Figuras 1 e 2 foram previamente publicados em Livre Radical Biology &amp; Medicine (Queliconi et al. 5) e têm direitos de autor detidos por Elsevier. Este trabalho foi apoiado pelo Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), o Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Processos Redox los Biomedicina, o Núcleo de Apoio à Pesquisa de Processos Redox los Biomedicina, USPHS NS064945 (KN) e USPHS GM087483 (KN ). Churrasco é um estudante de doutorado apoiado por uma bolsa FAPESP.

1. C. Crescimento elegans <ol><li> Prepare 35 milímetros Nematode Crescimento Mídia (NGM) placas de ágar semeado com OP50 bactérias, como por métodos de cultivo padrão 1. </li><li> Sincronizar C. elegans, colocando 6 adultos grávidas em uma placa NGM semeado. Retire os adultos após ~ 100 ovos foram estabelecidas (~ hr 3). </li><li> Incubar as placas durante 3 dias a 20 ° C, altura em que os vermes desenvolveram a fase adulta jovem e são ideais para este experimento. Protocolos alternativos para sincronizar C. elegans são descritos em outro lugar 10. </li></ol> 2. Materiais para AS <ol><li> Tampão M9 (22 mM de KH 2 PO 4, 42 mM de Na 2 HPO 4, 86 mM de NaCl, 1 mM de MgSO4) deve ser purgado de oxigénio foram equilibradas com N 2 (árgon pode também ser usado), durante 30 minutos antes da experiência e mantido rodeado de gelo. </li><li> Faça um pequeno furo (3 mmde largura) na tampa de 1,5 ml em tubos de microcentrífuga que os vermes serão colocados durante AS. O buraco permite a troca gasosa sem manter a tampa aberta, pois isso pode levar à evaporação excessiva da mídia. </li></ol> 3. Anóxia / Fome <ol><li> Realizar todas as experiências pelo menos em triplicado. </li><li> Adicionar 1 ml de tampão M9 RT, oxigenado para cada placa de 35 milímetros contendo vermes adultos jovens cultivadas como descrito acima. Tenha cuidado para evitar a remoção de bactérias da placa (adicionar M9 para as bordas onde as bactérias não foram semeadas). Após cerca de 1 min os vermes deve estar nadando no M9. </li><li> Brasão uma ponta de pipeta de 1 ml com BSA por pipetagem e expulsando um estéril solução BSA 1%. </li><li> Incline cuidadosamente a placa contendo os vermes em tampão M9, retire a M9 do mesmo lugar onde foi adicionado, e colocar a suspensão nos microtubos preparados. Deixar em repouso em gelo até que os vermes têm caído para a parte inferior dos tubos (~ 1-2 Minutos). </li><li> Retire a quantidade máxima de M9 possível, sem perturbar os vermes do tubo (deixando cerca de 100 mL), adicionar 1 ml da M9 e gelado purgado em oxigênio e colocar o tubo sobre o gelo até que os vermes se depositam no fundo de novo. Repita o último passo de 3x. Na última lavagem, remover o M9 até ~ 100 ul permanece no tubo. </li><li> Coloque os tubos com os vermes em desoxigenado M9 dentro de uma câmara anóxica / hipóxica (veja as instruções abaixo, Seção 3.6.1) ou, alternativamente, em um recipiente personalizado selado (veja as instruções abaixo, Seção 3.6.2). <ol><li> Se um anóxico / hipóxico câmara comercial é para ser usado, deixe alguns M9 purgado dentro da câmara antes de iniciar o passo 3.5 e repita o passo 3.5, uma vez que os vermes estão dentro da câmara. </li><li> Se uma câmara personalizado está a ser utilizado, uma descrição detalhada de como criar um aparelho de baixo custo é apresentado no final de este protocolo e foi descrito por outro grupo anteriormente 11. Resumidamente: <ol&gt; <li> Faça dois furos em uma tampa de 250 ml Tupperware-tipo de recipiente e adicione conectores do tubo para eles. Um vai ser utilizado para injectar a mistura de gás, enquanto o outro será a saída de gás para dentro de um banho de água. </li><li> Colocar os vermes para a câmara e da câmara de vedação com a tampa. </li><li> Gás com um constante fluxo de N2 (100 ml / min). </li><li> Colocar o recipiente dentro de um banho de água a 26 ° C. Certifique-se de que o tubo de saída é bem imerso em água de modo nenhum retorno de ar e que não há fugas no sistema (aparente por bolhas decorrentes da câmara em si). </li></ol></li></ol></li><li> Incubar os vermes, a 26 ° C durante 20 hr. </li></ol> 4. A reperfusão Simulado <ol><li> Depois de 20 horas, sob condições, retire os tubos da câmara de incubação em ar ambiente. </li><li> Pipeta C. elegans com uma ponta BSA-revestido (como no passo 3.3) para um OP50 semeado 35 milímetros placa NGM. Incubar as placas a 20 ° C durante 24 hr.Depois disso, os vermes estará pronto para ser marcado. </li></ol> 5. Identificar Morto Versus vivo Worms <ol><li> Usando uma picareta platina, tocar levemente a parte superior da cabeça do verme. Vermes vivos irá se mover para trás depois de ser tocado. Se os vermes estão sem resposta, marcar como morto. Ocasionalmente, um verme não irá se mover para trás, mas podem apresentar um leve movimento de cabeça de lado a lado. Apesar de não ser tecnicamente morto, esses vermes são quase certo para expirar em questão de horas, e deve ser marcado como morto. Se alguém espera muito tempo para marcar os vermes, choque interno de progênie pode ocorrer e esses &quot;sacos-de-vermes&quot; podem se romper, fazendo detectar as carcaças muito difícil. </li><li> Remova ambos os vermes vivos e mortos da placa como eles são contados para evitar contagens duplicadas. Os vermes vivos pode ser transferida para uma placa separada para realizar ensaios comportamentais. A