The authors would like to thank David Gray from the Dundee Drug discovery unit for kindly donating firefly luciferase inhibitory compounds DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 and DDD00023047; Tibor Harkani (Medical University of Vienna) for the suggestion of oxaloacetate as a test compound; and Charlie Dear (University of Aberdeen) for illustrations. This work was funded by a BBSRC Pathfinder award (BB/FOF/PF/4/11) and the University of Aberdeen.

NOTA: Realizar todas as etapas sob condições estéreis (laminar fluxo de gabinete) e com materiais pré-esterilizados em autoclave (126 ° C, 11 min). Uma placa de LB com estrias E. coli OP50 mantidas a 4 ° C é necessária, raia-se para placas de LB fresco e restreak cada mês. 1. Bacteriana Alimentos (Escherichia coli OP50) Preparação <ol><li> Dia 1. Inocular 2 x 5 ml de LB em duas garrafas universais com uma única colônia de E. coli e OP50 lugar em agitação incubadora a 37 ° C (220 rpm) durante 8 horas. </li><li> Após 8 horas de incubação, utilizar 2 ml de E. coli OP50 LB cultura para inocular cada um dos 3 x 200 ml de LB. Colocar em frascos de agitação incubadora (220 rpm) O / N (17 horas) a 37 ° C. </li><li> Pesar 20 x 50 ml de tubos de centrífuga e escrever o peso sobre o tubo. </li><li> Dia 2. Usando uma pipeta sorológica, alíquota de 30 ml de O / N E. coli em cultura OP50 a pré pesava tubos de centrífuga. Centrifugar a 7,741 xg, 10 ° C, 8 min. </li><li> Decantar o sobrenadante cuidadosamente, manter o tubo invertido com tampa e deixar repousar durante vários minutos. Usando uma pipeta de remover qualquer excesso de sobrenadante que pode ter recolhido na tampa. Pesa-se o tubo e calcular o peso do pelete. </li><li> Calcular o volume necessário para proporcionar uma suspensão de 30 g / L e marcar este volume no tubo. Data, etiqueta e colocar os tubos a -20 ° C para utilização no prazo de 1-3 meses ou a - 80 ° C, se o armazenamento por mais de 3 meses. </li><li> Prepare a suspensão bacteriana para o crescimento de nemátodos; permitir sedimento bacteriano para descongelar e adicionar o volume necessário de S 11,12 meio completo a cada tubo, de vórtice suavemente para ressuspender sedimento, conteúdo de piscina de tubos diferentes para se obter o volume requerido. Trabalhar sob condições estéreis. </li></ol> 2. Preparação de Padrões droga num formato de placa de 96 poços NOTA: Se estiver usando uma biblioteca de fármacos, placas de drogas são fornecidos em um únicoconcentração de composto em DMSO. Rastreio primário irá testar compostos a uma única operação de concentração. Instruções de seguir para a preparação de medicamentos para a placa de teste confirmativo composto numa gama de concentrações de entre 0-160 uM, seleccionada após significância estatística a 10 uM. Os passos que se seguem podem ser adaptadas para testar outras concentrações. CUIDADO! Siga as precauções necessárias para a manipulação de drogas (geralmente enfrentam máscara, óculos de segurança, luvas são obrigatórios). <ol><li> Prepare a placa de droga com as normas para o rastreio de confirmação de trabalho: pesar a quantidade necessária de composto em tubo estéril de microcentrífuga de 1,7 ml e se preparar o composto 16 mM em DMSO (ou seja, em relação à concentração de 100x superior desejado para exposição concentrada). </li><li> Serialmente diluídas estoque 16 mM de 1: 2 em DMSO para se obter 8, 4, 2, 1, 0,5 e 0,25 mm (padrões condições estéreis). Estes são 100x concentrada e será diluído até concentrações finais de 0 (apenas veículo),2,5, 5, 10, 20, 40, 80 e 160 uM (em DMSO a 1%) durante a exposição à droga. </li><li> Em uma câmara de fluxo laminar, colocar 20-50 uL por poço de padrões compostos dentro de uma coluna de uma placa de 96 poços, por exemplo A1 posição da placa: 16 mm, B1: 8 mM, C1: 4 mM, D1: 2 mM, E1: 1 mM, F1: 0,5 mM, G1: 0,25 mM de droga e H1: DMSO. Use diferentes colunas para a série de diluição de drogas diferentes. </li><li> Veículo alíquota para as cavidades da coluna 12 na placa de fármaco. NOTA: Este irá facilitar os testes de controlo do veículo para baixo colunas em adição ao teste ao longo fila H, assegurando desse veículo é testado em posições representativas de toda a placa. NOTA: Cada placa de drogas para o rastreio de confirmação contém uma série de diluição para um máximo de 11 diferentes drogas a serem testadas mais o controlo do veículo. </li><li> Rótulo e placa de vedação, cubra com papel alumínio e coloque a -20 ° C até serem necessárias. </li></ol> 3. Experimentos Nematóides NOTA: Realizar todas as etapas under condições estéreis, assepticamente e com pré esterilizado materiais e reagentes. Manter C. elegans estirpes rotineiramente em placas NGM com E. 12 coli OP50. timings sugerido para as diferentes etapas do protocolo são apresentados na Tabela 1. <ol><li> Dia 1 de tarefas: configurar cultura líquida de biossensor tensão para sincronização subseqüente. <ol><li> Tome-se nemátodes de uma placa NGM 6 centímetros (com abundância de larvas jovens onde a comida acaba de correr para fora) em 2 mL S completa e transferir para balão com 30 g / L E. coli OP50 em S completo (volume total de 30 ml em um balão de vidro cónico de 250 ml de capacidade). Incubar 3 dias a 20 ° C, 160 rpm. </li></ol></li><li> Dia 4 de tarefas (permitir que cerca de 30-35 min): cultura lixívia para colher os ovos e sincronizar população worm. Realizar todos os passos de centrifugação durante 1 min, 600 x g. <ol><li> Prepare solução de água sanitária imediatamente antes da utilização: para cada 16 ml de 0,156 M KOH / NaOH adicione 4 ml de lixívia. </li><li> Despeje 2 x 14 mlcultura verme em 15 ml tubos de centrifugação cónicos. Permitir vermes para resolver pela força da gravidade (3 min). Remova e descarte nematóides acima liquidados líquidos. Adicionar 5 ml de solução de água sanitária para cada tubo e iniciar o temporizador. Combine volumes em um tubo. </li><li> Inverta tubo suavemente durante 2 min, verificar sob estereoscópio para a quebra de vermes e a liberação de ovos em suspensão. Quando a maioria de ovos são liberados ou em um tempo máximo de 2 minutos na solução de água sanitária, centrífuga. </li><li> Remover o sobrenadante cuidadosamente. Lave 1x de pelotização com 14 ml S completa e centrifugar. </li><li> Elimine o sobrenadante, adicionar solução de água sanitária 10 ml e iniciar o temporizador (esta segunda etapa de branqueamento garante que a maior parte das carcaças do sem-fim se desintegrar e já não são vistos sob estereoscópio). Depois de um tempo máximo em solução de água sanitária de 2 min, centrífuga. </li><li> Lavar 3x pellet em S completa, decantar cuidadosamente sobrenadante e ressuspender sedimento em 14 ml S completos após cada centrifugação. Após lavagem final, ressuspender pellet ovo em 14 ml S complete. </li><li> Transferir o volume para um frasco de vidro cónico. Incubar 18-24 h a 20 ° C, 160 rpm. NOTA: Colhida ovos eclodem O / N e prender o desenvolvimento na primeira fase larval (L1) devido à falta de comida, portanto, todos eles vão estar no mesmo estágio de crescimento. </li></ol></li><li> Dia 5 de tarefas: configurar culturas vermes sincronizados para ensaios de drogas. NOTA: Worms suspensas em meio de privação tendem a aderir às superfícies plásticas hidrofóbicas, tais como as pontas das pipetas e tubos. 