The authors would like to thank David Gray from the Dundee Drug discovery unit for kindly donating firefly luciferase inhibitory compounds DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 and DDD00023047; Tibor Harkani (Medical University of Vienna) for the suggestion of oxaloacetate as a test compound; and Charlie Dear (University of Aberdeen) for illustrations. This work was funded by a BBSRC Pathfinder award (BB/FOF/PF/4/11) and the University of Aberdeen.

NOTA: Realizar todas as etapas sob condições estéreis (laminar fluxo de gabinete) e com materiais pré-esterilizados em autoclave (126 ° C, 11 min). Uma placa de LB com estrias E. coli OP50 mantidas a 4 ° C é necessária, raia-se para placas de LB fresco e restreak cada mês. 1. Bacteriana Alimentos (Escherichia coli OP50) Preparação <ol><li> Dia 1. Inocular 2 x 5 ml de LB em duas garrafas universais com uma única colônia de E. coli e OP50 lugar em agitação incubadora a 37 ° C (220 rpm) durante 8 horas. </li><li> Após 8 horas de incubação, utilizar 2 ml de E. coli OP50 LB cultura para inocular cada um dos 3 x 200 ml de LB. Colocar em frascos de agitação incubadora (220 rpm) O / N (17 horas) a 37 ° C. </li><li> Pesar 20 x 50 ml de tubos de centrífuga e escrever o peso sobre o tubo. </li><li> Dia 2. Usando uma pipeta sorológica, alíquota de 30 ml de O / N E. coli em cultura OP50 a pré pesava tubos de centrífuga. Centrifugar a 7,741 xg, 10 ° C, 8 min. </li><li> Decantar o sobrenadante cuidadosamente, manter o tubo invertido com tampa e deixar repousar durante vários minutos. Usando uma pipeta de remover qualquer excesso de sobrenadante que pode ter recolhido na tampa. Pesa-se o tubo e calcular o peso do pelete. </li><li> Calcular o volume necessário para proporcionar uma suspensão de 30 g / L e marcar este volume no tubo. Data, etiqueta e colocar os tubos a -20 ° C para utilização no prazo de 1-3 meses ou a - 80 ° C, se o armazenamento por mais de 3 meses. </li><li> Prepare a suspensão bacteriana para o crescimento de nemátodos; permitir sedimento bacteriano para descongelar e adicionar o volume necessário de S 11,12 meio completo a cada tubo, de vórtice suavemente para ressuspender sedimento, conteúdo de piscina de tubos diferentes para se obter o volume requerido. Trabalhar sob condições estéreis. </li></ol> 2. Preparação de Padrões droga num formato de placa de 96 poços NOTA: Se estiver usando uma biblioteca de fármacos, placas de drogas são fornecidos em um únicoconcentração de composto em DMSO. Rastreio primário irá testar compostos a uma única operação de concentração. Instruções de seguir para a preparação de medicamentos para a placa de teste confirmativo composto numa gama de concentrações de entre 0-160 uM, seleccionada após significância estatística a 10 uM. Os passos que se seguem podem ser adaptadas para testar outras concentrações. CUIDADO! Siga as precauções necessárias para a manipulação de drogas (geralmente enfrentam máscara, óculos de segurança, luvas são obrigatórios). <ol><li> Prepare a placa de droga com as normas para o rastreio de confirmação de trabalho: pesar a quantidade necessária de composto em tubo estéril de microcentrífuga de 1,7 ml e se preparar o composto 16 mM em DMSO (ou seja, em relação à concentração de 100x superior desejado para exposição concentrada). </li><li> Serialmente diluídas estoque 16 mM de 1: 2 em DMSO para se obter 8, 4, 2, 1, 0,5 e 0,25 mm (padrões condições estéreis). Estes são 100x concentrada e será diluído até concentrações finais de 0 (apenas veículo),2,5, 5, 10, 20, 40, 80 e 160 uM (em DMSO a 1%) durante a exposição à droga. </li><li> Em uma câmara de fluxo laminar, colocar 20-50 uL por poço de padrões compostos dentro de uma coluna de uma placa de 96 poços, por exemplo A1 posição da placa: 16 mm, B1: 8 mM, C1: 4 mM, D1: 2 mM, E1: 1 mM, F1: 0,5 mM, G1: 0,25 mM de droga e H1: DMSO. Use diferentes colunas para a série de diluição de drogas diferentes. </li><li> Veículo alíquota para as cavidades da coluna 12 na placa de fármaco. NOTA: Este irá facilitar os testes de controlo do veículo para baixo colunas em adição ao teste ao longo fila H, assegurando desse veículo é testado em posições representativas de toda a placa. NOTA: Cada placa de drogas para o rastreio de confirmação contém uma série de diluição para um máximo de 11 diferentes drogas a serem testadas mais o controlo do veículo. </li><li> Rótulo e placa de vedação, cubra com papel alumínio e coloque a -20 ° C até serem necessárias. </li></ol> 3. Experimentos Nematóides NOTA: Realizar todas as etapas under condições estéreis, assepticamente e com pré esterilizado materiais e reagentes. Manter C. elegans estirpes rotineiramente em placas NGM com E. 12 coli OP50. timings sugerido para as diferentes etapas do protocolo são apresentados na Tabela 1. <ol><li> Dia 1 de tarefas: configurar cultura líquida de biossensor tensão para sincronização subseqüente. <ol><li> Tome-se nemátodes de uma placa NGM 6 centímetros (com abundância de larvas jovens onde a comida acaba de correr para fora) em 2 mL S completa e transferir para balão com 30 g / L E. coli OP50 em S completo (volume total de 30 ml em um balão de vidro cónico de 250 ml de capacidade). Incubar 3 dias a 20 ° C, 160 rpm. </li></ol></li><li> Dia 4 de tarefas (permitir que cerca de 30-35 min): cultura lixívia para colher os ovos e sincronizar população worm. Realizar todos os passos de centrifugação durante 1 min, 600 x g. <ol><li> Prepare solução de água sanitária imediatamente antes da utilização: para cada 16 ml de 0,156 M KOH / NaOH adicione 4 ml de lixívia. </li><li> Despeje 2 x 14 mlcultura verme em 15 ml tubos de centrifugação cónicos. Permitir vermes para resolver pela força da gravidade (3 min). Remova e descarte nematóides acima liquidados líquidos. Adicionar 5 ml de solução de água sanitária para cada tubo e iniciar o temporizador. Combine volumes em um tubo. </li><li> Inverta tubo suavemente durante 2 min, verificar sob estereoscópio para a quebra de vermes e a liberação de ovos em suspensão. Quando a maioria de ovos são liberados ou em um tempo máximo de 2 minutos na solução de água sanitária, centrífuga. </li><li> Remover o sobrenadante cuidadosamente. Lave 1x de pelotização com 14 ml S completa e centrifugar. </li><li> Elimine o sobrenadante, adicionar solução de água sanitária 10 ml e iniciar o temporizador (esta segunda etapa de branqueamento garante que a maior parte das carcaças do sem-fim se desintegrar e já não são vistos sob estereoscópio). Depois de um tempo máximo em solução de água sanitária de 2 min, centrífuga. </li><li> Lavar 3x pellet em S completa, decantar cuidadosamente sobrenadante e ressuspender sedimento em 14 ml S completos após cada centrifugação. Após lavagem final, ressuspender pellet ovo em 14 ml S complete. </li><li> Transferir o volume para um frasco de vidro cónico. Incubar 18-24 h a 20 ° C, 160 rpm. NOTA: Colhida ovos eclodem O / N e prender o desenvolvimento na primeira fase larval (L1) devido à falta de comida, portanto, todos eles vão estar no mesmo estágio de crescimento. </li></ol></li><li> Dia 5 de tarefas: configurar culturas vermes sincronizados para ensaios de drogas. NOTA: Worms suspensas em meio de privação tendem a aderir às superfícies plásticas hidrofóbicas, tais como as pontas das pipetas e tubos. 0,01% Tween-20, um agente tensioactivo é utilizado aqui para tornar as superfícies de plástico mais hidrofílico e permitir uma maior precisão na contagem (0,01% de Triton-X100 também pode ser utilizado). Quando nematóides estão no meio suplementado bacteriana, eles não tendem a ficar com plástico. <ol><li> Determinar o número de eclodidos L1 do em balão, balão de manter em plataforma de agitação (160 rpm). <ol><li> Tome 3x 100 amostras ul da garrafa (use uma ponta limpa de cada vez) em 1,7 ml separados microtubos com 900 ul líquido medium 0,01% de Tween-20. NOTA: Aspire amostra de 100 mL na ponta limpo apenas uma vez. Então, quando a distribuição, pipeta cima e para baixo algumas vezes para o meio tween suplementado para liberar quaisquer vermes que aderiram à ponta. </li><li> Conte os nematóides em 4x 10 gotas ul de cada tubo de diluição triplicado. Calcular o valor médio e estimar o número de vermes presentes no frasco de vidro cônico. </li></ol></li><li> Calcule o volume de suspensão de nematóides chocado necessário para configurar uma cultura ml 2 x 20 com 10 nemátodos por 10 jul. Aumentar o volume calculado em 10% a conta para alguma perda nematóide subsequente durante passos de centrifugação. </li><li> Decantar o volume necessário em 2 x 15 ml tubos de centrifugação (pré-pesado). Pesar os tubos para se obter o volume real dispensado, vortex suavemente e ajustar a meta de volume, removendo o excesso de volume com uma pipeta