quantidade de vermes que vivem em relação ao total é representada como a% de vermes sobreviventes (Figura 1A </strong&gt;). </li></ol> 6. Toque Ensaio de Resposta <ol><li> Uma descrição detalhada deste protocolo tem sido apresentada em Hart, Anne C., ed. Comportamento (3 de Julho de 2006) WormBook, ed. O C. elegans investigação comunitária, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org. <ol><li> Para marcar a resposta ao toque, identificar vermes que estão se movendo e tocar levemente a lateral da cabeça do verme (perto da parte central da faringe) com um picador de cílios (Figura 3). </li><li> Se o worm se move para trás, a pontuação tão sensível, se não, marcar sem resposta (Figura 1B). Repita este passo 10-15x para cada verme com intervalos de 10 segundos. Sonda pelo menos 10 vermes em cada grupo para ter dados precisos. O mesmo ensaio pode ser usado para avaliar a frente alterações locomotory seguinte toque de luz para a parede do corpo posterior. Cuidado para não tocar na cabeça ou cauda do verme, pois isso estimula um comportamento distinto. </li><li> Finalmente, emestirpes de controlo genético corporativos [N2 Bristol tipo selvagem para, mec (mecanosensorial) mutante positiva para negativa - por exemplo CB1338 mec-3 (e1338) IV] para calibrar a força com que tocar os vermes. Muito dura de estimulação vai provocar uma resposta comportamental em mutantes mec, muito pouco não vai provocar um efeito em controles de tipo selvagem N2. </li></ol></li></ol> 7. Neuronal Modificações <ol><li> Para visualizar pós AS modificações neuronais, use uma estirpe que expressa GFP no MEC neurônios respondendo toque 4,5. Esses neurônios têm processos longos que correm ao longo da parede do corpo e são facilmente marcados por alterações morfológicas. Além disso, a informação morfológico pode ser integrado com medidas comportamentais da função neuronal, como descrito acima. Uma estirpe, que pode ser usada para esta finalidade é TU2583, que está disponível a partir da C. elegans Genetics Center e contém o transgene integrado uIs25 expressando GFP frosou o mec-18 promotor, ou, alternativamente, TU2562, que contém um mec-3 :: GFP fusão integrado. </li><li> Prepare uma almofada de agarose. <ol><li> Derreter 2% de agarose em água, para trazer 1x M9 com um estoque de 10x, e manter a solução a 70 ° C. </li><li> Colocar uma gota (~ 20 ul) desta solução numa lâmina de vidro (25 mm x 75 mm) que foi colocada entre duas outras lâminas, cada um dos quais com um único pedaço de fita adesiva sobre o seu lado inferior. </li><li> Coloque uma lâmina de vidro final, perpendicular ao primeiro na parte superior da solução de agarose a 2%, e deixá-la arrefecer à temperatura ambiente. Isto deve formar uma almofada que é a espessura da fita. </li><li> Retire o topo de slides e adicione 10 ml de M9 contendo 0,1% de tetramisol, que imobilizam os vermes. </li></ol></li><li> Mova alguns (~ 10) viver vermes na agarose slides 2%. Coloque uma lamela sobre eles e visualizar GFP utilizando um microscópio de fluorescência sob um objetivo 100X com a iluminação adequada. </li><li> Estragadoneurónios irá mostrar uma cadeia citosólica membrana de padrão de pérolas nos processos, composta de punctum múltipla (Figura 2A), e / ou anomalias em que os processos parecem ser quebrada (Figura 2B). Contagem de punctum e anomalias em ambos os neurónios de cada verme, usando um total de pelo menos 10 vermes. </li></ol> 8. Fez-Lab Hipóxica Câmara <ol><li> A Tupperware estilo, recipiente lacrado, hermético pode ser retrofit como uma câmara anóxica. Tome o cuidado de selecionar um recipiente que é tão pequeno quanto possível. Um pequeno recipiente cria um ambiente hipóxico mais rápido e é mais fácil de se encaixar no banho de água (Figura 4). </li><li> Fazer dois furos na tampa (pode ser feito com uma chave de parafusos ou por aquecimento de uma pinça e forçando para a tampa) e inserir um conector de plástico ou de metal que se encaixa no tubo (Figura 5A). Use cola que pode ser colocado debaixo de água, e também fica difícil após a secagem, evitando o movimento deo conector e, portanto, reduzindo a possibilidade de fugas (Figura 5B). </li><li> O recipiente deve ser colocado no banho de água de modo que é completamente submersa (Figura 4). Para mergulhar o recipiente, use um peso garrafa ou um peso de mergulho. </li><li> Um dos tubos de conexão vai ser usada para introduzir uma mistura de gás e o outro tubo irá actuar como um limitador de pressão, pelo que deve ser deixado sob a água de modo que o recipiente é selado a partir do ambiente externo (Figura 4). </li><li> A composição do ar pode ser modulada por meio de gás feito à medida, controladores de fluxo de massa ou qualquer aparelho que mistura os gases desejados. O fluxo de gás deve ser controlado, como de alto fluxo pode criar uma evaporação excessiva. Por exemplo, em um recipiente de 250 ml, 100 ml / min de gás irá proporcionar boa espaço para os vermes e um fluxo adequado. </li><li> O comprimento da tubagem deve ser mantida a um mínimo, dado que pode ser permeável a gás, umallowing a entrada de O 2. É importante evitar o uso de silicone, tubos Tygon vez que estes materiais são permeáveis ​​a troca de gás. Preferimos tubos de polipropileno ou nylon. Vidro ou tubos de metal manter os gases de bem, mas também são mais difíceis de se trabalhar. </li></ol>