0,01% Tween-20, um agente tensioactivo é utilizado aqui para tornar as superfícies de plástico mais hidrofílico e permitir uma maior precisão na contagem (0,01% de Triton-X100 também pode ser utilizado). Quando nematóides estão no meio suplementado bacteriana, eles não tendem a ficar com plástico. <ol><li> Determinar o número de eclodidos L1 do em balão, balão de manter em plataforma de agitação (160 rpm). <ol><li> Tome 3x 100 amostras ul da garrafa (use uma ponta limpa de cada vez) em 1,7 ml separados microtubos com 900 ul líquido medium 0,01% de Tween-20. NOTA: Aspire amostra de 100 mL na ponta limpo apenas uma vez. Então, quando a distribuição, pipeta cima e para baixo algumas vezes para o meio tween suplementado para liberar quaisquer vermes que aderiram à ponta. </li><li> Conte os nematóides em 4x 10 gotas ul de cada tubo de diluição triplicado. Calcular o valor médio e estimar o número de vermes presentes no frasco de vidro cônico. </li></ol></li><li> Calcule o volume de suspensão de nematóides chocado necessário para configurar uma cultura ml 2 x 20 com 10 nemátodos por 10 jul. Aumentar o volume calculado em 10% a conta para alguma perda nematóide subsequente durante passos de centrifugação. </li><li> Decantar o volume necessário em 2 x 15 ml tubos de centrifugação (pré-pesado). Pesar os tubos para se obter o volume real dispensado, vortex suavemente e ajustar a meta de volume, removendo o excesso de volume com uma pipeta de 5 ml (apenas a ponta estéril deve entrar no tubo). </li><li> Faça o volume para 14 ml com S frescos completos a erah nematóides. Centrífuga (1 min, 600 g). Retire e elimine o sobrenadante com cuidado para não perturbar o pellet nematóide. </li><li> Adicionar 5 ml de S completo com 30 g / L de E. coli OP50 a nematóides peletizadas. Transferir os 5 ml em cada tubo para um frasco de vidro cónico contendo 15 ml S completo com 30 g / L de E. coli OP50. Anote nematóides tempo foram primeiro fornecidos com alimentos. </li><li> Agite suavemente frasco (160 rpm), tome 9 x 10 gotas ul em lâminas microscópicas (use dicas frescos cada vez) para contar nematóides e confirmar média de cerca de 10 (± 2) por 10 ul. </li><li> Coloque frascos de nematóides em agitação incubadora a 20 ° C, 160 rpm durante 42-44 horas. </li></ol></li><li> Dia 7 tarefa: nematóides de transferência para placas de 96 poços e iniciar a exposição ao medicamento. <ol><li> Combinar culturas de nematóides em um único frasco, manter rodando frasco delicadamente e coloque 3 x 4 ml de cultura nematóide em uma calha de 60 ml estéril. Coloque calha em uma plataforma de agitação (160 rpm). </li><li> Use 8 chanNel de pipeta 25 ul alíquota nemátodos suspensos por poço de placas de microtitulação de 96 poços pretas com fundo transparente plana (para tirar ambas as leituras de luminescência e de fluorescência, ou luminescência para placas brancas apenas). Cubra com placa da tampa e reserve. <ol><li> Depois de configurar a cada 2 placas, coloque mais 2 x 2,5 ml nematóides na calha para substituir o volume perdido (manter um &quot;volume morto&quot; na calha de aproximadamente 7 ml). </li><li> Configure 13/14 placas com nematóides. 11 placas de nematóides serão necessários para testar duas placas de drogas de 96 poços. A placa 12 de nemátodo será carregado exclusivamente com veículo como controlo. A 13 de placa será usado para estabelecer a fluorescência de fundo no dia 8 (ver abaixo). Uma placa extra pode ser preparado para uso deve ocorrer erros durante a configuração. </li></ol></li><li> Alíquota 74 ul de S completas a cada poço e colocar a placa em uma câmara úmida (ver lista de materiais) em uma incubadora de agitação (20 ° C, 160 rpm) untIL pronto para compostos de teste alíquota no tempo de desenvolvimento pré-seleccionada (por exemplo, 45 h 30 min após a alimentação fornecida). [Volume por poço é agora 99 ul]. </li><li> Descongelar placa (s) droga para teste. </li><li> Use pipeta multicanal para configurar placas de nematóides com drogas, trocando as pontas de cada vez. Permitir 5 minutos por placa de 96 poços de alíquotas de drogas. <ol><li> Tomar 1 ml de uma coluna st da placa de drogas e adicionar colunas 1-5 de uma placa contendo nematóides; repita a partir do 2 nd coluna na placa de droga em colunas 8-12 da placa contendo nematóides. Adicionar 1 ml de veículo para colunas 6 e 7 da placa de nematóide. NOTA: O volume total por poço na placa de nemátodo é 100 ul resultando em uma diluição de 1: 100 de composto / veículo. </li><li> Repita processo por adição de 1 ul de o 3 rd / 4 th coluna da placa de fármaco às colunas 1-5 / 8-12 da segunda placa de nemátodos; adicionar veículo para colunas 6 e 7 da placa de nematóide.</li><li> Continuar a testar colunas de pratos de drogas restantes. Configurar um mínimo de uma placa nematóide com o veículo em todos os poços, por amostragem, da coluna 12 da placa de drogas. Coloque placas traseiras em câmaras úmidas em agitação incubadora (20 ° C, 160 rpm) durante 20-22 horas (ver nota para o dia 8). </li></ol></li><li> Parte-se preparar o tampão de luminescência por dia seguinte: adiciona-se DMSO e 10% de Triton-X-100 para o volume necessário de S completa para se obter 1% de DMSO e 0,15% de Triton X-100. Permitir 5 ml por placa de leitura de luminescência, mais 1 ml para priming luminometer injector. </li></ol></li><li> Dia 8 de tarefas: Leia endpoints experimentais - fluorescência e bioluminescência. (Leituras de fluorescência de GFP são recomendadas como um meio para normalizar os dados de bioluminescência.) NOTA: Aponte para ler endpoints por 66-67 horas após a alimentação fornecida aos nematóides, a fim de evitar a produção de progênie significativa nas condições experimentais descritas. <ol><li> Configurar placa ao uso como controle de fundo para as leituras de GFP. Combine bem conteúdo dos 13 th placa em um tubo de 15 ml. Permitir nematóides para resolver (2-3 min). Use sobrenadante para carregar uma microplaca (preto com fundo transparente) com 100 suspensão bacteriana ul por poço. <ol><li> Observe fundo placa de controle sob o microscópio anotando poços onde os nematóides podem ser vistos. Excluir estes a partir da estimativa de fundo usada na análise de dados subsequente. </li></ol></li><li> Ler a fluorescência de cada placa de 96 poços, incluindo o controle de fundo. (Configurações: sistema ótico de fundo da placa; filtros 485/20 excitação; emissão 528/20). </li><li> Preparar tampão para leituras de luminescência: adiciona luciferina (20 mM) de co-preparado tampão (a partir do dia anterior), para se obter tampão de luminescência com 1% de DMSO (1x), 0,15% de Triton-X100 (3x) e 0,3 luciferina mM (3x ). Primeiro luminómetro injector 6x com 150 ul de tampão de luminescência. <ol><li> Etapa anterior assume 1% DMSO como veículo durante a exposição à droga. Quando o veículo é água, ajustar o concentration de DMSO em tampão de luminescência a 3% (isto é, 3x). </li></ol></li><li> Trabalhar com uma placa de cada vez. Dispensar tampão 50 ul por poço de luminescência. (150 mL de volume final em bem; 3x diluição de tampão luminescência: DMSO 1%, 0,05% Triton-X100 e 0,1 mM concentrações luciferina finais). Coloque imediatamente na plataforma de agitação e iniciar o temporizador. <ol><li> Após 3 min em plataforma de agitação (160 rpm), leia luminescência (1 seg por medição). </li></ol></li></ol></li></ol> Análise 4. Dados <ol><li> Subtrair fundo GFP média dos resultados de leitura de fluorescência. Divida bioluminescência pela respectiva leitura GFP. <ol><li> Quando um valor elevado de GFP é detectado por nemátodos expostos a um composto, medir a fluorescência do composto por si próprio em conta qualquer fluorescência do composto. Se superior à média, usar isso como plano de fundo em vez disso. </li></ol></li><li> Bioluminescência expresso, um GFP normalizada bioluminescênciand dados de fluorescência de GFP como uma percentagem do valor médio de controlo de veículo em cada placa. </li><li> Traçar os valores médios e as barras de erro para cada concentração. </li><li> Teste de significância estatística usando 2-way análise de variância (ANOVA) com efeitos de &#39;concentração&#39;, &#39;Experiment&#39; e sua interação (cada ponto de dados refere-se a um único poço), e usar o teste de Dunnett como teste post-hoc (vs . controle do veículo). NOTA: Se o &quot;experimento&quot; ou os termos &quot;interação&quot; são significativos, novos experimentos podem ser necessárias para confirmar a resposta. Onde há variabilidade entre os experimentos resulta da observação dos gráficos de dados, um One-way ANOVA pode ser realizada em dados obtidos a partir de experimentos independentes. <ol><li> Para a análise estatística da placa (s) apenas com veículo, seleccione todos os poços em colunas 6 -7 e todos os poços na fila H como grupo controle (estas são as posições rotineiramente atribuídos ao veículo durante o teste composto). </li&gt; </ol></li></ol>

