O ensaio da neurosfera é útil na técnica in vitro para estudar as propriedades inerentes das células neurais tronco/progenitor, incluindo proliferação, autoconexão e multipotência no contexto fisiológico e patológico. Devido à sua estrutura tridimensional, esta técnica é uma poderosa ferramenta para estudar neurogênese adulta. Também é útil para acultura e obtenção de maiores rendimentos de células-tronco/progenitoras neurais.
Este ensaio da neurosfera pode ser aplicado ao estudo de distúrbios cerebrais como Alzheimer e Doenças de Parkinson ou esclerose múltipla. Neuroesferas também podem ser obtidas de outras regiões cerebrais ou sistemas, como tecido adiposo ou intestino. Demonstrando o procedimento com Filipa Ribeiro será Rita Soares, doutoranda do meu grupo.
Para colher o dia pós-natal de um a três cérebros de camundongos, segure a parte ventral do corpo na base da cabeça e use uma pequena tesoura pontiaguda para fazer uma incisão midline na pele sobre toda a extensão da cabeça para expor o crânio. Faça uma incisão longitudinal na base do crânio e continue cortando ao longo da sutura sagital em um ângulo raso possível para evitar danificar as estruturas cerebrais. Use fórceps curvos para descascar o crânio para os lados para expor o cérebro e deslizar uma pequena espátula sob o cérebro para cortar os nervos cranianos e vasos sanguíneos que estão conectados à base do cérebro.
Coloque o cérebro em uma placa de Petri de HBSS frio suplementado com antibióticos e coloque a placa sob um microscópio dissecando em baixa ampliação. Posicione o cérebro em sua superfície dorsal. Enquanto segura o cérebro pelo cerebelo, use fórceps finos para remover meninges do lado ventral do cérebro e das lâmpadas olfativas.
Gire o cérebro para o aspecto ventral e retire o resto das meninges. Em seguida, use os fórceps para remover o cerebelo e use fórceps pontiagudos curvos para transferir o cérebro para um pedaço de papel filtro com um poro de 11 micrômetros em cima de um helicóptero de tecido. Para microdisseção SVZ e DG, comece cortando o cérebro em seções coronais de 450 micrômetros.
Use uma lâmina molhada para coletar o cérebro seccionado em uma nova placa de Petri cheia de HBSS suplementado com antibiótico frio sob um microscópio dissecando e use fórceps para separar fatias coronais de forma anterior a posterior até que as fatias com os ventrículos laterais sejam alcançadas. Use fórceps finos para cortar a fina camada dos tecidos ao redor da parede lateral dos ventrículos, excluindo o parenchyma estrital e o caloso corpus e coloque uma ponta dos fórceps imediatamente sob o caloso corpus e a outra no tecido imediatamente adjacente à área ventral do ventrículo lateral para isolar o SVZ. Corte uma pequena linha de tecidos ao redor do ventrículo lateral e colete o tecido dissecado em um tubo de amostra contendo solução hbss suplementada.
Quando todas as fatias tiverem sido microdissectadas com fórceps e formação hipocampal foi atingida, descarte a primeira fatia com hipocampo em que o DG ainda é irreconhecível. Para remover o DG, primeiro isole o hipocampo das fatias e refoque o microscópio para visualizar as bordas ao redor do DG. Para colher o DG, utilize fórceps para fazer um corte entre a região de DG e CA1 seguido de um corte vertical entre a região do DG e CA3. Em seguida, remova a fimbria e qualquer tecido adjacente e coloque o tecido colhido em tubo separado de solução HBSS suplementada com antibióticos.
Para dissociar as amostras de SVZ e DG, adicione Trypsin-EDTA 0,05% a uma concentração final de 5-10% de Trypsin-EDTA 0,05% em HBSS a cada tubo para uma incubação de aproximadamente 50 minutos a 37 graus Celsius. Todo o uso de trippsina ou tempo de incubação muito longo pode levar ao aumento da morte celular, impactando negativamente o crescimento celular. Quando o tecido se agrupar, substitua a solução enzimática por quatro lavagens consecutivas por um mililitro de HBSS fresco suplementado por lavagem.