<ol>
	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Maine, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+gene+function+in+Caenorhabditis+elegans+using+RNA-mediated+interference.">Studying gene function in Caenorhabditis elegans using RNA-mediated interference.</a> Briefings Funct. Genom. Proteom. 7 (3), 184-194 (2008).</li><li>Vanden Hoek, ., L, T., Shao, Z., Li, C., Zak, R., Schumacker, P. T., Becker, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reperfusion+injury+on+cardiac+myocytes+after+simulated+ischemia.">Reperfusion injury on cardiac myocytes after simulated ischemia.</a> Am. J. Physiol. 270 (4), 1334-1341 (1996).</li><li>Ba Scott, ., Avidan, M. S., Crowder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+hypoxic+death+in+C.+elegans+by+the+insulin/IGF+receptor+homolog+DAF-2.">Regulation of hypoxic death in C. elegans by the insulin/IGF receptor homolog DAF-2.</a> Science. 296 (5577), 2388-2391 (2002).</li><li>Queliconi, B. B., Marazzi, T. B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicarbonate+modulates+oxidative+and+functional+damage+in+ischemia-reperfusion.">Bicarbonate modulates oxidative and functional damage in ischemia-reperfusion.</a> Free Rad. Biol. Med. 55, 46-53 (2013).</li><li>Wojtovich, A. P., DiStefano, P., Sherman, T., Brookes, P. S., Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ATP-sensitive+potassium+channel+activity+and+hypoxic+preconditioning+are+independent+of+an+inwardly+rectifying+potassium+channel+subunit+in+Caenorhabditis+elegans.">Mitochondrial ATP-sensitive potassium channel activity and hypoxic preconditioning are independent of an inwardly rectifying potassium channel subunit in Caenorhabditis elegans.</a> FEBS Lett. 586 (4), 428-434 (2012).</li><li>Dasgupta, N., Patel, A. M., Scott, B. A., Crowder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+Preconditioning+Requires+the+Apoptosis+Protein+CED-4+in+C.+elegans.">Hypoxic Preconditioning Requires the Apoptosis Protein CED-4 in C. elegans.</a> Curr. Biol. 17 (22), 1954-1959 (2007).</li><li>Jia, B., Crowder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatile+anesthetic+preconditioning+present+in+the+invertebrate+Caenorhabditis+elegans.">Volatile anesthetic preconditioning present in the invertebrate Caenorhabditis elegans.</a> Anesthesiology. 108 (3), 426-433 (2008).</li><li>Wojtovich, A. P., Sherman, T. A., Nadtochiy, S. M., Urciuoli, W. R., Brookes, P. S., Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLO-2+is+cytoprotective+and+contributes+to+mitochondrial+potassium+transport.">SLO-2 is cytoprotective and contributes to mitochondrial potassium transport.</a> PloS One. 6 (12), e28287 (2011).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).</li><li>Fawcett, E. M., Horsman, J. W., Miller, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+defined+gaseous+environments+to+study+the+effects+of+hypoxia+on+C.+elegans.">Creating defined gaseous environments to study the effects of hypoxia on C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (65), e4088 (2012).</li><li>Butler, J. A., Mishur, R. J., Bokov, A. F., Hakala, K. W., Weintraub, S. T., Rea, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+the+anaerobic+response+of+C.+elegans+using+GC-MS.">Profiling the anaerobic response of C. elegans using GC-MS.</a> PLoS One. 7 (9), 10-1371 (2012).</li><li>Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dephosphorylation+of+cell+cycle-regulated+proteins+correlates+with+anoxia-induced+suspended+animation+in+Caenorhabditis+elegans.">Dephosphorylation of cell cycle-regulated proteins correlates with anoxia-induced suspended animation in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (5), 1473-1483 (2002).</li><li>Jiang, H., Guo, R., Powell-Coffman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+hif-1+gene+encodes+a+bHLH-PAS+protein+that+is+required+for+adaptation+to+hypoxia.">The Caenorhabditis elegans hif-1 gene encodes a bHLH-PAS protein that is required for adaptation to hypoxia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7916-7921 (2001).</li><li>Twumasi-Boateng, K., Wang, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+age-dependent+reversal+in+the+protective+capacities+of+JNK+signaling+shortens+Caenorhabditis+elegans+lifespan.">An age-dependent reversal in the protective capacities of JNK signaling shortens Caenorhabditis elegans lifespan.</a> Aging Cell. 11 (4), 659-667 (2012).</li><li>Wang, Y., Chen, J., Wei, G., He, H., Zhu, X., Xiao, T., Yuan, J., Dong, B., He, S. S. k. o. g. e. r. b. &. #. 2. 4. 