<ol>
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R., DeVreese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+aerobic+metabolism+and+superoxide+production+rate+potential+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Rate of aerobic metabolism and superoxide production rate potential in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> J Exp Zool. 274, 93-100 (1996).</li><li>Garigan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans:+a+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation.">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161, 1101-1112 (2002).</li><li>Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+affects+the+identification+of+metabolic+responses+to+daf-2+status+in+Caenorhabditis+elegans.">Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans.</a> Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).</li><li>Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+glycosyltransferase+BUS-8+has+two+distinct+and+essential+roles+in+epidermal+morphogenesis.">The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis.</a> Dev Biol. 317, 549-559 (2008).</li><li>Castro, P. V., Khare, S., Young, B. D., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+Battling+Starvation+Stress:+Low+Levels+of+Ethanol+Prolong+Lifespan+in+L1+Larvae.">Caenorhabditis elegans Battling Starvation Stress: Low Levels of Ethanol Prolong Lifespan in L1 Larvae.</a> PloS one. 7, (2012).</li><li>Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+Grow+or+Not+to+Grow:+Nutritional+Control+of+Development+During+Caenorhabditis+elegans+L1+Arrest.">To Grow or Not to Grow: Nutritional Control of Development During Caenorhabditis elegans L1 Arrest.</a> Genetics. 194, 539-555 (2013).</li><li>Baugh, L. R., DeModena, J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Pol+II+Accumulates+at+Promoters+of+Growth+Genes+During+Developmental+Arrest.">RNA Pol II Accumulates at Promoters of Growth Genes During Developmental Arrest.</a> Science. 324, 92-94 (2009).</li><li>Maxwell, C. S., Antoshechkin, I., Kurhanewicz, N., Belsky, J. A., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+control+of+mRNA+isoform+expression+during+developmental+arrest+and+recovery+in+C.+elegans.">Nutritional control of mRNA isoform expression during developmental arrest and recovery in C. elegans.</a> Genome Res. 22, 1920-1929 (2012).</li><li>Cressman, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+toxicants+for+toxicity+testing+using+Caenorhabditis+elegans+in+aquatic+media.">Reference toxicants for toxicity testing using Caenorhabditis elegans in aquatic media.</a> Am Soc Test Mater. 131, 518-532 (1997).</li><li>Khanna, N., Cressman, C. P., Tatara, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+to+pH,+salinity,+and+hardness+in+aquatic+media.">Tolerance of the nematode Caenorhabditis elegans to pH, salinity, and hardness in aquatic media.</a> Arch Environ Con Tox. 32, 110-114 (1997).</li><li>Benedetti, C., Haynes, C. M., Yang, Y., Harding, H. P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+5+positively+regulates+chaperone+gene+expression+in+the+mitochondrial+unfolded+protein+response.">Ubiquitin-like protein 5 positively regulates chaperone gene expression in the mitochondrial unfolded protein response.</a> Genetics. 174, 229-239 (2006).</li><li>Yang, W., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mitochondrial+Superoxide+Signal+Triggers+Increased+Longevity+in+Caenorhabditis+elegans.">A Mitochondrial Superoxide Signal Triggers Increased Longevity in Caenorhabditis elegans.</a> Plos Biol. 8, (2010).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar

O organismo modelo C. elegans fornece um poderoso sistema experimental. É fácil de cultura abundante e produz progenia geneticamente idênticos, com um ciclo de vida do dia 3,5 de ovo a reprodução de adulto (através de estágios larvais juvenis através L1 a L4). Devido ao seu pequeno tamanho, pode ser convenientemente cultivadas em placas de 96 poços, o que facilita a triagem composto. Nós apresentamos um protocolo de triagem fenotípica com base em cepas de C. elegans que actuam como sensores in vivo dos níveis de energia 14 O protocolo. é aplicável a qualquer laboratório, embora seja necessário um luminómetro de placas de 96 poços e um armário estéril. É importante evitar a contaminação em ensaios usando boa técnica laboratorial. Se trabalhar manualmente, o número máximo de placas de nematóides atingível é de 13 por experimento permitindo o teste de 2 x placas de 96 poços e de drogas incluindo duas placas de veículos. Os resultados representativos são apresentados para o complexo mitocondrial I inibidor rotenone, o paraquat gerador de superóxido, o oxaloacetato intermediário ciclo de ácido cítrico e quatro compostos com conhecida atividade inibitória da luciferase do pirilampo. Os primeiros dois compostos conduziu a um decréscimo na bioluminescência como previsto oxaloacetato Considerando que conduziu a uma melhoria, podem resultar de uma maior geração de ATP. Os conjuntos de dados oxaloacetato também demonstram a variabilidade intrínseca em experiências com base na luciferase do pirilampo como um repórter. Um mínimo de três experiências independentes são aconselháveis ​​para determinar a robustez das respostas aos compostos desconhecidos. A inibição da actividade da luciferase do pirilampo foi identificável com um ensaio in vitro utilizando um kit comercial. 3 Um dos compostos resultou num aumento substancial da fluorescência da GFP consistente com o inibidor de aumentar os níveis de luciferase de pirilampo pela ligação à enzima luciferase do activo marcado com GFP local, e tornando-o mais estável. 15 Em alguns casos(não, neste caso particular), o que pode levar ao aumento dos níveis de bioluminescência quando o inibidor é deslocada por um excesso de substrato. 15 É, portanto, importante não interpretar os resultados erradamente a partir de compostos que interagem com a enzima de pirilampo como níveis de ATP diminuída ou aumentada / função mitocondrial. As alterações no sinal de luminescência muitas vezes se correlacionam com as medições adicionais de saúde, tais como movimento, crescimento e desenvolvimento. Como um exemplo, um composto é um inibidor da luciferase suspeito se um declínio dramático do sinal de bioluminescência é detectado mas os vermes são indistinguíveis dos controlos por observação microscópica. Um aumento na fluorescência da GFP, não explicado pelo crescimento ou autofluorescência composto, também pode apontar para um inibidor. Uma série de inibidores da luciferase 15 são conhecidos e foram celebrados PubChem. Portanto, em primeira instância, é uma boa prática de consultar informações sobre os inibidores da luciferase detidas por PubChem; seguido por tressante os efeitos de compostos em ensaios in vitro com a enzima purificada, 3 e / ou a confirmação de efeitos sobre a função mitocondrial por meios adicionais. 16,17 Medições de fluorescência da GFP permitir a detecção de níveis de luciferase de pirilampo (ea detecção potencial de alguns inibidores da enzima luciferase, como discutido acima) fazendo um forte argumento para a medição deste parâmetro ao lado de bioluminescência sempre que possível. A normalização das leituras bioluminescência a GFP é também um meio de contabilizar variações no número de vermes entre poços (embora isto também pode ser conseguido pela inclusão de múltiplas repetições técnicas). Para uma maior sensibilidade, é importante para subtrair a fluorescência de fundo de leitura. O protocolo avalia contribuição da suspensão bacteriana para a fluorescência de fundo, no entanto nemátodo autofluorescência não é contabilizada (uma limitação do ensaio corrente, particularmente crítico para qualquer Stu envelhecimentomorre dado que nematóide autofluorescência aumenta com a idade). Autofluorescência de compostos de teste também deve ser avaliada em paralelo. GFP normalização pareceria indispensável quando investigadores deseja adaptar o protocolo para comparar piscinas de ATP celular em diferentes mutantes genéticos ou após o silenciamento de genes diferentes, a fim de controlar para quaisquer diferenças de tensão ao nível de expressão do transgene bioluminescência. Os parâmetros críticos dentro do protocolo de incluir a fase de desenvolvimento em que a exposição é iniciada, a duração da exposição, e a obtenção de um número semelhante de nemátodos nos diferentes poços. A exposição pode começar em qualquer fase de desenvolvimento dos nematóides, no entanto fase L3 ou mais é preferível. A partir dessa etapa, nematóides depender de fosforilação oxidativa para o desenvolvimento até a idade adulta, como evidenciado por um aumento muito significativo no teor de mtDNA, consumo de oxigênio e níveis de ATP. 18,19,20 O presente protocolo inicia exposure no estádio L4. A razão para alíquotas nemátodos para placas de 96 poços apenas nesta fase (ao invés do que quando eles foram em primeiro lugar dotado de comida na fase L1), é que, embora as placas são colocadas em câmaras húmidas para minimizar a evaporação, um grau de evaporação ainda ocorre em nossa incubadora de agitação, vista como muito pequenas gotículas que formam nas tampas (isto pode não ser um problema com outras incubadoras agitação). Por nemátodos alíquotas para placas imediatamente antes da adição de padrões de droga, a concentração efectiva da droga não é afectada por qualquer variação pequena no volume devido a evaporação. Carregando uma placa com nematóide veículo só é útil para verificar se os nematóides foram distribuídos uniformemente entre os poços. Não existem diferenças significativas para o veículo só placa seria indicativo de má técnica na distribuição dos nematóides aos poços. A duração da exposição é um fator importante a considerar. Se os efeitos sobre o estado de energia de forma independente do crescimento são de interesse, o proprotocolo pode ser modificado para acomodar exposições mais curtas (de respostas quase imediatos para, por exemplo, 2 horas). Por outro lado, a entrada de compostos em C. tecidos elegans pode levar algum tempo. Por exemplo são necessárias 12-24 horas para atingir as concentrações máximas internas do resveratrol e 5-fluoro-2&#39;-desoxiuridina (FUdR). 