de 5 ml (apenas a ponta estéril deve entrar no tubo). </li><li> Faça o volume para 14 ml com S frescos completos a erah nematóides. Centrífuga (1 min, 600 g). Retire e elimine o sobrenadante com cuidado para não perturbar o pellet nematóide. </li><li> Adicionar 5 ml de S completo com 30 g / L de E. coli OP50 a nematóides peletizadas. Transferir os 5 ml em cada tubo para um frasco de vidro cónico contendo 15 ml S completo com 30 g / L de E. coli OP50. Anote nematóides tempo foram primeiro fornecidos com alimentos. </li><li> Agite suavemente frasco (160 rpm), tome 9 x 10 gotas ul em lâminas microscópicas (use dicas frescos cada vez) para contar nematóides e confirmar média de cerca de 10 (± 2) por 10 ul. </li><li> Coloque frascos de nematóides em agitação incubadora a 20 ° C, 160 rpm durante 42-44 horas. </li></ol></li><li> Dia 7 tarefa: nematóides de transferência para placas de 96 poços e iniciar a exposição ao medicamento. <ol><li> Combinar culturas de nematóides em um único frasco, manter rodando frasco delicadamente e coloque 3 x 4 ml de cultura nematóide em uma calha de 60 ml estéril. Coloque calha em uma plataforma de agitação (160 rpm). </li><li> Use 8 chanNel de pipeta 25 ul alíquota nemátodos suspensos por poço de placas de microtitulação de 96 poços pretas com fundo transparente plana (para tirar ambas as leituras de luminescência e de fluorescência, ou luminescência para placas brancas apenas). Cubra com placa da tampa e reserve. <ol><li> Depois de configurar a cada 2 placas, coloque mais 2 x 2,5 ml nematóides na calha para substituir o volume perdido (manter um &quot;volume morto&quot; na calha de aproximadamente 7 ml). </li><li> Configure 13/14 placas com nematóides. 11 placas de nematóides serão necessários para testar duas placas de drogas de 96 poços. A placa 12 de nemátodo será carregado exclusivamente com veículo como controlo. A 13 de placa será usado para estabelecer a fluorescência de fundo no dia 8 (ver abaixo). Uma placa extra pode ser preparado para uso deve ocorrer erros durante a configuração. </li></ol></li><li> Alíquota 74 ul de S completas a cada poço e colocar a placa em uma câmara úmida (ver lista de materiais) em uma incubadora de agitação (20 ° C, 160 rpm) untIL pronto para compostos de teste alíquota no tempo de desenvolvimento pré-seleccionada (por exemplo, 45 h 30 min após a alimentação fornecida). [Volume por poço é agora 99 ul]. </li><li> Descongelar placa (s) droga para teste. </li><li> Use pipeta multicanal para configurar placas de nematóides com drogas, trocando as pontas de cada vez. Permitir 5 minutos por placa de 96 poços de alíquotas de drogas. <ol><li> Tomar 1 ml de uma coluna st da placa de drogas e adicionar colunas 1-5 de uma placa contendo nematóides; repita a partir do 2 nd coluna na placa de droga em colunas 8-12 da placa contendo nematóides. Adicionar 1 ml de veículo para colunas 6 e 7 da placa de nematóide. NOTA: O volume total por poço na placa de nemátodo é 100 ul resultando em uma diluição de 1: 100 de composto / veículo. </li><li> Repita processo por adição de 1 ul de o 3 rd / 4 th coluna da placa de fármaco às colunas 1-5 / 8-12 da segunda placa de nemátodos; adicionar veículo para colunas 6 e 7 da placa de nematóide.</li><li> Continuar a testar colunas de pratos de drogas restantes. Configurar um mínimo de uma placa nematóide com o veículo em todos os poços, por amostragem, da coluna 12 da placa de drogas. Coloque placas traseiras em câmaras úmidas em agitação incubadora (20 ° C, 160 rpm) durante 20-22 horas (ver nota para o dia 8). </li></ol></li><li> Parte-se preparar o tampão de luminescência por dia seguinte: adiciona-se DMSO e 10% de Triton-X-100 para o volume necessário de S completa para se obter 1% de DMSO e 0,15% de Triton X-100. Permitir 5 ml por placa de leitura de luminescência, mais 1 ml para priming luminometer injector. </li></ol></li><li> Dia 8 de tarefas: Leia endpoints experimentais - fluorescência e bioluminescência. (Leituras de fluorescência de GFP são recomendadas como um meio para normalizar os dados de bioluminescência.) NOTA: Aponte para ler endpoints por 66-67 horas após a alimentação fornecida aos nematóides, a fim de evitar a produção de progênie significativa nas condições experimentais descritas. <ol><li> Configurar placa ao uso como controle de fundo para as leituras de GFP. Combine bem conteúdo dos 13 th placa em um tubo de 15 ml. Permitir nematóides para resolver (2-3 min). Use sobrenadante para carregar uma microplaca (preto com fundo transparente) com 100 suspensão bacteriana ul por poço. <ol><li> Observe fundo placa de controle sob o microscópio anotando poços onde os nematóides podem ser vistos. Excluir estes a partir da estimativa de fundo usada na análise de dados subsequente. </li></ol></li><li> Ler a fluorescência de cada placa de 96 poços, incluindo o controle de fundo. (Configurações: sistema ótico de fundo da placa; filtros 485/20 excitação; emissão 528/20). </li><li> Preparar tampão para leituras de luminescência: adiciona luciferina (20 mM) de co-preparado tampão (a partir do dia anterior), para se obter tampão de luminescência com 1% de DMSO (1x), 0,15% de Triton-X100 (3x) e 0,3 luciferina mM (3x ). Primeiro luminómetro injector 6x com 150 ul de tampão de luminescência. <ol><li> Etapa anterior assume 1% DMSO como veículo durante a exposição à droga. Quando o veículo é água, ajustar o concentration de DMSO em tampão de luminescência a 3% (isto é, 3x). </li></ol></li><li> Trabalhar com uma placa de cada vez. Dispensar tampão 50 ul por poço de luminescência. (150 mL de volume final em bem; 3x diluição de tampão luminescência: DMSO 1%, 0,05% Triton-X100 e 0,1 mM concentrações luciferina finais). Coloque imediatamente na plataforma de agitação e iniciar o temporizador. <ol><li> Após 3 min em plataforma de agitação (160 rpm), leia luminescência (1 seg por medição). </li></ol></li></ol></li></ol> Análise 4. Dados <ol><li> Subtrair fundo GFP média dos resultados de leitura de fluorescência. Divida bioluminescência pela respectiva leitura GFP. <ol><li> Quando um valor elevado de GFP é detectado por nemátodos expostos a um composto, medir a fluorescência do composto por si próprio em conta qualquer fluorescência do composto. Se superior à média, usar isso como plano de fundo em vez disso. </li></ol></li><li> Bioluminescência expresso, um GFP normalizada bioluminescênciand dados de fluorescência de GFP como uma percentagem do valor médio de controlo de veículo em cada placa. </li><li> Traçar os valores médios e as barras de erro para cada concentração. </li><li> Teste de significância estatística usando 2-way análise de variância (ANOVA) com efeitos de &#39;concentração&#39;, &#39;Experiment&#39; e sua interação (cada ponto de dados refere-se a um único poço), e usar o teste de Dunnett como teste post-hoc (vs . controle do veículo). NOTA: Se o &quot;experimento&quot; ou os termos &quot;interação&quot; são significativos, novos experimentos podem ser necessárias para confirmar a resposta. Onde há variabilidade entre os experimentos resulta da observação dos gráficos de dados, um One-way ANOVA pode ser realizada em dados obtidos a partir de experimentos independentes. <ol><li> Para a análise estatística da placa (s) apenas com veículo, seleccione todos os poços em colunas 6 -7 e todos os poços na fila H como grupo controle (estas são as posições rotineiramente atribuídos ao veículo durante o teste composto). </li&gt; </ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lagido, C., Pettitt, J., Flett, A., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+the+phenotypic+gap:+real-time+assessment+of+mitochondrial+function+and+metabolism+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Bridging the phenotypic gap: real-time assessment of mitochondrial function and metabolism of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> BMC Physiol. 8, 7 (2008).</li><li>Lagido, C., McLaggan, D., Flett, A., Pettitt, J., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+sublethal+toxicity+assessment+using+bioluminescent+Caenorhabditis+elegans,+a+novel+whole-animal+metabolic+biosensor.">Rapid sublethal toxicity assessment using bioluminescent Caenorhabditis elegans, a novel whole-animal metabolic biosensor.</a> Toxicol Sci. 109, 88-95 (2009).</li><li>McLaggan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sublethal+levels+of+environmental+pollutants+found+in+sewage+sludge+on+a+novel+Caenorhabditis+elegans+model+biosensor.">Impact of sublethal levels of environmental pollutants found in sewage sludge on a novel Caenorhabditis elegans model biosensor.</a> PloS one. 7, e46503 (2012).