8. ;. G., Chen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+intermediate-size+transcriptome+shows+high+degree+of+stage-specific+expression.">The Caenorhabditis elegans intermediate-size transcriptome shows high degree of stage-specific expression.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), 5203-5214 (2011).</li><li>Perry, C. N., Huang, C., Liu, W., Magee, N., Carreira, R. S., Gottlieb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenotransplantation+of+mitochondrial+electron+transfer+enzyme,+Ndi1,+in+myocardial+reperfusion+injury.">Xenotransplantation of mitochondrial electron transfer enzyme, Ndi1, in myocardial reperfusion injury.</a> PloS One. 6 (2), e16288 (2011).</li><li>Chai, Y., Li, W., Feng, G., Yang, Y., Wang, X., Ou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Cellular+Dynamics+During+Caenorhabditis+elegans+Postembryonic+Development.">Live Imaging of Cellular Dynamics During Caenorhabditis elegans Postembryonic Development.</a> Nature Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).</li><li>Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reduction+in+intestinal+cell+pHi+due+to+loss+of+the+Caenorhabditis+elegans+Na+/H++exchanger+NHX-2+increases+life+span.">A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span.</a> J. Biol. Chem. 278 (45), 44657-44666 (1074).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Como tem sido amplamente utilizado em C. elegans para modelar lesão IR. Alguns pontos-chave devem ser destacadas para este protocolo: C. elegans são resistentes a uma grande variedade de lesões, o que justifica a necessidade de 3 insultos concomitantes (calor, fome e anoxia) para alcançar a morte usando este sistema. Não só anoxia não matar os vermes nesta janela de tempo 14. Além disso, o aumento da temperatura é um estresse adicional, por isso é importante acompanhar de perto. Estritamente falando, a fome, não contribui de forma significativa para o grau de mortalidade observada 7, por si só, mas parece reduzir a variabilidade entre experiências em replicado. Dado que não pode haver variabilidade significativa do dia-a-dia, é extremamente importante para comparar amostras executado diretamente em paralelo, e para repetir experiências ao longo de vários dias. Em geral, os resultados são medidos por três placas separadas de 50-100 vermes / condição experimental e estes são osn média e considerado como uma única réplica experimental. Geralmente, entre sete e nove repetições parecem ser suficientes para alcançar ou excluir significância estatística. O estágio de desenvolvimento dos vermes utilizados no experimento também precisa ser cuidadosamente monitorados quanto a suscetibilidade de diferentes estágios de AS dano varia significativamente 15,16. O uso de adultos jovens é padrão, e a fase larval (L3 e L4) vermes parecem ser mais resistentes aos efeitos danosos do AS (dados não publicados). Este protocolo apresenta duas maneiras de realizar os experimentos, um utilizando um aparelho feito em laboratório (usando recipientes Tupperware do tipo e entrada de gás 11) e outro utilizando uma câmara hipóxica comercial 4,6. A anóxia pode ser alcançado por outros meios que consomem o oxigênio, conforme já descrito 13,17. O uso de técnicas alternativas para criar um ambiente hipóxico pode mudar o tempo de incubação necessário ASpara criar a quantidade desejada de morte. Segmentação ~ 20% de sobrevivência é um ponto de partida ideal para estudar as intervenções de proteção, enquanto 80% é igualmente ideal para intervenções que agravam os efeitos prejudiciais de AS. Outra ressalva importante é a hora em que a pontuação observador vermes mortos / vivos. Se o tempo para análise é estendida para além de 24 horas, os dados podem ser enganador pois vermes mortos tornam-se cada vez mais difícil de identificar. Isto pode ser devido a carcaças de vermes de se tornar relativamente transparente ao longo do tempo, mas também para o facto de que os embriões fertilizados pode desenvolver em progenitura post-mortem no interior das carcaças e perturbar eles à medida que surgem. A análise da morfologia neuronal pode ser modificado para analisar os padrões de expressão de proteína de 18, a fragmentação nuclear e 4 outros parâmetros 19 por substituição de uma estirpe de vírus que exprime o marcador geneticamente codificado adequado. Uma advertência final é que a visualização daprocessos neuronais deve ser feito a menos de 30 min depois de colocar os vermes no slide. Os animais mantidos sob anestesia em lâminas por períodos mais longos podem apresentar danos AS-independente. Ajuste a quantidade de animais por slides de acordo com o tempo necessário para rastrear e analisá-los.