21 Por conseguinte, uma exposição mais longa (18 a 24 horas) pode ser justificada para maximizar os níveis de exposição. O tempo de exposição deve ser limitado aos tempos que não permitem níveis significativos de reprodução para tomar lugar no poço. Recomendamos que o tempo total de desenvolvimento de nematóides é mantida sob 66-67 h. Embora conveniente, nematóides estão grávidas até lá e deram início a oviposição. No entanto descobrimos leituras bioluminescência preparações de ovo a ser insignificante (não mostrado). O sur-5 promotor impulsionado expressão do transgene é primeiro detectada apenas 2-2 horas e meia após a fertilização na fase 100 célula 22 e a ccasca de ovo hitinous é susceptível de limitar a entrada de luciferina. Outros descobriram que os ovos embrionados não contribuem significativamente para o metabolismo dos adultos grávidos. 23 No entanto, as condições que permitem a produção de descendência significativo, devem ser evitados. Se preferir, a escala de tempo experimental pode ser deslocado de volta: nós já iniciou a exposição a uma toxina ambiental na tarde L3 fase larval (36 h) e realizado bioluminescência e GFP medições a 55 hr 2 fundos alternativa, genéticas que são condicionalmente estéril. pode ser usado para evitar a produção de descendência, como por exemplo o fer-15 (B16) II; Fem-1 (hc17) IV mutante duplo que pode ser mantida a 15 ° C, mas é estéril a 25 ° C. 24 A utilização de FUDR para induzir a esterilidade não é recomendada como este pode, por si só afecta o metabolismo de nemátodos. 25 O ensaio pode também ser realizada em estirpes com cutículas mais permeáveis, tais como perda parcial-do-functião barramento-8 mutantes que são devidos a aumento da permeabilidade de drogas sensíveis a fármacos múltiplos. 26 Isto irá facilitar a exposições mais curtas e baixas concentrações de composto. As condições para a adição de luciferina a estes nemátodos podem também precisam de ajuste ou seja, 1% DMSO e 0,05% de Triton-X100 no buffer de luminescência pode não ser necessária para aumentar a disponibilidade luciferina. O protocolo usa 1% de DMSO como veículo para a entrega do composto. Embora não letal, esta concentração de DMSO tem alguns efeitos biológicos como já discutido na publicação anterior. 3 Muitas das bibliotecas de medicamentos disponíveis são preparadas em 100% de DMSO, em concentrações que serão adequados para os ensaios baseados em células, após a diluição de veículo a 0,1%. Concentrações de composto mais elevados são necessários para induzir respostas em C. elegans quando comparado com células de origem humana, de tal modo que muitas vezes não é possível realizar ensaios em menor do que 1% de DMSO. Mais uma vez, a utilização de estirpes comcutículas mais permeáveis ​​podem levar a testes com concentrações mais baixas de veículo. As concentrações de DMSO de 1% mais elevada do que não são recomendados. Um tempo de incubação conjunto com luciferina antes de leituras devem ser respeitados. Como foi mostrado anteriormente, luminescência atinge seus níveis máximos no segundo minuto após a adição de luciferina, permanecendo relativamente estável para o primeiro 5 min, seguido por uma diminuição gradual lento na luminescência ao longo do próximo 30 min 1. Respostas cinéticas para uma determinada substância química pode ser levada a cabo durante esta etapa inicial de 30 minutos após a distribuição inicial da luciferina. O protocolo envolve um passo de fome após a coleta de ovos para conseguir a sincronização da população do nematóide. Recomendamos sincronização de populações de nemátodos de teste uma vez que diferentes estágios de desenvolvimento diferem nos níveis de ATP celular e pode responder de forma diferente para os compostos de teste. Ao realizar a fome no S completomédio, por oposição a M9, os nemátodos incubação são fornecidos com uma fonte de carbono (etanol), de modo que as larvas não se desenvolvem, mas não são completamente fome 27,28. Também tem sido demonstrado que são presos L1 do preparado de resposta rápida ao alimento e L1 taxa de crescimento normal é alcançado dentro de 3 h após o alimento fique disponível. 29 No entanto, a possibilidade de que o passo de jejum pode alterar o metabolismo de C. elegans não pode ser excluída. 30 Por esta razão, o comprimento de fome não deve ser superior a 24 horas (18 horas é suficiente para sincronização). Alguns laboratórios podem ter a possibilidade de utilizar uma Copas Biosorter para sincronização de idade ignorando o passo fome completamente. Outros laboratórios podem ter uma preferência para a expansão da população de nematóides em meio sólido (placas NGM com OP50) antes do branqueamento (passo 3.1) e isso vai funcionar muito bem. Nós usamos meio S durante a exposição composto como um meio padrão para nematóide cultura, however outros meios de comunicação pode ser seleccionado, por exemplo K médio ou EPA moderadamente água dura são frequentemente utilizados para estudos ecotoxicológicos 31,32. O protocolo proporciona um meio para rastrear e identificar candidatos para análises adicionais em termos dos efeitos sobre a função mitocondrial. Na fase de rastreio primário, é provável que alguns compostos que foram perdidas devido a uma única concentração a ser testada, por conseguinte, telas de drogas não deve ser considerada exaustiva. Visitas podem ser validados pelo uso de técnicas para avaliar diferentes aspectos da função mitocondrial por exemplo o consumo de oxigénio, C. elegans com estirpes expressando GFP mitocôndrias, manchas de potencial de membrana mitocondrial e / ou medições de ROS. 16,33,34 A maior importância da metodologia é ter um meio para o rastreio de grande número de compostos e / ou condições ao nível do organismo multicelular, e mais importante, de ser capaz de tirar vantagem do the tratabilidade genética de C. elegans para investigar os mecanismos de ação. A técnica pode ajudar a acelerar e encontrar novos caminhos para a descoberta de compostos e alvos interessantes. Prevê-se que a combinação do sensor com fundos genéticos associados à doença humana para o rastreio de bibliotecas de compostos, num contexto em causa doença terá muito a oferecer.

