Os autores agradecem Xiu-Ping Wang ajuda inicial com culturas desconto. Os autores são financiados em parte por bolsas de estudo e bolsas de Institutos Nacionais de Saúde (K99-DE022059 a AHJ, K12-GM081266 para MGC, K08-DE022377-02 a OH, e R01-DE021420 para ODK).

1. Dissecar mais baixos hemi-mandíbulas de rato adulto <ol><li> Antes de realizar este protocolo, obter aprovação institucional necessário e não deixe de cumprir com todas as orientações de cuidados de animais. Eutanásia animal utilizando padrão IACUC procedimentos aprovados. Para este trabalho asfixia com CO2 foi usado seguido por deslocação cervical. <ol><li> OPCIONAL: cabeça separada do resto do corpo usando uma lâmina de barbear. </li></ol></li><li> Retire a pele do lábio inferior para o decote. </li><li> Usando um bisturi, fazer uma incisão entre os dois incisivos inferiores, que são vagamente conectados. Mediante a aplicação de pressão, a mandíbula será dividida em duas metades. </li><li> Wedge o bisturi entre o côndilo da mandíbula e da articulação mandibular temporal e cortar ao lado do músculo da mandíbula para separar a mandíbula. </li><li> Remova todo músculo, tendão, ligamento e até que apenas o osso permanece. </li></ol> 2. Isolar o Incisivo <ol><li> Usando um bisturi n º 15, Cuidadosamente raspar o osso em um ângulo de 45 ° a partir da extremidade distal para a extremidade proximal da região membranoso. Utilize a ponta do bisturi para escolher qualquer distância osso remanescente, incluindo os fragmentos de osso no bordo. Lentamente começam a escolher afastado na placa cortical lingual da mandíbula, começando logo abaixo do 3 º molar. </li><li> Continue até que o incisivo é limpo, trabalhando com cuidado para a área que contém o CL. </li><li> Remover pacote do nervo alveolar inferior. </li><li> Faça um corte limpo primeiro remover o osso e tecidos proximal ao CL. </li><li> Faça um segundo corte distal com o bisturi, aproximadamente abaixo do 2 º molar. A região proximal incisivo é então dissecadas para fora através da inserção do bisturi entre o osso e a superfície média do incisivo proximal. Isto deve ser feito com cuidado, de modo a não rasgar o tecido. O movimento é incisão proximal-distal. PASSO ALTERNATIVA: Remover o máximo possível de osso ao longo da zona superior da incisor. Uma vez que a área é limpa, remova cuidadosamente incisivo inteiro usando um tamanho de 5 fórceps para lidar com a parte de esmalte mais próximo a região CL. </li><li> Colocar o tecido dissecado (ou CL isolado como na Figura 3E, ou incisivo inteira como no Passo alternativa 2.5) em 2% de colagenase em 1X PBS durante 3-4 horas a 4 ° C em uma placa de baixa aderência. Para 1-10 incisivos, utilizar 100 ul por poço de uma placa de 12 poços. Para maior do que 10 incisivos, utilizar 500 ul por poço de uma placa de 6 poços aderência baixa. </li></ol> 3. Microdissect the Loop Cervical Labial <ol><li> Remover região CL da colagenase e coloque em mídia DMEM/F12 frio. </li><li> Puxe na extremidade inferior do CL usando tamanho 5 fórceps ou uma seringa de insulina (1 cc, 28 L C); mesênquima vai desmoronar enquanto o epitélio permanece intacta. O CL eo epitélio adjacente que se estende lateralmente como uma estrutura de &quot;asa-like&quot; serão visíveis. </li><li> Removera gema apical do epitélio adjacente, fazendo uma incisão em forma de V de cada lado, e coloque imediatamente em DMEM/F12 frio no gelo. </li><li> Repita o procedimento para todos os CLs, recolher em 1,5 ml tubo de microcentrífuga. </li><li> Gire para baixo tubo de microcentrífuga com exemplares, ao remover a mídia, substitua por 100 solução desprendimento de células mL. </li><li> Incubar os tecidos em solução de desprendimento de células durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Dissociar os tecidos para produzir uma suspensão única célula cuidado pipetando para cima e para baixo usando um 1000 mL de baixa aderência ponteira. As células também podem ser colocadas através de um coador de células esterilizado para conseguir a dissociação. </li><li> Contar as células com um hemocitómetro, na placa de cultura de tecidos de plástico ou outro material desejado. </li></ol> 4. Cultura primária de DESCs <ol><li> Células da placa em uma placa de 6 poços a 1-6 x 10 4 células / ml em meios DESC, a qual consiste em DMEM/F12 suplementado com proteína recombinante de rato de EGF numa concentração de 20 ng / ml, a proteína recombinante de FGF, a uma concentração de 25 ng / ml, suplemento B27 1X e solução de 1% de antibióticos (penicilina, 100 U / ml, estreptomicina 50 ug / ml). </li><li> Cultivar células plaqueadas numa placa de 6 poços, a 37 ° C em 5% de CO 2 em 1 ml de meio de desconto. Não perturbe culturas iniciais, durante 5 dias após o plaqueamento para permitir a adesão celular e formação de colônias. </li><li> Pela primeira mudança mídia, substitua metade do volume (500 mL) de velha mídia com metade do volume (500 mL) de novas mídias. Confira as colônias sob o microscópio quando mudar de mídia. </li><li> Após a primeira mudança de mídia, continuam a mudar mídia (1-2 ml) a cada 2 dias. Confira as colônias sob o microscópio quando mudar de mídia. </li></ol> 5. DESCs Passage <ol><li> Mídia Aspirar e lavar as células 3x com pré-aquecido PBS. </li><li> Adicionar pré-aquecida de 0,25% de Tripsina-EDTA em solução salina e incubar a 37 ° C durante 10-15 minutos para os DESCs para separar. </li><li> Adicionar mídia DESC para neutralizar a tripsina, Pipeta suavemente ao longo do tecido placa de cultura para recolher as células, e coloque em um tubo de 15 ml. </li><li> Gire as células a 800 xg por 2 min. </li></ol>