C. elegans é um nematóide que tem sido amplamente adotado como um organismo modelo eucariota multicelular desde a sua introdução por Brenner 1. É um modelo simples, barato e versátil, que permite ligações fáceis entre alterações genéticas e fenotípicas muda 2. A isquemia é caracterizada por uma falta de disponibilidade de nutrientes e de oxigénio a um tecido, seguida de reperfusão, quando uma explosão de espécies de oxigénio reactivo é produzida 3 e mais do que ocorre o dano. Em 2002, um modelo de isquemia / reperfusão (IR) em C. elegans foi desenvolvido 4 envolvendo a apresentação de todo o worm a anoxia, privação de nutrientes e estresse por calor por cerca de 20 horas seguido por 24 horas em condições normais. Embora este modelo é tecnicamente um anóxia-fome (AS) condição, a morte das células ocorre através de mecanismos que são conservadas em mamíferos, incluindo os danos induzidos por oxidantes durante a reperfusão &lt;sup&gt; 5. Além disso, semelhante à dos mamíferos IR, dano induzido por AS em C. elegans pode ser prevenida por pré-condicionamento isquémico 6,7 ou pré-condicionamento anestésico 8,9. Os protocolos abaixo demonstram como imitar IR em C. elegans utilizando o modelo AS, como marcar anormalidades morfológicas e comportamentais que resultam de AS, e como adaptar o protocolo de uma maneira que permite que o experimento a ser realizado com um menor investimento inicial usando uma alternativa câmara facilmente construído custom-made .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1146">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">N2&#160; strain</td>
			<td style="width:269px;">CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/)</td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:453px;">Wild type strain</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP)</td>
			<td style="width:269px;">CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/)</td>
			<td style="width:208px;">TU2583</td>
			<td style="width:453px;">integrated fluorescent transgene used to label touch neurons</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CB1338 mec-3 (e1338)IV</td>
			<td style="width:269px;">CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/)</td>
			<td style="width:208px;">CB1338</td>
			<td style="width:453px;">canonical mec-3 mutant that is touch insensitive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Microcentrifuge Tube</td>
			<td style="width:269px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:208px;">0030 120.086</td>
			<td style="width:453px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Nikon Eclipse TE2000-U Microscope&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Nikon USA</td>
			<td style="width:208px;">TE2000-U</td>
			<td style="width:453px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Low Temperature Incubator</td>
			<td style="width:269px;">Sheldon Manufacturing Inc.</td>
			<td style="width:208px;">Model 2005</td>
			<td style="width:453px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Eyelash Pick</td>
			<td style="width:269px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:453px;">An eyelash pick can be prepared by attaching&#160; an eyelash onto a wooden toothpick, then attaching the toothpick in a glass Pasteur pipette (Figure 3)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Hypoxic Chamber</td>
			<td style="width:269px;">Coy</td>
			<td style="width:208px;">8307030</td>
			<td>Hypoxic Glove box equipped with paladium catalyst and CO2 controller.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an anoxia-starvation model for ischemia/reperfusion in c. elegans