O objetivo geral deste procedimento é a rápida quantificação do status de energia do C. elegans in vivo, com vista a utilizar este como um ponto final na triagem composto. A base racional é com base na expressão transgénica da luciferase de pirilampo, no nemátodo C. elegans 1-3 através do plasmídeo pSLGCV (1 <a href="https://www.addgene.org/49862" target="_blank">https://www.addgene.org/49862).</a> A enzima luciferase é fundida com a proteína fluorescente verde GFP e é expressa constitutivamente e ubiquamente no citoplasma (o sinal de direccionamento de peroxissoma luciferase foi removido). Isto conduz a emissão de luz, quando o substrato luciferina é fornecido exogenamente. À medida que o sem-fim é transparente, a luz pode ser medida num luminómetro como unidades relativas de luz (RLU). Combustíveis de ATP celular a reacção de bioluminescência e a sua disponibilidade determina os níveis de luz produzidos. Consequentemente, luminometria oferece uma convenient meios de avaliar os níveis relativos de ATP e função mitocondrial por extensão, uma vez que a produção de ATP ocorre principalmente nas mitocôndrias. A relação entre os níveis de função e bioluminescência mitocondriais tem sido demonstrada previamente através do silenciamento dos genes da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial e concomitante redução da produção de luz. 1 As cepas bioluminescência gerados foram designados PE254 (feIs4) e PE255 (feIs5) 1 (ver lista de materiais) e podem ser utilizados indiferentemente. 3 Um número de estudos foram utilizadas essas estirpes de sensores para informar sobre os níveis de ATP celular in vivo a seguir a exposição a vários produtos químicos xenobióticos tais como azida de sódio 1, cádmio 2, esgoto extracto de lamas 3, 5&#39;-f luoro-2-desoxiuridina 6, e uma nitrosamina específica do tabaco 7. As cepas também têm sido úteis para monitorizar os efeitos da exposição à radiação ultravioleta C <saté&gt; 8 e efeitos de perturbar a função da cadeia respiratória mitocondrial. 1,9 Uma primeira versão do sensor de luminescência que expressa o gene da luciferase sem uma fusão GFP (PE39) também tem sido utilizada na investigação dos efeitos de metais pesados ​​e de um respiratória . 10 Cepas PE254 PE255 e desacoplador levar a luciferase: GFP fusão e fluorescência da GFP foi mostrado para aumentar proporcionalmente com massa nematóide, oferecendo um meio conveniente para a normalização dos valores de luminescência 6,9 Os efeitos do montante diferencial de vermes por poço também pode ser. tidas em conta, incluindo várias repetições técnicas no ensaio (um mínimo de 5 poços por condição). 3 O protocolo oferece a possibilidade de monitorização in vivo dos níveis de energia (em oposição a mais tecnicamente laboriosa determinações in vitro de ATP), que permite rastreio de compostos e reposicionamento no contexto fisiológico de um mu inteirolticellular organismo. O procedimento pode ser estendido para uma variedade de origens genéticas, atravessando o transgene cromossomicamente integrados em cepas mutantes disponíveis e / ou por silenciar genes por RNA de interferência; Assim, aproveitando ao máximo C. elegans como organismo modelo. O método deve ajudar a reduzir a falta de fase tardia de candidatos a medicamentos devido à toxicidade mitocondrial e fazer uma contribuição para a redução de maior experimentação animal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Orion II Microplate Luminometer</td>
			<td>Berthold Detection Systems</td>
			<td></td>
			<td>with injector and the Simplicity 4.2 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLx800 fluorimeter&#160;</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td>with Gen5 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ks 130 basic shaking platform</td>
			<td>Ika</td>
			<td>#0002980000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova 4349</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Refrigerated incubator shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge 5804R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>with eppendorf rotor A-4-44&#160; (for 50/15ml tubes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripette, Costar</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#4489</td>
			<td>Serological pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar 50 ml tubes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#227661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar 15 ml tubes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar 60 mm tissue culture plates&#160;</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#631-0909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile spatula</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#3007; #3004</td>
			<td>for weighing out chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 mM Millex GP filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>#SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen eppendorf tubes 1.5 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#MCT-150-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96 well assay plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#3603</td>
			<td>Black plate clear bottom with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96 well assay plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#236105</td>
			<td>White plate with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir reagent 60 mL</td>
			<td>Thermo Scientific Finnpipette</td>
			<td>#9510027</td>
			<td>used as trough for nematodes&#160; in protocol section 4.4.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage box/damp chamber</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>#10 800 058 001</td>
			<td>174 x101 x 56.6 mm, used as a damp chamber with wet paper towels; 2X 96-well plates with lids can fit into one, the lower sitting on top of a microplate lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach: Sodium hypochlorite solution 4-4.99% Chlorine content</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#239305</td>
			<td>Store in aliquots at 4&#176;C,&#160; seal with parafilm to prevent loss of chlorine and cover in foil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, potassium salt</td>
			<td>Biotium Inc</td>
			<td># 10101-2</td>
			<td>Molecular Probes can also be used as supplier; prepare a 20 mM stock in ddH2O, keep at -20 &#176;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td># P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>CalBiochem</td>
			<td>#317275</td>
			<td>Purity 99.99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>#A16046</td>
			<td>Diltute to 10% in ddH20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>CalBiochem</td>
			<td>#475914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans bioluminescent strains</td>
			<td>Author&#39;s own laboratory</td>
			<td>PE254, PE255</td>
			<td>contain integrated arrays feIs4 and feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] respectively on chromossome V and X; select for homogeneous and strong expression of luc::GFP by fluorescence microscopy (e.g. pick 15 worms) every now and then.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli OP50</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General chemicals</td>
			<td>Sigma Aldrich/Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a screenable in vivo assay for mitochondrial modulators using transgenic bioluminescent caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