Após a última lavagem, resuspenda os tecidos digeridos em um mililitro de meio livre de soro suplementado com 10 nanogramas por mililitro de fator de crescimento epidérmico e cinco nanogramas por mililitro de fator de crescimento do fibroblasto básico por tubo. Em seguida, dissociar mecanicamente os tecidos com tubos suaves de sete a dez vezes com um tubo P1000 até que uma solução celular homogênea tenha sido obtida. Para determinar a densidade da célula DG ou SVG dissociada, conte as células em cada suspensão em um hematócito.
Para expandir as células em neuroesferas, diluir as populações celulares individuais em duas vezes dez para as quatro células por densidade mililitro em meio livre de soro complementado com fatores de crescimento e sementes cinco mililitros da suspensão celular em placas de Petri de 60 milímetros de diâmetro não revestidas. Em seguida, incubar as células SVZ por seis a oito dias e as células DG por 10 a 12 dias a 37 graus Celsius para formação da neurosfera primária. Quando a maioria das neurosferas tem de 150 a 200 micrômetros de diâmetro, colhe a suspensão celular das culturas e coleta as neuroferas por centrifugação.
Resuspenque a palete neurofera com um kit de dissociação química do rato de acordo com as instruções do fabricante antes de coletar as células com outra centrifugação. Substitua o supernasal por um mililitro de meio livre de soro suplementado com fatores de crescimento e tente suavemente classificar a pelota cerca de 10 vezes. Conte as células neurológicas dissociadas como demonstrado e reseed as células em duas vezes 10 para as quatro células por densidade mililitro em meio livre de soro complementado com fatores de crescimento em novas placas de Petri de 60 mililitros.
Em seguida, devolva a célula à incubadora de cultura celular por mais seis a oito ou 10 a 12 dias, conforme apropriado para obter neuroesferas secundárias. As neuroesferas SVG e DG obtidas pelo uso do ensaio da neurosfera são compostas de células positivas e nestinas positivas. Notavelmente, as neurosferas derivadas do SVG têm dimensões maiores do que suas contrapartes DG.
É importante ressaltar que, sob condições de diferenciação, as células tronco/progenitora neural derivadas do SVG e DG migram para fora das neurosferas, formando um pseudomonolar de células. Em ambas as regiões neurogênicas, é possível observar a presença de Sox2 duplo positivo, nestin duplo positivo, duplacortina duplamente negativa pares de células correspondentes a divisões simétricas indicativas de auto-renovação. Pares celulares em que uma célula de Sox2 positivo, nestin positivo, e doublecortin negativo, e a outra célula Sox2 negativo, nestin negativo, e doublecortin positivo demonstrando divisões assimétricas.
E Sox2 duplo negativo, nestin duplo negativo, e duplacortina duplas pares de células positivas correspondentes a divisões simétricas indicativos de diferenciação. No geral, a aprovação altera a taxa de mortalidade celular no segundo dia in vitro. A neuritogênese pode ser avaliada em neurônios obtidos a partir da diferenciação das células-tronco/progenitoras neurais SVG e DG no início da diferenciação.
Como observado, o comprimento e ramificação dos neurites aumenta com diferenciação. Uma alta porcentagem de células proliferativas é observada em SVG em comparação com dG. Embora a porcentagem de progenitores proliferadores que se diferenciam em neurônios maduros seja semelhante em ambos os nichos neurogênicos. Ambos os tipos de células também são capazes de se diferenciar em neurônios imaturos, nêutrons maduros, células precursoras de oligodendrocytes, oligodendrocitos maduros e astrócitos.
Após a obtenção das neuroesferas, vários métodos, incluindo imunocitoquímica, imagem de cálcio, manchas ocidentais e RT-PCR podem ser realizados para estudar a hasteza e a multipotência das células tronco/progenitores neurais. O ensaio da neurosfera pode ser aplicado a modelos genéticos e de doenças para avaliar melhor os processos moleculares e celulares envolvidos tanto na proliferação quanto na diferenciação de células tronco/progenitores neurais.