Protocolos para anoxia / fome no organismo modelo genético C. elegans simular isquemia / reperfusão. Vermes são separados a partir de alimentos de bactérias e colocadas sob anóxia durante 20 horas (isquemia simulada), e subsequentemente transferida para uma atmosfera normal com comida (reperfusão simulado). Este paradigma experimental resultados em aumento da morte e os danos neuronais, e técnicas são apresentados para avaliar a viabilidade do organismo, as alterações na morfologia dos processos de toque de neurónios, bem como a sensibilidade ao toque, o que representa a produção de comportamento da função neuronal. Por fim, um método para a construção de incubadoras hipóxicas utilizando recipientes de armazenamento de cozinha comum é descrito. A adição de uma unidade de controlo de fluxo de massa permite alterações a introduzir a mistura de gás em incubadoras personalizados, e um banho de água circulante permite tanto o controlo de temperatura e torna-o fácil de identificar vazamentos. Este método fornece uma alternativa de baixo custo para comercialmenteunidades disponíveis.

Sujeitar C. elegans e 20 horas de AS a 26 ° C numa câmara de incubação feitos em laboratório, como descrito (secção 3.6.2) resultaram em mortalidade significativa (Figura 1A) 5. Imagem fluorescente subsequente de punctum e quebras nas GFP rotulados processos neuronais de sobreviventes confirmaram a presença de anormalidades morfológicas (Figura 2). Os sobreviventes também responderam mal ao toque parede do corpo de luz (Figura 1B). Este modelo tem sido utilizado por vários grupos para estudar como a predisposição genética, a intervenção farmacêutica e plasticidade metabólica afeta os resultados como dependente 4-6,8,9,12,13. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig1.jpg" /> Figura 1. C. elegans sobrevivência e toque resposta apósAS. A) Percentagem de vermes que exibem 24 horas de pós-AS sobrevivência. A cepa N2 é a herança genética do tipo selvagem, e KWN85 contém um transgene integrado que rotula neurônios mec com GFP. B) Resposta ao toque estímulos de viver C. elegans (N2 Strain) após AS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51231/51231fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig2.jpg" /> Figura 2. Toque modificações neuronais após AS. Neurônio Toque (PLML e PLMR) anomalias, tais como processos tortuosos e pausas (a) ou a acumulação de agregados GFP nos processos (B) foram monitorados em sobreviver anestesiados C. eleg<html> ans após AS. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig3.jpg" /> Figura 3. Escolha pestana. Uma pestana escolha montado. Na inserção, um detalhe do cílio colado à madeira palito. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig4.jpg" /> Figura 4. Câmara hipóxica no interior do banho de água fez-Lab. Um recipiente fechado pronto para iniciar a experiência. As setas indicam a entrada e saída de gás eo peso garrafa usada para mantê-lo flutuando. 231fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Detalhes do lado interno e externo da tampa do recipiente. A) do lado externo da tampa do recipiente, indicando o tubo e o seu conector ligado ao anteriormente feito furo. B) do lado externo da tampa do recipiente, indicando que a ligação de tubo ligado ao furo previamente feito.