Os resultados representativos para ilustrar o método foram obtidos para rotenona (Figura 1), o paraquat (Figura 2), o oxaloacetato (Figura 3), e 4 compostos que foram apanhados inibidores como luciferase de pirilampo durante o rastreio de uma biblioteca de medicamentos 13 (Figura 4). A exposição da droga foi iniciada na fase de L4 em todos os casos, mas os experimentos de exposição paraquat foram iniciadas em 41 horas após a primeira comida fornecida aos nematóides em comparação com 45-46 horas para os outros compostos. O protocolo permite um grau de flexibilidade na selecção de tempo para o início da exposição ao fármaco e a duração da exposição. No entanto, para fins de rastreio, definir horários devem ser respeitados, uma vez selecionados, para a reprodutibilidade entre os experimentos. Endpoints deve ser medido por 66-67 hr tempo de desenvolvimento, a fim de evitar extensa postura de ovos para incubação e de progênie em poços. Diretrizes para horários são fornecidos em Tcapaz 1. Rotenona, um complexo mitocondrial I de inibidor, reduzida bioluminescência após ambas as exposições relativamente curtas (2 horas) e mais longo (24 horas) para uma gama de concentrações (Figura 1). Neste exemplo, as medições foram levadas GFP, mas o número de repetições técnicos utilizados (n = 6) é suficiente para uniformizar quaisquer diferenças nos números de vermes entre 3 poços. A exposição de 24 horas é uma janela de tempo durante o qual os nemátodos crescer, e desenvolvimento mais lento, como resultado da complexa inibição eu era esperado para contribuir para o declínio da bioluminescência. Isto foi confirmado por observação visual sob estereoscópio com desenvolvimento retardado visto, particularmente em concentrações de 20 ^ M e acima; Além disso, alguns letalidade foi observada a partir de 40? M (observações qualitativas não quantificada). Sem letalidade foi observada após a exposição 2 hr, mas efeitos sobre o movimento sem-fim foram vistos. Um declínio acentuado na bioluminescência em relação aos controles ocurred na concentração mais baixa testada de rotenona 2,5 uM, para os quais os efeitos não foram facilmente detectadas por observação visual rápida em 2 horas de exposição. Este declínio da bioluminescência é consistente com a redução do ATP celular. A inibição máxima foi alcançada com a concentração mais baixa de rotenona utilizado (2,5 uM), indicando que todas as experiências subsequentes destinadas especificamente às rotenona deve ser realizada entre 0 e 5 uM [na gama de concentrações 0-160 uM foi seleccionado como parte de uma comparação com outras drogas inicialmente identificado como tendo efeitos significativos em 10 mM (a ser publicado em outro lugar)]. O herbicida paraquat afeta a função mitocondrial por meio de aumento de espécies reativas de oxigênio. Aqui, demonstramos o seu efeito sobre a bioluminescência de C. elegans estirpe PE254 após exposição a uma gama de concentrações de 24 h (Figura 2). À medida que a tensão carrega uma luc :: fusão GFP, fluorescência da GFP foi alsO medidos como um meio de normalização. paraquat 6,9 diminuiu a bioluminescência, fluorescência da GFP e bioluminescência normalizada significativamente. O teste post-hoc Dunnet indicaram que as concentrações de paraquat com diferenças significativas em relação ao controlo do veículo foram 4 e 8 mm para a bioluminescência e bioluminescência normalizado, bem como 2 mM para bioluminescência normalizado. A única concentração reduzindo significativamente fluorescência da GFP foi 8 mm, uma concentração em que os efeitos do crescimento e do verme morto ocasionais foram vistos (observações qualitativas). O declínio na bioluminescência (e bioluminescência normalizado) foi maior do que a de fluorescência, consistente com uma diminuição da função mitocondrial e os efeitos sobre a produção de ATP. O oxaloacetato intermediário do ciclo do ácido cítrico testado em C. elegans estirpe PE254 numa concentração única de 8 mM, levou a um aumento da bioluminescência (Figura 3). Sem fluorescência da GFPNCE medições foram obtidas ou observação visual adicional realizado; no entanto, tais resposta a uma única operação de concentração merecem uma exposição de confirmação para uma gama de concentrações, e observações mais detalhadas sobre os efeitos. Um acessório de bioluminescência por este composto não é surpreendente, uma vez que pode ser postulada para levar a uma maior actividade do ciclo do ácido cítrico, com última análise, uma maior produção de ATP (no entanto, seria aconselhável controlar a quaisquer efeitos sobre os níveis de luciferase por meio da avaliação fluorescência da GFP em experiências subsequentes). Os conjuntos de dados oxaloacetato mostrado revelam o grau de variabilidade na resposta vista com base em experiências de luciferase. Em nossa experiência esta variabilidade é uma característica do sistema de teste particularmente para as condições de exposição menos prejudiciais. O compostos inibidores da luciferase do pirilampo DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 e DDD00023047 foram testadas in vitro vendo os efeitos sobre a puenzima rified e in vivo usando o C. elegans luc: GFP expressando tensão. Não houve evidências de que qualquer um dos compostos testados causou a morte de nemátodos sob as condições de exposição. Todos os 4 compostos afectou a actividade de luciferase in vitro para as concentrações testadas 2 25 e 100 uM (Figura 4A). DDD00001434 matou a actividade da luciferase purificada quase completamente, o que proporcionou uma justificação credível para o grande decréscimo na bioluminescência in vivo (Figura 4B). Embora, in vitro e in vivo em ensaios não são directamente comparáveis, a resposta a DDD00023047 foi semelhante em ambos os ensaios. DDD0001477 e DDD00000635 causou um declínio maior in vivo do que in vitro. Estes compostos foram fornecidos para os vermes vivos 22 h antes de o substrato luciferina, e os resultados podem reflectir que eles não eram facilmente deslocado do local activo de luciferase luciferina quando se tornou pilable. Alternativamente, DDD0001477 e DDD00000635 pode ter um efeito adicional sobre os níveis de ATP celular. Isso teria de ser avaliado por meio que não envolvem a luciferase de vaga-lume. De destacar a forte valorização do sinal GFP em vermes vivos expostos ao composto DDD00000635. Isto será discutido a seguir. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig1.jpg" /> Figura 1. O complexo mitocondrial I inibidor rotenone diminuiu o estado de energia de C. elegans como medido por bioluminescência de estirpe PE254. Sincronizada L4 vermes estágio (45-46 h após o alimento fornecido a larvas L1) expostas a 0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 e 160 uM em rotenona 1% de DMSO durante 2 hr (short) ou 24 horas (exposição longa) leituras anteriores de bioluminescência, respectivamente, em 48 e 69 h de desenvolvimento verme após o alimento fornecido. Bioluminescência (unidade relativa Unidades de luz, RLU) foi expressa como uma percentagem do veículo (1% DMS) Os valores de S. As barras de erro representam SEM de réplicas para cada concentração de técnicas rotenona (n = 6). Todas as concentrações testadas resultou em uma diferença altamente estatisticamente significante em relação ao controle de veículo (p &lt;0,001). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig2.jpg" /> Figura 2. O paraquat estressor oxidativo diminuiu o estado de energia de C. elegans PE254 estirpe de um modo dependente da concentração (medida por bioluminescência). vermes fase sincronizada L4 (por conveniência, neste caso a 41 horas após o alimento fornecido a larvas L1) foram expostas a 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4 ou 8 paraquat mM durante 24 h. A fluorescência de GFP (unidades de fluorescência relativa unitários, RFU) foi usado para normalizar os dados de bioluminescência (unidade RLU), ambos os pontos finais obtidos em 65 h de desenvolvimento. Os dados são expressos como uma percentagem de controlo (DMSO a 1%). As barras de erro representam SEM de réplicas técnicas(n = 5 para diferentes concentrações; n = 18 para os controlos). One-way ANOVA: *** p &lt;0,001 em relação ao veículo de controlo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig3.jpg" /> Figura 3. O intermediário oxaloacetato ciclo do ácido cítrico (8 mM) aumentaram a bioluminescência de C. elegans PE254 tensão. Synchronized L4 vermes estágio (45-46 horas após a refeição fornecida às larvas L1) foram expostos a recém-preparados 8 oxaloacetate mM durante 18 horas ± 30 min. A bioluminescência (unidade RLU) foi lida a um período de desenvolvimento de HR 63,5 ± 1 h e esta foi expressa como uma percentagem do controlo de veículo (ddH2O). Diferentes colunas representam diferentes conjuntos de 8 repetições técnicas atribuídas a diferentes placas de 96 cavidades dentro da mesma experiência de dados. As barras de erro representam SEM de réplicas técnicas (n = 8). 2 way-ANOVA com &#39;set&#39; e &#39;concentração&#39; como fatores: ̵6; Definir &#39;p&gt; 0,05&#39; &#39;, p concentração &lt;0,001 e termo de interação p&gt; 0,05. UMA <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4ahighres.jpg" width="650" /> B <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4bhighres.jpg" width="650" /> Figura 4. Teste de respostas a 4 compostos da biblioteca Dundee descoberta da droga composto 13 (C1: DDD00001434, C2: DDD0001477, C3: DDD00000635 e C4: DDD00023047) com atividade inibitória conhecida em vaga-lume luminescência da luciferase. (A) Efeito dos compostos sobre a actividade de luciferase de pirilampo purificada (medido como unidades de luz, RLU), expresso como uma percentagem do controlo de veículo. O kit de bioluminescência de ATP CLSII (Roche, Manheim, Alemanha) foi usada de acordo com instruções fornecidas com a mesma quantidade de enzima luciferase aliquotadas para poços de branco (96-Well placas de microtitulação). ATP foi fornecido a uma concentração final de 10 uM e 1 ul de composto (concentração final indicada) ou DMSO (1%) foi adicionado. Sinal de luminescência foi integrado durante 10 segundos. As barras de erro representam SEM de réplicas técnicas (n = 4). Análise: One-way ANOVA; * p &lt;0,05 ou *** p &lt;0,001 em relação ao veículo de controlo. Diferenças entre 25 e 100 uM altamente significativas para C1 (DDD00001434; p &lt;0,001), e significativo para C2 e C3 (respectivamente DDD0001477 e DDD00000635; p &lt;0,05). (B) in vivo medições de bioluminescência, bioluminescência normalizado a fluorescência da GFP e fluorescência da GFP de C. elegans PE254 estirpe em 67 hr tempo de desenvolvimento após a exposição a compostos de teste durante 22 h. As barras de erro representam SEM de réplicas técnicas (n = 8). A análise estatística (one-way-ANOVA) realizada em dados agrupados de 3 conjuntos de dados (3 xn = 8). * p &lt;0,05 ou *** p &lt;0,001 em relação ao controlo de veículo respectivo. Diferenciadaces entre 25 e 100 mm única estatisticamente significativa (p &lt;0,05) para a bioluminescência normalizado após a exposição a C4 (DDD00023047). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Hora do dia </td><td> Dia 1 </td><td> Dia 2 </td><td> Dia 3 </td><td> Dia 4 </td><td> Dia 5 </td><td> Dia 6 </td><td> Dia 7 </td><td> Dia 8 </td></tr><tr><td> 9-10 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Passo 5 </td></tr><tr><td> 10-11 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Passo 5 </td></tr><tr><td> 11-12 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Passo 4 </td><td> Passo 5 </td></tr><tr><td> 12-13 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Passo 4 </td><td></td></tr><tr><td> 13-14 </td><td&gt; </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 14-15 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15-16 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 16-17 </td><td> Passo 1 </td><td></td><td></td><td></td><td> Passo 3 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 17-18 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 18-19 </td><td></td><td></td><td></td><td> Passo 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Visão geral das etapas do protocolo a ser realizado em cada dia de experimentos de nematóides (Seção 3) e sugeriu timings.