</li><li>Rodriguez-Enriquez, S., Juarez, O., Rodriguez-Zavala, J. S., Moreno-Sanchez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisite+control+of+the+Crabtree+effect+in+ascites+hepatoma+cells.">Multisite control of the Crabtree effect in ascites hepatoma cells.</a> Eur J Biochem. 268, 2512-2519 (2001).</li><li>Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+the+Crabtree+effect:+replacing+media+glucose+with+galactose+increases+susceptibility+of+HepG2+cells+to+mitochondrial+toxicants.">Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants.</a> Toxicol Sci. 97, 539-547 (2007).</li><li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+5'-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans.">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).</li><li>Bodhicharla, R., Ryde, I. T., Prasad, G. L., Meyer, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tobacco-specific+nitrosamine+4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone+(NNK)+induces+mitochondrial+and+nuclear+DNA+damage+in+Caenorhabditis+elegans.">The tobacco-specific nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) induces mitochondrial and nuclear DNA damage in Caenorhabditis elegans.</a> Environ Mol Mutagen. 55, 43-50 (2014).</li><li>Leung, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+early+life+exposure+to+ultraviolet+C+radiation+on+mitochondrial+DNA+content,+transcription,+ATP+production,+and+oxygen+consumption+in+developing+Caenorhabditis+elegans.">Effects of early life exposure to ultraviolet C radiation on mitochondrial DNA content, transcription, ATP production, and oxygen consumption in developing Caenorhabditis elegans.</a> BMC Pharmacol Toxicol. 14, 9 (2013).</li><li>Kuang, J. J., Ebert, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+failure+to+extend+lifespan+via+disruption+of+complex+II+is+linked+to+preservation+of+dynamic+control+of+energy+metabolism.">The failure to extend lifespan via disruption of complex II is linked to preservation of dynamic control of energy metabolism.</a> Mitochondrion. 12, 280-287 (2012).</li><li>Lagido, C., Pettitt, J., Porter, A. J., Paton, G. I., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+bioluminescent+Caenorhabditis+elegans+as+multicellular+eukaryotic+biosensors.">Development and application of bioluminescent Caenorhabditis elegans as multicellular eukaryotic biosensors.</a> FEBS Lett. 493, 36-39 (2001).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Brenk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+learnt+from+assembling+screening+libraries+for+drug+discovery+for+neglected+diseases.">Lessons learnt from assembling screening libraries for drug discovery for neglected diseases.</a> ChemMedChem. 3, 435-444 (2008).</li><li>Lagido, C., Wilson, M. J., Kakouli-Duarte, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nematodes as environmental indicators. , 225-251 (2009).</li><li>Thorne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+in+chemical+biology:+a+compendium+of+inhibitors,+mechanistic+evaluation+of+chemotypes,+and+suggested+use+as+a+reporter.">Firefly luciferase in chemical biology: a compendium of inhibitors, mechanistic evaluation of chemotypes, and suggested use as a reporter.</a> Chem Biol. 19, 1060-1072 (2012).</li><li>Houtkooper, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitonuclear+protein+imbalance+as+a+conserved+longevity+mechanism.">Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism.</a> Nature. 497, 451-457 (2013).</li><li>Andreux, P. A., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+approaches+to+restore+mitochondrial+function.">Pharmacological approaches to restore mitochondrial function.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 465-483 (2013).</li><li>Tsang, W. Y., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+genome+content+is+regulated+during+nematode+development.">Mitochondrial genome content is regulated during nematode development.</a> Biochem Bioph Res Co. 291, 8-16 (2002).</li><li>Decuyper, C., Vanfleteren, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-Consumption+during+Development+and+Aging+of+the+Nematode+Caenorhabditis-Elegans.">Oxygen-Consumption during Development and Aging of the Nematode Caenorhabditis-Elegans.</a> Comp Biochem Phys A. 73, 283-289 (1982).</li><li>Dillin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+behavior+and+aging+specified+by+mitochondrial+function+during+development.">Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development.</a> Science. 298, 2398-2401 (2002).</li><li>Zheng, S. Q., Ding, A. J., Li, G. P., Wu, G. S., Luo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+absorption+efficiency+in+Caenorhbditis+elegans+delivered+by+different+methods.">Drug absorption efficiency in Caenorhbditis elegans delivered by different methods.</a> PloS one. 8, e56877 (2013).</li><li>Yochem, J., Gu, T., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+marker+for+mosaic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans+indicates+a+fusion+between+hyp6+and+hyp7,+two+major+components+of+the+hypodermis.">A new marker for mosaic analysis in Caenorhabditis elegans indicates a fusion between hyp6 and hyp7, two major components of the hypodermis.</a> Genetics. 149, 1323-1334 (1998).</li><li>Vanfleteren, J. R., DeVreese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+aerobic+metabolism+and+superoxide+production+rate+potential+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Rate of aerobic metabolism and superoxide production rate potential in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> J Exp Zool. 274, 93-100 (1996).</li><li>Garigan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans:+a+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation.">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161, 1101-1112 (2002).</li><li>Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+affects+the+identification+of+metabolic+responses+to+daf-2+status+in+Caenorhabditis+elegans.">Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans.</a> Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).</li><li>Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+glycosyltransferase+BUS-8+has+two+distinct+and+essential+roles+in+epidermal+morphogenesis.">The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis.</a> Dev Biol. 317, 549-559 (2008).</li><li>Castro, P. V., Khare, S., Young, B. D., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+Battling+Starvation+Stress:+Low+Levels+of+Ethanol+Prolong+Lifespan+in+L1+Larvae.">Caenorhabditis elegans Battling Starvation Stress: Low Levels of Ethanol Prolong Lifespan in L1 Larvae.</a> PloS one. 7, (2012).</li><li>Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+Grow+or+Not+to+Grow:+Nutritional+Control+of+Development+During+Caenorhabditis+elegans+L1+Arrest.">To Grow or Not to Grow: Nutritional Control of Development During Caenorhabditis elegans L1 Arrest.</a> Genetics. 194, 539-555 (2013).</li><li>Baugh, L. R., DeModena, J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Pol+II+Accumulates+at+Promoters+of+Growth+Genes+During+Developmental+Arrest.">RNA Pol II Accumulates at Promoters of Growth Genes During Developmental Arrest.</a> Science. 324, 92-94 (2009).</li><li>Maxwell, C. S., Antoshechkin, I., Kurhanewicz, N., Belsky, J. A., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+control+of+mRNA+isoform+expression+during+developmental+arrest+and+recovery+in+C.+elegans.">Nutritional control of mRNA isoform expression during developmental arrest and recovery in C. elegans.</a> Genome Res. 22, 1920-1929 (2012).</li><li>Cressman, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+toxicants+for+toxicity+testing+using+Caenorhabditis+elegans+in+aquatic+media.">Reference toxicants for toxicity testing using Caenorhabditis elegans in aquatic media.</a> Am Soc Test Mater. 131, 518-532 (1997).</li><li>Khanna, N., Cressman, C. P., Tatara, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+to+pH,+salinity,+and+hardness+in+aquatic+media.">Tolerance of the nematode Caenorhabditis elegans to pH, salinity, and hardness in aquatic media.</a> Arch Environ Con Tox. 32, 110-114 (1997).</li><li>Benedetti, C., Haynes, C. M., Yang, Y., Harding, H. P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+5+positively+regulates+chaperone+gene+expression+in+the+mitochondrial+unfolded+protein+response.">Ubiquitin-like protein 5 positively regulates chaperone gene expression in the mitochondrial unfolded protein response.</a> Genetics. 174, 229-239 (2006).</li><li>Yang, W., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mitochondrial+Superoxide+Signal+Triggers+Increased+Longevity+in+Caenorhabditis+elegans.">A Mitochondrial Superoxide Signal Triggers Increased Longevity in Caenorhabditis elegans.</a> Plos Biol. 8, (2010).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar

O organismo modelo C. elegans fornece um poderoso sistema experimental. É fácil de cultura abundante e produz progenia geneticamente idênticos, com um ciclo de vida do dia 3,5 de ovo a reprodução de adulto (através de estágios larvais juvenis através L1 a L4). Devido ao seu pequeno tamanho, pode ser convenientemente cultivadas em placas de 96 poços, o que facilita a triagem composto. Nós apresentamos um protocolo de triagem fenotípica com base em cepas de C. elegans que actuam como sensores in vivo dos níveis de energia 14 O protocolo. é aplicável a qualquer laboratório, embora seja necessário um luminómetro de placas de 96 poços e um armário estéril. É importante evitar a contaminação em ensaios usando boa técnica laboratorial. Se trabalhar manualmente, o número máximo de placas de nematóides atingível é de 13 por experimento permitindo o teste de 2 x placas de 96 poços e de drogas incluindo duas placas de veículos. Os resultados representativos são apresentados para o complexo mitocondrial I inibidor rotenone, o paraquat gerador de superóxido, o oxaloacetato intermediário ciclo de ácido cítrico e quatro compostos com conhecida atividade inibitória da luciferase do pirilampo. Os primeiros dois compostos conduziu a um decréscimo na bioluminescência como previsto oxaloacetato Considerando que conduziu a uma melhoria, podem resultar de uma maior geração de ATP. Os conjuntos de dados oxaloacetato também demonstram a variabilidade intrínseca em experiências com base na luciferase do pirilampo como um repórter. Um mínimo de três experiências independentes são aconselháveis ​​para determinar a robustez das respostas aos compostos desconhecidos. A inibição da actividade da luciferase do pirilampo foi identificável com um ensaio in vitro utilizando um kit comercial. 3 Um dos compostos resultou num aumento substancial da fluorescência da GFP consistente com o inibidor de aumentar os níveis de luciferase de pirilampo pela ligação à enzima luciferase do activo marcado com GFP local, e tornando-o mais estável. 15 Em alguns casos(não, neste caso particular), o que pode levar ao aumento dos níveis de bioluminescência quando o inibidor é deslocada por um excesso de substrato. 15 É, portanto, importante não interpretar os resultados erradamente a partir de compostos que interagem com a enzima de pirilampo como níveis de ATP diminuída ou aumentada / função mitocondrial. As alterações no sinal de luminescência muitas vezes se correlacionam com as medições adicionais de saúde, tais como movimento, crescimento e desenvolvimento. Como um exemplo, um composto é um inibidor da luciferase suspeito se um declínio dramático do sinal de bioluminescência é detectado mas os vermes são indistinguíveis dos controlos por observação microscópica. Um aumento na fluorescência da GFP, não explicado pelo crescimento ou autofluorescência composto, também pode apontar para um inibidor. Uma série de inibidores da luciferase 15 são conhecidos e foram celebrados PubChem. Portanto, em primeira instância, é uma boa prática de consultar informações sobre os inibidores da luciferase detidas por PubChem; seguido por tressante os efeitos de compostos em ensaios in vitro com a enzima purificada, 3 e / ou a confirmação de efeitos sobre a função mitocondrial por meios adicionais. 16,17 Medições de fluorescência da GFP permitir a detecção de níveis de luciferase de pirilampo (ea detecção potencial de alguns inibidores da enzima luciferase, como discutido acima) fazendo um forte argumento para a medição deste parâmetro ao lado de bioluminescência sempre que possível. A normalização das leituras bioluminescência a GFP é também um meio de contabilizar variações no número de vermes entre poços (embora isto também pode ser conseguido pela inclusão de múltiplas repetições técnicas). Para uma maior sensibilidade, é importante para subtrair a fluorescência de fundo de leitura. O protocolo avalia contribuição da suspensão bacteriana para a fluorescência de fundo, no entanto nemátodo autofluorescência não é contabilizada (uma limitação do ensaio corrente, particularmente crítico para qualquer Stu envelhecimentomorre dado que nematóide autofluorescência aumenta com a idade). Autofluorescência de compostos de teste também deve ser avaliada em paralelo. GFP normalização pareceria indispensável quando investigadores deseja adaptar o protocolo para comparar piscinas de ATP celular em diferentes mutantes genéticos ou após o silenciamento de genes diferentes, a fim de controlar para quaisquer diferenças de tensão ao nível de expressão do transgene bioluminescência. Os parâmetros críticos dentro do protocolo de incluir a fase de desenvolvimento em que a exposição é iniciada, a duração da exposição, e a obtenção de um número semelhante de nemátodos nos diferentes poços. A exposição pode começar em qualquer fase de desenvolvimento dos nematóides, no entanto fase L3 ou mais é preferível. A partir dessa etapa, nematóides depender de fosforilação oxidativa para o desenvolvimento até a idade adulta, como evidenciado por um aumento muito significativo no teor de mtDNA, consumo de oxigênio e níveis de ATP. 18,19,20 O presente protocolo inicia exposure no estádio L4. A razão para alíquotas nemátodos para placas de 96 poços apenas nesta fase (ao invés do que quando eles foram em primeiro lugar dotado de comida na fase L1), é que, embora as placas são colocadas em câmaras húmidas para minimizar a evaporação, um grau de evaporação ainda ocorre em nossa incubadora de agitação, vista como muito pequenas gotículas que formam nas tampas (isto pode não ser um problema com outras incubadoras agitação). Por nemátodos alíquotas para placas imediatamente antes da adição de padrões de droga, a concentração efectiva da droga não é afectada por qualquer variação pequena no volume devido a evaporação. Carregando uma placa com nematóide veículo só é útil para verificar se os nematóides foram distribuídos uniformemente entre os poços. Não existem diferenças significativas para o veículo só placa seria indicativo de má técnica na distribuição dos nematóides aos poços. A duração da exposição é um fator importante a considerar. Se os efeitos sobre o estado de energia de forma independente do crescimento são de interesse, o proprotocolo pode ser modificado para acomodar exposições mais curtas (de respostas quase imediatos para, por exemplo, 2 horas). Por outro lado, a entrada de compostos em C. tecidos elegans pode levar algum tempo. Por exemplo são necessárias 12-24 horas para atingir as concentrações máximas internas do resveratrol e 5-fluoro-2&#39;-desoxiuridina (FUdR). 21 Por conseguinte, uma exposição mais longa (18 a 24 horas) pode ser justificada para maximizar os níveis de exposição. O tempo de exposição deve ser limitado aos tempos que não permitem níveis significativos de reprodução para tomar lugar no poço. Recomendamos que o tempo total de desenvolvimento de nematóides é mantida sob 66-67 h. Embora conveniente, nematóides estão grávidas até lá e deram início a oviposição. No entanto descobrimos leituras bioluminescência preparações de ovo a ser insignificante (não mostrado). O sur-5 promotor impulsionado expressão do transgene é primeiro detectada apenas 2-2 horas e meia após a fertilização na fase 100 célula 22 e a ccasca de ovo hitinous é susceptível de limitar a entrada de luciferina. Outros descobriram que os ovos embrionados não contribuem significativamente para o metabolismo dos adultos grávidos. 23 No entanto, as condições que permitem a produção de descendência significativo, devem ser evitados. Se preferir, a escala de tempo experimental pode ser deslocado de volta: nós já iniciou a exposição a uma toxina ambiental na tarde L3 fase larval (36 h) e realizado bioluminescência e GFP medições a 55 hr 2 fundos alternativa, genéticas que são condicionalmente estéril. pode ser usado para evitar a produção de descendência, como por exemplo o fer-15 (B16) II; Fem-1 (hc17) IV mutante duplo que pode ser mantida a 15 ° C, mas é estéril a 25 ° C. 24 A utilização de FUDR para induzir a esterilidade não é recomendada como este pode, por si só afecta o metabolismo de nemátodos. 25 O ensaio pode também ser realizada em estirpes com cutículas mais permeáveis, tais como perda parcial-do-functião barramento-8 mutantes que são devidos a aumento da permeabilidade de drogas sensíveis a fármacos múltiplos. 26 Isto irá facilitar a exposições mais curtas e baixas concentrações de composto. As condições para a adição de luciferina a estes nemátodos podem também precisam de ajuste ou seja, 1% DMSO e 0,05% de Triton-X100 no buffer de luminescência pode não ser necessária para aumentar a disponibilidade luciferina. O protocolo usa 1% de DMSO como veículo para a entrega do composto. Embora não letal, esta concentração de DMSO tem alguns efeitos biológicos como já discutido na publicação anterior. 3 Muitas das bibliotecas de medicamentos disponíveis são preparadas em 100% de DMSO, em concentrações que serão adequados para os ensaios baseados em células, após a diluição de veículo a 0,1%. Concentrações de composto mais elevados são necessários para induzir respostas em C. elegans quando comparado com células de origem humana, de tal modo que muitas vezes não é possível realizar ensaios em menor do que 1% de DMSO. Mais uma vez, a utilização de estirpes comcutículas mais permeáveis ​​podem levar a testes com concentrações mais baixas de veículo. As concentrações de DMSO de 1% mais elevada do que não são recomendados. Um tempo de incubação conjunto com luciferina antes de leituras devem ser respeitados. Como foi mostrado anteriormente, luminescência atinge seus níveis máximos no segundo minuto após a adição de luciferina, permanecendo relativamente estável para o primeiro 5 min, seguido por uma diminuição gradual lento na luminescência ao longo do próximo 30 min 1. Respostas cinéticas para uma determinada substância química pode ser levada a cabo durante esta etapa inicial de 30 minutos após a distribuição inicial da luciferina. O protocolo envolve um passo de fome após a coleta de ovos para conseguir a sincronização da população do nematóide. Recomendamos sincronização de populações de nemátodos de teste uma vez que diferentes estágios de desenvolvimento diferem nos níveis de ATP celular e pode responder de forma diferente para os compostos de teste. Ao realizar a fome no S completomédio, por oposição a M9, os nemátodos incubação são fornecidos com uma fonte de carbono (etanol), de modo que as larvas não se desenvolvem, mas não são completamente fome 27,28. Também tem sido demonstrado que são presos L1 do preparado de resposta rápida ao alimento e L1 taxa de crescimento normal é alcançado dentro de 3 h após o alimento fique disponível. 29 No entanto, a possibilidade de que o passo de jejum pode alterar o metabolismo de C. elegans não pode ser excluída. 30 Por esta razão, o comprimento de fome não deve ser superior a 24 horas (18 horas é suficiente para sincronização). Alguns laboratórios podem ter a possibilidade de utilizar uma Copas Biosorter para sincronização de idade ignorando o passo fome completamente. Outros laboratórios podem ter uma preferência para a expansão da população de nematóides em meio sólido (placas NGM com OP50) antes do branqueamento (passo 3.1) e isso vai funcionar muito bem. Nós usamos meio S durante a exposição composto como um meio padrão para nematóide cultura, however outros meios de comunicação pode ser seleccionado, por exemplo K médio ou EPA moderadamente água dura são frequentemente utilizados para estudos ecotoxicológicos 31,32. O protocolo proporciona um meio para rastrear e identificar candidatos para análises adicionais em termos dos efeitos sobre a função mitocondrial. Na fase de rastreio primário, é provável que alguns compostos que foram perdidas devido a uma única concentração a ser testada, por conseguinte, telas de drogas não deve ser considerada exaustiva. Visitas podem ser validados pelo uso de técnicas para avaliar diferentes aspectos da função mitocondrial por exemplo o consumo de oxigénio, C. elegans com estirpes expressando GFP mitocôndrias, manchas de potencial de membrana mitocondrial e / ou medições de ROS. 16,33,34 A maior importância da metodologia é ter um meio para o rastreio de grande número de compostos e / ou condições ao nível do organismo multicelular, e mais importante, de ser capaz de tirar vantagem do the tratabilidade genética de C. elegans para investigar os mecanismos de ação. A técnica pode ajudar a acelerar e encontrar novos caminhos para a descoberta de compostos e alvos interessantes. Prevê-se que a combinação do sensor com fundos genéticos associados à doença humana para o rastreio de bibliotecas de compostos, num contexto em causa doença terá muito a oferecer.