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An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Um protocolo é descrito que utiliza anoxia / inanição em C. elegans para modelo de isquemia / reperfusão. Os resultados funcionais incluem um aumento da mortalidade, anormalidades visíveis em processos neuronais marcado com GFP, e respostas comportamentais comprometidas que requerem a função neuronal.

Um modelo de anóxia-inanição por isquemia / reperfusão em<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

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Research

JoVE Journal

Biology

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

9.8K visualizações.  Universidade de São Paulo.  Um protocolo é descrito que utiliza anoxia / inanição em C. elegans para modelo de isquemia / reperfusão. Os resultados funcionais incluem um aumento da mortalidade, anormalidades visíveis em processos neuronais marcado com GFP, e respostas comportamentais comprometidas que requerem a função neuronal. 

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Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos: Sincronização e observação

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Biologia

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Um Método para o cultivo embrionário<em&gt; C. elegans</em&gt; Células

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Anticorpo de coloração em<em&gt; C. Elegans</em&gt; Usando o &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Métodos para a pele ferimento e Ensaios para Responses ferida no<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

Métodos para avaliar Subcelulares Compartimentos de músculo em<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Investigando as proteínas príon-like espalhando e de toxicidade de usar o Metazoan Organismo Modelo<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

Rastreamento e quantificação processos de desenvolvimento em<em&gt; C. elegans</em&gt; Como usar as ferramentas de código aberto

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

Medições de Respostas de Estresse Fisiológico em C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Huntington&#8217;s disease. Recently, repeat expansion-containing RNA was shown to be the substrate for a novel type of protein translation called repeat-associated non-AUG-dependent (RAN) translation. Unlike canonical translation, RAN translation does not require a start codon and only occurs when repeats exceed a threshold length. Because there is no start codon to determine the reading frame, RAN translation occurs in all reading frames from both sense and antisense RNA templates that contain a repeat expansion sequence. Therefore, RAN translation expands the number of possible disease-associated toxic peptides from one to six. Thus far, RAN translation has been documented in eight different repeat expansion-based neurodegenerative and neuromuscular diseases. In each case, deciphering which RAN products are toxic, as well as their mechanisms of toxicity, is a critical step towards understanding how these peptides contribute to disease pathophysiology. In this paper, we present strategies to measure the toxicity of RAN peptides in the model system C. elegans. First, we describe procedures for measuring RAN peptide toxicity on the growth and motility of developing C. elegans. Second, we detail an assay for measuring postdevelopmental, age-dependent effects of RAN peptides on motility. Finally, we describe a neurotoxicity assay for evaluating the effects of RAN peptides on neuron morphology. These assays provide a broad assessment of RAN peptide toxicity and may be useful for performing large-scale genetic or small molecule screens to identify disease mechanisms or therapies.

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Repeat-associated non-ATG-dependent translational products are emerging pathogenic features of several repeat expansion-based diseases. The goal of the protocol described is to evaluate toxicity caused by these peptides using behavioral and cellular assays in the model system C. elegans.

Medição da Toxicidade do Peptídeo RAN em C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...