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Evidence for ameloblast death immediately after enamel matrix secretion.</a> Anat Rec. 187, 63-98 (1977).</li><li>Parsa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+by+FGFR2b+controls+the+regenerative+capacity+of+adult+mouse+incisors.">Signaling by FGFR2b controls the regenerative capacity of adult mouse incisors.</a> Development. 137, 3743-3752 (2010).</li><li>Chang, J. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+mouse+cortical+neurons+as+a+model+for+neuronal+development,+aging,+and+death.">Long-term culture of mouse cortical neurons as a model for neuronal development, aging, and death.</a> J Neurobiol. 51, 9-23 (2002).</li><li>Felszeghy, S., Suomalainen, M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling+is+required+for+the+survival+of+epithelial+stem+cells+in+the+continuously+growing+mouse+incisor.">Notch signalling is required for the survival of epithelial stem cells in the continuously growing mouse incisor.</a> Differentiation. 80, 241-248 (2010).</li><li>Fujimori, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/beta-catenin+signaling+in+the+dental+mesenchyme+regulates+incisor+development+by+regulating+Bmp4.">Wnt/beta-catenin signaling in the dental mesenchyme regulates incisor development by regulating Bmp4.</a> Dev Biol. 348, 97-106 (2010).</li><li>Klein, O. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+FGF+signaling+loop+sustains+the+generation+of+differentiated+progeny+from+stem+cells+in+mouse+incisors.">An FGF signaling loop sustains the generation of differentiated progeny from stem cells in mouse incisors.</a> Development. 135, 377-385 (2008).</li></ol>

Os autores não têm conflitos de interesse de divulgar.

As células epiteliais foram primeiro cultivadas com sucesso ao longo de 40 anos, 21-24, e, mais recentemente, o isolamento bem sucedido de células estaminais epiteliais 25-27 avançou nosso conhecimento da biologia epitelial. Relata-se um protocolo para isolar o DESCs do incisivo do rato adulto, uma população relativamente pouco estudado de células-tronco que tem o potencial para produzir insights importantes sobre a biologia dental e formação do esmalte. Este protocolo foi inicialmente base...