O objetivo geral deste procedimento é a rápida quantificação do status de energia do C. elegans in vivo, com vista a utilizar este como um ponto final na triagem composto. A base racional é com base na expressão transgénica da luciferase de pirilampo, no nemátodo C. elegans 1-3 através do plasmídeo pSLGCV (1 <a href="https://www.addgene.org/49862" target="_blank">https://www.addgene.org/49862).</a> A enzima luciferase é fundida com a proteína fluorescente verde GFP e é expressa constitutivamente e ubiquamente no citoplasma (o sinal de direccionamento de peroxissoma luciferase foi removido). Isto conduz a emissão de luz, quando o substrato luciferina é fornecido exogenamente. À medida que o sem-fim é transparente, a luz pode ser medida num luminómetro como unidades relativas de luz (RLU). Combustíveis de ATP celular a reacção de bioluminescência e a sua disponibilidade determina os níveis de luz produzidos. Consequentemente, luminometria oferece uma convenient meios de avaliar os níveis relativos de ATP e função mitocondrial por extensão, uma vez que a produção de ATP ocorre principalmente nas mitocôndrias. A relação entre os níveis de função e bioluminescência mitocondriais tem sido demonstrada previamente através do silenciamento dos genes da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial e concomitante redução da produção de luz. 1 As cepas bioluminescência gerados foram designados PE254 (feIs4) e PE255 (feIs5) 1 (ver lista de materiais) e podem ser utilizados indiferentemente. 3 Um número de estudos foram utilizadas essas estirpes de sensores para informar sobre os níveis de ATP celular in vivo a seguir a exposição a vários produtos químicos xenobióticos tais como azida de sódio 1, cádmio 2, esgoto extracto de lamas 3, 5&#39;-f luoro-2-desoxiuridina 6, e uma nitrosamina específica do tabaco 7. As cepas também têm sido úteis para monitorizar os efeitos da exposição à radiação ultravioleta C <saté&gt; 8 e efeitos de perturbar a função da cadeia respiratória mitocondrial. 1,9 Uma primeira versão do sensor de luminescência que expressa o gene da luciferase sem uma fusão GFP (PE39) também tem sido utilizada na investigação dos efeitos de metais pesados ​​e de um respiratória . 10 Cepas PE254 PE255 e desacoplador levar a luciferase: GFP fusão e fluorescência da GFP foi mostrado para aumentar proporcionalmente com massa nematóide, oferecendo um meio conveniente para a normalização dos valores de luminescência 6,9 Os efeitos do montante diferencial de vermes por poço também pode ser. tidas em conta, incluindo várias repetições técnicas no ensaio (um mínimo de 5 poços por condição). 3 O protocolo oferece a possibilidade de monitorização in vivo dos níveis de energia (em oposição a mais tecnicamente laboriosa determinações in vitro de ATP), que permite rastreio de compostos e reposicionamento no contexto fisiológico de um mu inteirolticellular organismo. O procedimento pode ser estendido para uma variedade de origens genéticas, atravessando o transgene cromossomicamente integrados em cepas mutantes disponíveis e / ou por silenciar genes por RNA de interferência; Assim, aproveitando ao máximo C. elegans como organismo modelo. O método deve ajudar a reduzir a falta de fase tardia de candidatos a medicamentos devido à toxicidade mitocondrial e fazer uma contribuição para a redução de maior experimentação animal.

