(alfa)Boc-propargyl-lysine em um frasco de botão redondo equipado com um septo.
Adicione quatro mililitros de diclorometano anidra no frasco sob argônio. Adicione em termos de gota, quatro mililitros de ácido trifluoroacético em agitação. Substitua o septo de silício por uma tampa de vidro para evitar que o TFA danifique o septo de silício.
Mexa a mistura de reação por uma hora em temperatura ambiente. Verifique a desproteção do Boc-PrK pelo TLC. Concentre a mistura de reação sob pressão reduzida.
Adicione éter dietil ao resíduo bruto. Filtre a propargyl-L-lysine na forma de um sólido branco em um vidro frito. Dissolver uma alíquota da propargyl-L-lisina em óxido de deutério e, em seguida, realizar análises de RMN para controlar sua identidade e pureza.
Propargyl-L-lysine é então dissolvida em água destilada na concentração final de cem mililitros e armazenado a menos 20 graus em uma alíquota mililitro. Para co-transformar plasmídeos na tensão de expressão, descongele uma alíquota de cem microliters de E.Coli BL21 quimicamente competente no gelo durante cinco minutos. Adicione um microliter de cada plasmídeo ou 50 a 100 nanogramas de cada um nas células e incuba-os por 30 minutos no gelo.
Incubar as células competentes a 42 graus, durante 45 segundos. Então, coloque-os de volta no gelo por dois minutos. Adicione 900 microliters de meio LB e incubar sob agitação por uma hora a 37 graus para permitir a expressão de antibióticos.
Em seguida, aplauque as bactérias transformadas em ágar LB com antibióticos. Permita que as bactérias cresçam durante a noite a 37 graus. Para expressar proteínas modificadas com PrK, inocular uma única colônia co-transformada em cinco mililitros de meio LB com antibióticos.
Incubar durante a noite a 37 graus com agitação. No dia seguinte, diluir com os cinco mililitros da cultura primária em quinhentos mililitros de meio de autoindução contendo antibióticos, 0,02% de L-arabinose, e um milimilitro de PrK e incubar a 37 graus por 24 horas sob agitação. Inclua um controle negativo realizando a cultura sem PrK e o controle positivo realizando a cultura de um clone contendo o gene proteico do tipo selvagem.
Colher células da cultura da noite para o dia por centrifugação a 5.000 x g durante 10 minutos. Descarte o supernasce e congele a pelota a menos 20 graus. Para a purificação da proteína por cromatografia de afinidade fluxo-banco de gravidade, resuspende as pelotas celulares em vinte mililitros de tampão de lise.
Adicione DNase I e lysozyme, e permita a lise incubando a suspensão a 37 graus durante 30 minutos. Sonicar as células no gelo durante cinco minutos, em seguida, remover os detritos celulares por centrifugação a 20.000 x g durante 30 minutos. Filtrar o lise com filtro de 0,45 micrômetro Adicionar resina Ni-NTA à suspensão.
Misturado suavemente a quatro graus por uma hora. Despeje a suspensão em uma coluna de polipropileno e colete a fração não ligada. Lave a resina com dez mililitros e depois cinco mililitros de tampão de lavagem.
Pegue as frações de lavagem. Elute a proteína sua marcada com um milímetro de tampão de elução e repita esta etapa quatro vezes e colete todas as frações adicionais. Combine as frações que contêm proteínas puras marcadas por histidina e diálise em um litro de tampão de protease TEV durante a noite usando membrana de diálise.
Colete a amostra de proteína em um tubo de 50 mililitros e adicione tampão TEV para obter uma concentração final de dois miligramas por mililitro em um volume final de um mililitro. Adicione cem microliters de protease TEV. Adicione 50 microliters de 0,1 molar DTT.
Completo com tampão TEV de até cinco mililitros. Incubar durante a noite a quatro graus, com agitação lenta. Para remover o EDTA, diálise a proteína a quatro graus durante a noite usando membrana de diálise e tampão fosfato com imidazol de cinco milimolar.
Para eliminar a protease TEV e proteínas não digeridas, incubar a mistura com contas Ni-NTA e misturar suavemente por uma hora a quatro graus. Despeje a suspensão em uma coluna de polipropileno. Coletou a fração desvinculada.
A protease TEV e proteínas não digeridas permanecem ligadas às contas e a proteína digerida é eluida. Lave a coluna com cinco mililitros de tampão de lavagem e colete as frações de lavagem também. Dique a proteína digerida contra um litro de tampão de clique a quatro graus durante a noite com membrana de diálise para remover imidazol, bem como para trocar o buffer.
E medir a concentração da proteína em 280 nanômetros. Para conjugar o mPsaA com 6-hexachloro-fluoresceína-azide, ou um antígeno de carboidrato funcionalizado por antídoto, coloque a proteína mutada PrK em uma concentração de 57,8 micromolar em um micro tubo de dois mililitros. Adicione 10 microliters de cinco compostos de azida milimiliar, em seguida, adicione uma pré-mistura de solução de sulfato de cobre e THPTA.
Adicione cloridrato de aminoguanidina. Adicione solução aquosa de sódio extemporâneamente preparada. Feche o tubo, misture invertendo várias vezes e incubar à temperatura ambiente por duas horas.
Pare a reação adicionando EDTA. Verifique a conjugação na página da SDS. Após a migração, visualize o gel na luz UV a 312 nanômetros para a conjugação com fluoresceína.
Ou manche o gel com Coomassie Blue para visualizar o conjugado com o antígeno de carboidratos. Como a adição do hapten deve induzir uma mudança de peso molecular. Purifique o glicoconjugado aplicando-o a uma coluna de filtragem de gel equilibrada com PBS.
Recolher as frações que contêm os glicoconjugados. Para armazenamento prolongado, dilante o glicoconjugado contra a água destilada, em seguida, congele-se e armazene o glicoconjugado a menos 80 graus. O PrK foi introduzido na posição 32 em substituição de uma lise perto do N-terminus do PsaA.
A eficácia da produção de mPsaA foi verificada pela página da SDS e pela análise de manchas ocidentais usando anticorpo anti-histidina tag. A presença de uma proteína de comprimento total indica fortemente a incorporação bem sucedida do PrK. A intensidade é, no entanto, menor do que a observada para mPsaA tipo selvagem.
O mPsaA(K32PrK) foi purificado em contas Ni-NTA. Com um rendimento típico de oito miligramas e a incorporação do resíduo prk foi finalmente confirmada pela espectrometria de massa. A etiqueta Histidine foi removida em cima do decote proteolítico usando o protease TEV.
Tendo o mPsaA (K32PrK) a reatividade da alkyne foi avaliada por meio de uma fluoresceína funcionalizada azido e ainda utilizada para conjugar um antígeno de oligossacarídeo sintético. Os experimentos foram feitos em comparação com o MPsaA do tipo selvagem como controle. Finalmente, o glicoconjugado foi purificado pela filtragem de gel e sua identidade confirmada pela espectrometria de massa.
Neste projeto, vacinas glicoconjugar homogêneas foram preparadas usando a tecnologia de supressão de códon de parada âmbar para incorporar um aminoácido não natural em locais definidos. A homogeneidade da vacina glicoconjugate é um critério importante para garantir a caracterização física-química completa. E assim, satisfazendo cada vez mais recomendações de agências farmacêuticas exigentes.
Este critério não está satisfeito com o uso do método clássico de pura conjugação. Além disso, este protocolo permite afinar finamente a estrutura da vacina glicoconjugate. Dando origem a uma ferramenta sem precedentes para estudar a relação entre a homogeneidade e a estrutura de um glicoconjugado.
