O objetivo deste protocolo de vídeo é estabelecer um protocolo de origem e eficiente para o isolamento e cultura das células-tronco neurais do rato embrionário. Olá, sou Maryam Sadeghi-Zadeh. Sou um estudante de mestrado em Biologia Celular e Molecular no Instituto Royan.
Hoje eu e meu colega queremos mostrar como colher células-tronco neurais de 13 eminência gangliônica de camundongos embriões. Olá, eu sou Bahareh Alizadeh-Shoorjestan. Sou um estudante de mestrado em Biologia Celular e Molecular no Departamento de Células-Tronco do Instituto Royan de Biotecnologia.
Olá, eu sou Reza Dehghani-Varnamkhasti. Também estou estudando Biologia Celular e Molecular no Instituto Royan. Os procedimentos cirúrgicos incluem a colheita de cada 13 embriões de camundongos a partir do útero.
Cortando a frente do fontanel do embrião com uma ponta de agulha dobrada extraindo o cérebro do crânio. Micro-dissecção do cérebro isolado para colher a eminência gangliônica. Dissociação do tecido colhido em um meio de células-tronco neurais para ganhar uma única suspensão celular.
E, finalmente, células de revestimento em uma cultura de suspensão para gerar células nervosas. Limpe e desinfeta a pele da área do abdômen pulverizando com 70% de etanol. Controle a pele para cima do abdômen e, em seguida, corte a pele e sublinhado facial com tesoura para descobrir cavidade abdominal e chifres uterinos.
Remova os chifres uterinos contendo os embriões por tesoura e transfira-os para um tubo cônico de 50 ml contendo 25 ml de tampão HEPES MEM frio. Coloque o tubo cônico sob a coifa de fluxo laminal. Abra a tampa debaixo do capô.
Retire os chifres uterinos do tubo e enxágue três vezes com volume suficiente do tampão HEPES MEM fresco para eliminar detritos e sangue. Transfira o tecido uterino para uma placa de petri de 10 cm contendo tampão HEPES MEM frio de 7 a 10 ml. Abra os chifres uterinos usando uma tesoura fina e transfira embriões para um novo prato contendo 7 a 10 ml de tampão HEPES MEM frio.
Agora coloque o prato de 10 cm com embriões sob o microscópio dissecando para operação de micro-dissecção. Dobre a ponta de uma agulha de seringa empurrando sua ponta em uma alça de lâmina de bisturi de aço. Dobre a ponta da agulha até que a ponta esteja dobrada em um ângulo de 70 a 90 graus.
Verifique a ponta da agulha sob o microscópio de dissecação para ver a curva na ponta da agulha. Naturalmente embriões têm uma posição lateral nisso. Sem mudar de posição, segurou o pescoço e o corpo do embrião com fórceps finos e, em seguida, inserir a parte dobrada da agulha profundamente na frente do fontanel da cabeça do embrião.
Haveria um pequeno sangramento ou um coágulo de sangue lá. Mova a ponta da agulha superficialmente enquanto a parte torta está dentro da protuberância em direção à testa e, em seguida, em direção à parte de trás da cabeça. Certifique-se de cortar a pele e o crânio, e não danificar o cérebro subjacente.
Empurre a pele com a ponta da agulha lateralmente para descobrir o cérebro. Insira a agulha do lado lateral da pele para o lado inferior da estrutura do lado lateral da pele à área abaixo do cérebro. E então remova o cérebro deste couro cabeludo empurrando-o para sair do crânio dissecado.
A eminência gangliônica é claramente mostrada em vídeo com suas partes medial e lateral. Manteve o cérebro estável usando as fórceps de cuidado e, em seguida, usando microscissores para cortar o córtex de cada hemisfério para expor a eminência gangliônica. Segurou o cérebro e o lugar dissecado eminência gangliônica no tubo de centrífugas de 15 ml contendo mídia neural de células-tronco.
Repita este procedimento até que todo o cérebro tenha sido micro-dissecado. Corte dissecando eminência gangliônica colocando a ponta de pipeta contra a parte inferior do tubo e pipeta a suspensão para cima e para baixo por 25 vezes para quebrar o tecido para obter uma única suspensão celular. Centrifugar a suspensão a 110 g por 5 minutos.
Remova o supernasce e resuspense as células em 1 ml de tubo de 0,05% em EDTA. Incubar a suspensão celular em 37 graus Celsius por 10 minutos. E, em seguida, adicionar um volume equivalente de inibidor de trippsina de soja para parar a atividade de trippsina.
Pipeta a suspensão da célula para cima e para baixo para ter certeza de que a trippsina foi totalmente inativada. Centrifugar a suspensão da célula a 110 g por 5 minutos. Remova o supernasce e resuspense as células em 1 ml de meio completo de células-tronco neurais e conte o número de células.
Plaque as células no meio de células-tronco neurais no frasco de cultura tecidual de tamanho adequado. Transfira 5 ml de 2T25, 20 ml para T75 e 40 ml para frascos T175. Neuroesferas aparecerão após 3 dias de cultura a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com 5%de CO2.
Para sugar a cultura das neurosferas, transfira o meio com neuroesferas suspensas para a centrífuga para centrífuga a 110 g por 5 minutos, e depois descarte o sobrenante. A 1 ml de 0,05% trypsin EDTA e incubar a 37 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, inativar a trippsina usando inibidor de tyrpsina de soja e pipeta as neuroferas suavemente para cima e para baixo para torná-las células únicas.
Centrifugar a suspensão da célula a 110 g por 5 minutos. Descarte o supernasce e resuspenque as células em 1 ml de células-tronco neurais médias. Essas células estão prontas para o próximo passo cultura ou cultura em superfície laminada e totalmente revestida para experimentos avançados.
Ao cultivar um milhão de células-tronco neurais primárias após sete dias, o número de células aumentará para três a quatro milhões. Após seis a sete dias, as esferas devem medir entre 150 a 200 micrômetros de diâmetro e estarão prontas para subcultura em pratos revestidos de poli ornitina laminados na ausência de bFGF e EGF para diferenciação neuronal. Os resultados do ensaio de citometria de fluxo mostram que cerca de 95% das células que constituem as neurosferas eram Nestin positivo, que é um marcador conhecido para células-tronco neurais.
Ensaios usando anticorpos de proteína beta tubulina III e ganglio fibroso revelam que, cultivando células-tronco neurais na superfície revestida cerca de 94% mostraram fenótipo neuronal e cerca de 5% mostram fenótipo gliano. Apenas neste curto vídeo uma técnica de laboratório para o rápido isolamento de células-tronco neurais de 13 eminência gangliônica de embrião de camundongos. Espero que tenha sucesso em sua cultura de células-tronco neurais.