<table><tbody><tr><td>Orion II Microplate Luminometer</td><td>Berthold Detection Systems</td><td></td><td>with injector and the Simplicity 4.2 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement</td></tr><tr><td>FLx800 fluorimeter&amp;nbsp;</td><td>Biotek</td><td></td><td>with Gen5 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement</td></tr><tr><td>Ks 130 basic shaking platform</td><td>Ika</td><td>#0002980000</td><td></td></tr><tr><td>Innova 4349</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>Refrigerated incubator shaker</td></tr><tr><td>Eppendorf centrifuge 5804R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>with eppendorf rotor A-4-44&amp;nbsp; (for 50/15&amp;#160;ml tubes)</td></tr><tr><td>Stripette, Costar</td><td>Corning</td><td>#4489</td><td>Serological pipette</td></tr><tr><td>Cellstar 50 ml tubes</td><td>Greiner bio-one</td><td>#227661</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar 15 ml tubes</td><td>Greiner bio-one</td><td>#188261</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar 60 mm tissue culture plates&amp;nbsp;</td><td>Greiner bio-one</td><td>#628160</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Microscope slides</td><td>VWR</td><td>#631-0909</td><td></td></tr><tr><td>Sterile spatula</td><td>Corning</td><td>#3007; #3004</td><td>for weighing out chemicals</td></tr><tr><td>0.22 mM Millex GP filters</td><td>Millipore</td><td>#SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Axygen eppendorf tubes 1.5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>#MCT-150-R</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 well assay plate</td><td>VWR</td><td>#3603</td><td>Black plate clear bottom with lid</td></tr><tr><td>Nunc 96 well assay plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>#236105</td><td>White plate with lid</td></tr><tr><td>Reservoir reagent 60 ml</td><td>Thermo Scientific Finnpipette</td><td>#9510027</td><td>used as trough for nematodes in protocol section 4.4.1</td></tr><tr><td>Storage box/damp chamber</td><td>Roche Diagnostics</td><td>#10 800 058 001</td><td>174 x 101 x 56.6 mm, used as a damp chamber with wet paper towels; 2x 96-well plates with lids can fit into one, the lower sitting on top of a microplate lid</td></tr><tr><td>Bleach: Sodium hypochlorite solution 4-4.99% Chlorine content</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#239305</td><td>Store in aliquots at 4&amp;#160;&amp;deg;C,&amp;nbsp; seal with Parafilm to prevent loss of chlorine and cover in foil</td></tr><tr><td>D-Luciferin, potassium salt</td><td>Biotium Inc</td><td># 10101-2</td><td>Molecular Probes can also be used as supplier; prepare a 20 mM stock in ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, keep at -20 &amp;deg;C in aliquots</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td># P9416</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>CalBiochem</td><td>#317275</td><td>Purity 99.99%</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Alfa Aesar</td><td>#A16046</td><td>Diltute to 10% in ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>CalBiochem</td><td>#475914</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; bioluminescent strains</td><td>Author&#039;s own laboratory</td><td>PE254, PE255</td><td>contain integrated arrays &lt;em&gt;feIs4&lt;/em&gt; and &lt;em&gt;feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)]&lt;/em&gt; respectively on chromossome V and X; select for homogeneous and strong expression of &lt;em&gt;luc::GFP&lt;/em&gt; by fluorescence microscopy (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; pick 15 worms) every now and then.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; OP50</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>General chemicals</td><td>Sigma Aldrich/Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a screenable in vivo assay for mitochondrial modulators using transgenic bioluminescent caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