Uma das características únicas dos vertebrados é a evolução dos dentes. O dente tornou-se um sistema modelo importante para muitas áreas de pesquisa, como as vias moleculares e especializações morfológicas relevantes a este órgão foram investigados a partir de várias perspectivas, inclusive no desenvolvimento e evolutivos biólogos 5. Mais recentemente, no campo da medicina regenerativa começou a obter informações valiosas usando o dente como um modelo. Em particular, a descoberta de células estaminais epiteliais dental tem sido um importante avanço 6-13. Todos os roedores possuem dentes incisivos de crescimento contínuo, cujo crescimento é alimentado por células-tronco, tornando estes dentes um sistema modelo acessível para estudar regulação de células estaminais adultas. Experimentos de marcação na década de 1970 10,11, seguido por linhagem genética experimentos de rastreamento 8,9,12,14, demonstraram que DESCs residem na região proximal do incisivo. A hasteprogénie celular no compartimento epitelial em movimento lateral vestibular para fora do nicho putativo, conhecido como o ciclo cervical labial (CL), e contribui para uma população de células chamadas células (TA)-amplificação de trânsito (Figura 1). Especificamente, DESCs residem no epitélio externo do esmalte (OEE) e retículo estrelado (SR) 8,9,14, eo epitélio interno do esmalte (IEE) dá origem às células TA que progridem através de um número limitado de ciclos de células e, em seguida, mover distalmente ao longo do comprimento do incisivo (Figura 1). Os ameloblastos diferenciação na incisivo rato continuar a mover-se distalmente ao longo do incisivo a uma taxa excepcional de cerca de 350 mM de um único dia 15,16. Como eles se movem, as células se diferenciam em ameloblastos maduros e estrato intermediário células (SI). Depois de depositar a espessura total da matriz do esmalte, muitos dos ameloblastos sofrem apoptose, e as restantes células diminuem de tamanho e regular a maturação do esmalte &lt;sup&gt; 17. A linhagem de outros tipos de células no CL vestibular, tal como o SR, é menos claro, e dados em relação às células estaminais do mesênquima e 18 da CL lingual só agora começam a surgir. Utilizando o modelo de ratinho incisivo, um certo número de grupos têm trabalhado para elucidar as vias genéticas e os processos biológicos envolvidos na renovação das células estaminais naturais com base em células de órgãos. No entanto, o CL labial contém um número relativamente pequeno de células, que se estima ser de cerca de 5,000 por incisivo do rato, o que facilita o trabalho com células primárias desafiando. Por conseguinte, têm sido feitos esforços para a cultura e expandir as células in vitro 6,16,19,20, a fim de abrir as portas para novos abordagens experimentais que não são atingíveis in vivo. O estudo mais recente mostrou que estas células podem tanto a auto-renovação e diferenciação em células que expressam amelogenina quando cultivadas 13. Aqui, descrevemos e demonstrar um método para poe cultura confiável e consistente de células do rato labial CL.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="584">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Forceps, size 5</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11251-30</td>
			<td style="width:167px;">FST by Dumont, Dumoxel,&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Forceps Straight, fine, 3.5</td>
			<td style="width:83px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS5070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Razorblades</td>
			<td style="width:83px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:119px;">#71960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scalpel Handle No.3</td>
			<td style="width:83px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Feather Blade No. 15</td>
			<td style="width:83px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:119px;">#72044-15</td>
			<td>Surgical Stainless Steel</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Collagenase Type-1 filtered</td>
			<td style="width:83px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td style="width:119px;">#4214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insulin syringe</td>
			<td style="width:83px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">#329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Accumax</td>
			<td style="width:83px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">#SCR006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:83px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EGF</td>
			<td style="width:83px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:119px;">2028-EG-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FGF2</td>
			<td style="width:83px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:119px;">233-FB-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">B27 Supplement</td>
			<td style="width:83px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10889-038</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor

Compreender os mecanismos celulares e moleculares subjacentes à regeneração do dente e renovação tornou-se um tema de grande interesse 1-4, eo incisivo rato fornece um modelo para estes processos. Este órgão notável cresce continuamente ao longo da vida do animal e gera todos os tipos de células necessárias de grupos ativos de células-tronco adultas alojados no vestibular (em direção ao lábio) e lingual (em direção à língua) regiões (CL) alça cervical. Apenas as células estaminais dentárias da CL labial dar origem a ameloblastos que geram o esmalte, o revestimento externo dos dentes, na superfície labial. Esta formação do esmalte assimétrica permite abrasão na ponta incisivo e progenitores e células-tronco no incisivo proximal garantir que os tecidos dentários são constantemente reabastecidos. A capacidade de isolar e cultivar essas células progenitoras ou tronco in vitro permite a sua expansão e abre as portas para inúmeras experiências não alcançáveis ​​in vivo, tais como htestes de rendimento igh de fatores de regulação de células-tronco em potencial. Aqui, descrevemos e demonstrar um método confiável e consistente para células de cultura do CL labial do incisivo mouse.

O mouse hemi-mandíbula é composto por um contínuo crescimento incisivo e três molares enraizadas (Figura 1A). Todos os dentes consistem de dentina e esmalte, as duas componentes mineralizados da coroa do dente (Figuras 1A e 1A &#39;). As casas incisivos dois nichos de células estaminais chamado o CL CL labial e lingual, e esmalte é formada exclusivamente no lado labial (Figura 1A). DESCs são responsáveis ​​pela formação do esmalte dos dent...

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Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

O contínuo crescimento incisivo do rato é um modelo para o estudo de renovação dos tecidos dentários a partir de células-tronco do epitélio dental (DESCs). Um sistema robusto para consistente e confiável a obtenção destas células a partir do incisivo e expandi-las in vitro é relatado aqui.

Isolamento e Cultura da Dental epiteliais células-tronco do Adulto Rato Incisivo

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

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Research

JoVE Journal

Biology

15.0K visualizações.  University of California, San Francisco.  O contínuo crescimento incisivo do rato é um modelo para o estudo de renovação dos tecidos dentários a partir de células-tronco do epitélio dental (DESCs). Um sistema robusto para consistente e confiável a obtenção destas células a partir do incisivo e expandi-las in vitro é relatado aqui. 