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A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

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The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

9.9K visualizações.  University of Aberdeen. A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function. 

Vídeo: A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Geração de transgênicos Estável C. elegans Usando microinjeção

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Biologia

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

In vivo Bioluminescent imagem de tumores mamários Usando Spectrum IVIS

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Geração de transgênicos C. elegans Por biobalística Transformação

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Lapso de tempo Microscopia de embriogênese inicial em Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

Visualização de Caenorhabditis elegans Estruturas cutícula Usando o Dye lipofílicos Vital, DII

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

Um ensaio de rastreio fluorescente para identificação Moduladores de Canais GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos: Sincronização e observação

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Extração de prostaglandina e Análise em<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media (mCeHR). Additionally, the steps for exposing and acclimatizing C. elegans grown on E. coli to axenic liquid media are described. Finally, downstream experiments that utilize axenic C. elegans illustrate the benefits of this procedure. The ability to analyze and determine C. elegans&#160;nutrient requirement was illustrated by growing N2 wild type worms in axenic liquid media with varying heme concentrations. This procedure can be replicated with other nutrients to determine the optimal concentration for worm growth and development or, to determine the toxicological effects of drug treatments. The effects of varied heme concentrations on the growth of wild type worms were determined through qualitative microscopic observation and by quantitating the number of worms that grew in each heme concentration. In addition, the effect of varied nutrient concentrations can be assayed by utilizing worms that express fluorescent sensors that respond to changes in the nutrient of interest. Furthermore, a large number of worms were easily produced for the generation of transgenic C. elegans using microparticle bombardment.

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans is usually grown on solid agar plates or in liquid cultures seeded with E. coli. To prevent bacterial byproducts from confounding toxicological and nutritional studies, we utilized an axenic liquid medium, CeHR, to grow and synchronize a large number of worms for a range of downstream applications.