Os resultados representativos para ilustrar o método foram obtidos para rotenona (Figura 1), o paraquat (Figura 2), o oxaloacetato (Figura 3), e 4 compostos que foram apanhados inibidores como luciferase de pirilampo durante o rastreio de uma biblioteca de medicamentos 13 (Figura 4). A exposição da droga foi iniciada na fase de L4 em todos os casos, mas os experimentos de exposição paraquat foram iniciadas em 41 horas após a primeira comida fornecida aos nematóides em comparação com 45-46 horas para os outros compostos. O protocolo permite um grau de flexibilidade na selecção de tempo para o início da exposição ao fármaco e a duração da exposição. No entanto, para fins de rastreio, definir horários devem ser respeitados, uma vez selecionados, para a reprodutibilidade entre os experimentos. Endpoints deve ser medido por 66-67 hr tempo de desenvolvimento, a fim de evitar extensa postura de ovos para incubação e de progênie em poços. Diretrizes para horários são fornecidos em Tcapaz 1. Rotenona, um complexo mitocondrial I de inibidor, reduzida bioluminescência após ambas as exposições relativamente curtas (2 horas) e mais longo (24 horas) para uma gama de concentrações (Figura 1). Neste exemplo, as medições foram levadas GFP, mas o número de repetições técnicos utilizados (n = 6) é suficiente para uniformizar quaisquer diferenças nos números de vermes entre 3 poços. A exposição de 24 horas é uma janela de tempo durante o qual os nemátodos crescer, e desenvolvimento mais lento, como resultado da complexa inibição eu era esperado para contribuir para o declínio da bioluminescência. Isto foi confirmado por observação visual sob estereoscópio com desenvolvimento retardado visto, particularmente em concentrações de 20 ^ M e acima; Além disso, alguns letalidade foi observada a partir de 40? M (observações qualitativas não quantificada). Sem letalidade foi observada após a exposição 2 hr, mas efeitos sobre o movimento sem-fim foram vistos. Um declínio acentuado na bioluminescência em relação aos controles ocurred na concentração mais baixa testada de rotenona 2,5 uM, para os quais os efeitos não foram facilmente detectadas por observação visual rápida em 2 horas de exposição. Este declínio da bioluminescência é consistente com a redução do ATP celular. A inibição máxima foi alcançada com a concentração mais baixa de rotenona utilizado (2,5 uM), indicando que todas as experiências subsequentes destinadas especificamente às rotenona deve ser realizada entre 0 e 5 uM [na gama de concentrações 0-160 uM foi seleccionado como parte de uma comparação com outras drogas inicialmente identificado como tendo efeitos significativos em 10 mM (a ser publicado em outro lugar)]. O herbicida paraquat afeta a função mitocondrial por meio de aumento de espécies reativas de oxigênio. Aqui, demonstramos o seu efeito sobre a bioluminescência de C. elegans estirpe PE254 após exposição a uma gama de concentrações de 24 h (Figura 2). À medida que a tensão carrega uma luc :: fusão GFP, fluorescência da GFP foi alsO medidos como um meio de normalização. paraquat 6,9 diminuiu a bioluminescência, fluorescência da GFP e bioluminescência normalizada significativamente. O teste post-hoc Dunnet indicaram que as concentrações de paraquat com diferenças significativas em relação ao controlo do veículo foram 4 e 8 mm para a bioluminescência e bioluminescência normalizado, bem como 2 mM para bioluminescência normalizado. A única concentração reduzindo significativamente fluorescência da GFP foi 8 mm, uma concentração em que os efeitos do crescimento e do verme morto ocasionais foram vistos (observações qualitativas). O declínio na bioluminescência (e bioluminescência normalizado) foi maior do que a de fluorescência, consistente com uma diminuição da função mitocondrial e os efeitos sobre a produção de ATP. O oxaloacetato intermediário do ciclo do ácido cítrico testado em C. elegans estirpe PE254 numa concentração única de 8 mM, levou a um aumento da bioluminescência (Figura 3). Sem fluorescência da GFPNCE medições foram obtidas ou observação visual adicional realizado; no entanto, tais resposta a uma única operação de concentração merecem uma exposição de confirmação para uma gama de concentrações, e observações mais detalhadas sobre os efeitos. Um acessório de bioluminescência por este composto não é surpreendente, uma vez que pode ser postulada para levar a uma maior actividade do ciclo do ácido cítrico, com última análise, uma maior produção de ATP (no entanto, seria aconselhável controlar a quaisquer efeitos sobre os níveis de luciferase por meio da avaliação fluorescência da GFP em experiências subsequentes). Os conjuntos de dados oxaloacetato mostrado revelam o grau de variabilidade na resposta vista com base em experiências de luciferase. Em nossa experiência esta variabilidade é uma característica do sistema de teste particularmente para as condições de exposição menos prejudiciais. O compostos inibidores da luciferase do pirilampo DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 e DDD00023047 foram testadas in vitro vendo os efeitos sobre a puenzima rified e in vivo usando o C. elegans luc: GFP expressando tensão. Não houve evidências de que qualquer um dos compostos testados causou a morte de nemátodos sob as condições de exposição. Todos os 4 compostos afectou a actividade de luciferase in vitro para as concentrações testadas 2 25 e 100 uM (Figura 4A). DDD00001434 matou a actividade da luciferase purificada quase completamente, o que proporcionou uma justificação credível para o grande decréscimo na bioluminescência in vivo (Figura 4B). Embora, in vitro e in vivo em ensaios não são directamente comparáveis, a resposta a DDD00023047 foi semelhante em ambos os ensaios. DDD0001477 e DDD00000635 causou um declínio maior in vivo do que in vitro. Estes compostos foram fornecidos para os vermes vivos 22 h antes de o substrato luciferina, e os resultados podem reflectir que eles não eram facilmente deslocado do local activo de luciferase luciferina quando se tornou pilable. Alternativamente, DDD0001477 e DDD00000635 pode ter um efeito adicional sobre os níveis de ATP celular. Isso teria de ser avaliado por meio que não envolvem a luciferase de vaga-lume. De destacar a forte valorização do sinal GFP em vermes vivos expostos ao composto DDD00000635. Isto será discutido a seguir. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig1.jpg" /> Figura 1. O complexo mitocondrial I inibidor rotenone diminuiu o estado de energia de C. elegans como medido por bioluminescência de estirpe PE254. Sincronizada L4 vermes estágio (45-46 h após o alimento fornecido a larvas L1) expostas a 0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 e 160 uM em rotenona 1% de DMSO durante 2 hr (short) ou 24 horas (exposição longa) leituras anteriores de bioluminescência, respectivamente, em 48 e 69 h de desenvolvimento verme após o alimento fornecido. Bioluminescência (unidade relativa Unidades de luz, RLU) foi expressa como uma percentagem do veículo (1% DMS) Os valores de S. As barras de erro representam SEM de réplicas para cada concentração de técnicas rotenona (n = 6). Todas as concentrações testadas resultou em uma diferença altamente estatisticamente significante em relação ao controle de veículo (p &lt;0,001). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig2.jpg" /> Figura 2. O paraquat estressor oxidativo diminuiu o estado de energia de C. elegans PE254 estirpe de um modo dependente da concentração (medida por bioluminescência). vermes fase sincronizada L4 (por conveniência, neste caso a 41 horas após o alimento fornecido a larvas L1) foram expostas a 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4 ou 8 paraquat mM durante 24 h. A fluorescência de GFP (unidades de fluorescência relativa unitários, RFU) foi usado para normalizar os dados de bioluminescência (unidade RLU), ambos os pontos finais obtidos em 65 h de desenvolvimento. Os dados são expressos como uma percentagem de controlo (DMSO a 1%). As barras de erro representam SEM de réplicas técnicas(n = 5 para diferentes concentrações; n = 18 para os controlos). One-way ANOVA: *** p &lt;0,001 em relação ao veículo de controlo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig3.jpg" /> Figura 3. O intermediário oxaloacetato ciclo do ácido cítrico (8 mM) aumentaram a bioluminescência de C. elegans PE254 tensão. Synchronized L4 vermes estágio (45-46 horas após a refeição fornecida às larvas L1) foram expostos a recém-preparados 8 oxaloacetate mM durante 18 horas ± 30 min. A bioluminescência (unidade RLU) foi lida a um período de desenvolvimento de HR 63,5 ± 1 h e esta foi expressa como uma percentagem do controlo de veículo (ddH2O). Diferentes colunas representam diferentes conjuntos de 8 repetições técnicas atribuídas a diferentes placas de 96 cavidades dentro da mesma experiência de dados. As barras de erro representam SEM de réplicas técnicas (n = 8). 2 way-ANOVA com &#39;set&#39; e &#39;concentração&#39; como fatores: ̵6; Definir &#39;p&gt; 0,05&#39; &#39;, p concentração &lt;0,001 e termo de interação p&gt; 0,05. UMA <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4ahighres.jpg" width="650" /> B <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4bhighres.jpg" width="650" /> Figura 4. Teste de respostas a 4 compostos da biblioteca Dundee descoberta da droga composto 13 (C1: DDD00001434, C2: DDD0001477, C3: DDD00000635 e C4: DDD00023047) com atividade inibitória conhecida em vaga-lume luminescência da luciferase. (A) Efeito dos compostos sobre a actividade de luciferase de pirilampo purificada (medido como unidades de luz, RLU), expresso como uma percentagem do controlo de veículo. O kit de bioluminescência de ATP CLSII (Roche, Manheim, Alemanha) foi usada de acordo com instruções fornecidas com a mesma quantidade de enzima luciferase aliquotadas para poços de branco (96-Well placas de microtitulação). ATP foi fornecido a uma concentração final de 10 uM e 1 ul de composto (concentração final indicada) ou DMSO (1%) foi adicionado. Sinal de luminescência foi integrado durante 10 segundos. As barras de erro representam SEM de réplicas técnicas (n = 4). Análise: One-way ANOVA; * p &lt;0,05 ou *** p &lt;0,001 em relação ao veículo de controlo. Diferenças entre 25 e 100 uM altamente significativas para C1 (DDD00001434; p &lt;0,001), e significativo para C2 e C3 (respectivamente DDD0001477 e DDD00000635; p &lt;0,05). (B) in vivo medições de bioluminescência, bioluminescência normalizado a fluorescência da GFP e fluorescência da GFP de C. elegans PE254 estirpe em 67 hr tempo de desenvolvimento após a exposição a compostos de teste durante 22 h. As barras de erro representam SEM de réplicas técnicas (n = 8). A análise estatística (one-way-ANOVA) realizada em dados agrupados de 3 conjuntos de dados (3 xn = 8). * p &lt;0,05 ou *** p &lt;0,001 em relação ao controlo de veículo respectivo. Diferenciadaces entre 25 e 100 mm única estatisticamente significativa (p &lt;0,05) para a bioluminescência normalizado após a exposição a C4 (DDD00023047). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Hora do dia </td><td> Dia 1 </td><td> Dia 2 </td><td> Dia 3 </td><td> Dia 4 </td><td> Dia 5 </td><td> Dia 6 </td><td> Dia 7 </td><td> Dia 8 </td></tr><tr><td> 9-10 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Passo 5 </td></tr><tr><td> 10-11 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Passo 5 </td></tr><tr><td> 11-12 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Passo 4 </td><td> Passo 5 </td></tr><tr><td> 12-13 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Passo 4 </td><td></td></tr><tr><td> 13-14 </td><td&gt; </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 14-15 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15-16 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 16-17 </td><td> Passo 1 </td><td></td><td></td><td></td><td> Passo 3 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 17-18 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 18-19 </td><td></td><td></td><td></td><td> Passo 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Visão geral das etapas do protocolo a ser realizado em cada dia de experimentos de nematóides (Seção 3) e sugeriu timings.

Watch this Scientific Journal Video about A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans at JoVE.com

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

A rastreï¿½el<em&gt; In Vivo</em&gt; Ensaio para mitocondrial Modulators Usando Transgenic Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

a-screenable-vivo-assay-for-mitochondrial-modulators-using-transgenic

Research

JoVE Journal

Biology

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

9.9K visualizações.  University of Aberdeen. A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function. 

Vídeo: A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Um método simples para High Throughput Screening químico em Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Bioquímica

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

In vivo Calcium Imaging em C. elegans corpo parede músculos

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of diverse human diseases. Worms are particularly well-suited for high-throughput genetic and drug screens to gain deeper insight into therapeutic targets and therapies by exploiting their fast development cycle, large brood size, short lifespan, microscopic transparency, low maintenance costs, robust suite of genomic tools, mutant repositories, and experimental methodologies to interrogate both in vivo and ex vivo physiology. Worm locomotor activity represents a particularly relevant phenotype that is frequently impaired in mitochondrial disease, which is highly heterogeneous in causes and manifestations but collectively shares an impaired capacity to produce cellular energy. While a suite of different methodologies may be used to interrogate worm behavior, these vary greatly in experimental costs, complexity, and utility for genomic or drug high-throughput screens. Here, the relative throughput, advantages, and limitations of 16 different activity analysis methodologies were compared that quantify nematode locomotion, thrashing, pharyngeal pumping, and/or chemotaxis in single worms or worm populations of C. elegans at different stages, ages, and experimental durations. Detailed protocols were demonstrated for two semi-automated methods to quantify nematode locomotor activity that represent novel applications of available software tools, namely, ZebraLab (a medium-throughput approach) and WormScan (a high-throughput approach). Data from applying these methods demonstrated similar degrees of reduced animal activity occurred at the L4 larval stage, and progressed in day 1 adults, in mitochondrial complex I disease (gas-1(fc21)) mutant worms relative to wild-type (N2 Bristol) C. elegans. This data validates the utility for these novel applications of using the ZebraLab or WormScan software tools to quantify worm locomotor activity efficiently and objectively, with variable capacity to support high-throughput drug screening on worm behavior in preclinical animal models of mitochondrial disease.

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

This study presents protocols for two semi-automated locomotor activity analysis approaches in C. elegans complex I disease gas-1(fc21) worms, namely, ZebraLab (a medium-throughput assay) and WormScan (a high-throughput assay) and provide comparative analysis among a wide array of research methods to quantify nematode behavior and integrated neuromuscular function.

Análise comparativa de métodos experimentais para quantificar a atividade animal em Caenorhabditis elegans Modelos de Doença Mitocondrial

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

Comportamento

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

Alto rendimento Triagem e Biossensoriais com Fluorescente C. elegans Cepas

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Biologia

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a wide variety of disorders including metabolic diseases, premature aging syndromes, and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD). Maintenance of mitochondrial health depends on mitochondrial biogenesis and the efficient clearance of dysfunctional mitochondria through mitophagy. Experimental methods to accurately detect autophagy/mitophagy, especially in animal models, have been challenging to develop. Recent progress towards the understanding of the molecular mechanisms of mitophagy has enabled the development of novel mitophagy detection techniques. Here, we introduce several versatile techniques to monitor mitophagy in human cells, Caenorhabditis elegans (e.g., Rosella and DCT-1/ LGG-1 strains), and mice (mt-Keima). A combination of these mitophagy detection techniques, including cross-species evaluation, will improve the accuracy of mitophagy measurements and lead to a better understanding of the role of mitophagy in health and disease.

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitophagy, the process of clearing damaged mitochondria, is necessary for mitochondrial homeostasis and health maintenance. This article presents some of the latest mitophagy detection methods in human cells, Caenorhabditis elegans, and mice.

In Vitro e In Vivo de deteção de Mitophagy em células humanas, C. Eleganse os ratos

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Medicina

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

Métodos para avaliar Subcelulares Compartimentos de músculo em<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

Medição das taxas de consumo de oxigênio em intacta Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on host physiology. It also fluoresces in blue when dying, providing a convenient means of pinpointing death. This property has been exploited to develop high-throughput label-free C. elegans survival assays (LFASS). These involve time-lapse fluorescence recording of worm populations set in multiwell plates, from which population median time of death can be derived. The present study adopts the LFASS approach to screen multiple microbial isolates at once for the effects on C. elegans susceptibility to severe heat and oxidative stresses. Such microbial screening pipeline, which can notably be used to prescreen probiotics, using severe stress resistance as a proxy for host health is reported here. The protocol describes how to grow both C. elegans gut microbiota isolate collections and synchronous worm populations in multiwell arrays before combining them for the assays. The example provided covers the testing of 47 bacterial isolates and one control strain on two worm strains, in two stress assays in parallel. However, the approach pipeline is readily scalable and applicable to the screening of many other modalities. Thus, it provides a versatile setup to rapidly survey a multiparametric landscape of biological and biochemical conditions that impact C. elegans health.

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

Gut microbes may positively or negatively impact the health of their host via specific or conserved mechanisms. Caenorhabditis elegans is a convenient platform to screen for such microbes. The present protocol describes high-throughput screening of 48 bacterial isolates for impact on nematode stress resistance, used as a proxy for worm health.

Triagem de alto rendimento de isolados microbianos com impacto na saúde de Caenorhabditis elegans

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on ...

Quantificando a mitofagia em C. elegans e uma linha celular de câncer de fígado

Detection of Mitophagy in Caenorhabditis elegans and Mammalian Cells Using Organelle-Specific Dyes

Mitochondria are essential for various biological functions, including energy production, lipid metabolism, calcium homeostasis, heme biosynthesis, regulated cell death, and the generation of reactive oxygen species (ROS). ROS are vital for key biological processes. However, when uncontrolled, they can lead to oxidative injury, including mitochondrial damage. Damaged mitochondria release more ROS, thereby intensifying cellular injury and the disease state. A homeostatic process named mitochondrial autophagy (mitophagy) selectively removes damaged mitochondria, which are then replaced by new ones. There are multiple mitophagy pathways, with the common endpoint being the breakdown of the damaged mitochondria in lysosomes. 
Several methodologies, including genetic sensors, antibody immunofluorescence, and electron microscopy, use this endpoint to quantify mitophagy. Each method for examining mitophagy has its advantages, such as specific tissue/cell targeting (with genetic sensors) and great detail (with electron microscopy). However, these methods often require expensive resources, trained personnel, and a lengthy preparation time before the actual experiment, such as for creating transgenic animals. Here, we present a cost-effective alternative for measuring mitophagy using commercially available fluorescent dyes targeting mitochondria and lysosomes. This method effectively measures mitophagy in the nematode Caenorhabditis elegans and human liver cells, which indicates its potential efficiency in other model systems.

Autor em destaque: Detecção de mitofagia em Caenorhabditis elegans e células de mamíferos usando corantes específicos de organelas  

Exploring mitophagy through electron microscopy, genetic sensors, and immunofluorescence requires costly equipment, skilled personnel, and a significant time investment. Here, we demonstrate the efficacy of a commercial fluorescence dye kit in quantifying the mitophagy process in both Caenorhabditis elegans and a liver cancer cell line.

Detecção de Mitofagia em Caenorhabditis elegans e Células de Mamíferos Usando Corantes Organel-Específicos

Mitochondria are essential for various biological functions, including energy production, lipid metabolism, calcium homeostasis, heme biosynthesis, ...

A rastreï¿½el

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Um método simples para High Throughput Screening químico em Caenorhabditis Elegans

In vivo Calcium Imaging em C. elegans corpo parede músculos

Análise comparativa de métodos experimentais para quantificar a atividade animal em Caenorhabditis elegans Modelos de Doença Mitocondrial

Alto rendimento Triagem e Biossensoriais com Fluorescente C. elegans Cepas

In Vitro e In Vivo de deteção de Mitophagy em células humanas, C. Eleganse os ratos

Métodos para avaliar Subcelulares Compartimentos de músculo em

Medição das taxas de consumo de oxigênio em intacta Caenorhabditis elegans

Triagem de alto rendimento de isolados microbianos com impacto na saúde de Caenorhabditis elegans

Detecção de Mitofagia em Caenorhabditis elegans e Células de Mamíferos Usando Corantes Organel-Específicos

Detecção de Mitofagia em Caenorhabditis elegans e Células de Mamíferos Usando Corantes Organel-Específicos