A cultura de órgãos do tipo Trowell é usada para cultivar explantes de tecidos. Aqui, mostramos como usar esse método para estudar as células-tronco em dentes de crescimento contínuo. Com esta técnica, podemos estudar as células-tronco e seu comportamento no nicho e rastrear o efeito de várias moléculas na sobrevivência e manutenção das células-tronco.
Este método pode ser aplicado para estudar as células-tronco de outros órgãos também, como a pele ou a glândula mamária. Comece colocando grades metálicas de 30 milímetros com orifícios de um a dois milímetros de diâmetro em uma placa de Petri de 35 milímetros. Preencha o local com mídia até que a mídia atinja a superfície da grade.
Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius até que o tecido esteja isolado e pronto para a cultura. Depois de decapitar o rato, remova a pele para expor a mandíbula e corte os músculos masseteres para separar a mandíbula da maxila e do resto da cabeça. Uma vez que a mandíbula esteja isolada, remova a língua e o máximo de tecidos moles.
Divida a mandíbula na linha média, cortando a sínfise. Coloque a mandíbula na placa de Petri contendo PBS no gelo. Use uma agulha hipodérmica descartável de calibre 20 por 26 para dissecar o incisivo.
Em seguida, limpe o tecido mole e o tecido muscular da superfície óssea para uma melhor visualização. Para mandíbulas obtidas de animais com menos de 10 dias, use agulhas hipodérmicas descartáveis de calibre 20 por 26 para abrir cada metade da mandíbula longitudinalmente para expor o dente incisivo. Separe suavemente o incisivo do osso circundante.
Corte a extremidade proximal que contém a alça cervical e remova o esmalte mineralizado e a matriz dentinária. Mantenha as extremidades proximais coletadas no PBS de Dulbecco no gelo até que estejam prontas para a cultura. Para ratos com mais de 10 dias, abra cada metade da mandíbula longitudinalmente para expor o dente incisivo.
Use uma pinça para segurar a mandíbula e quebrar o osso para expor o dente. Corte a extremidade proximal que contém a alça cervical. Mantenha as extremidades proximais coletadas no PBS de Dulbecco no gelo até que estejam prontas para a cultura.
Coloque cuidadosamente os filtros retângulos em cima da grade em um prato de cultura pré-aquecido e oriente adequadamente as peças de tecido. Incubar a placa a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 90 a 95% de umidade. Troque cuidadosamente o meio em dias alternados, evitando a formação de bolhas de ar.
Monitore o crescimento do tecido e capture imagens diariamente. Retire o meio de cultura do prato e adicione cuidadosamente metanol gelado ao tecido. Em seguida, incube-o por cinco minutos.
Transfira um filtro que transporte o explante de tecido para o tubo de amostragem preenchido com solução de fixação. Fixar o explante em paraformaldeído a 4% preparado em PBS durante a noite máxima a quatro graus Celsius. As células-tronco epiteliais residem em um nicho chamado alça cervical, localizado na extremidade proximal do incisivo.
A alça cervical compreende um epitélio de esmalte interno e externo que envolve o retículo estrelado, um núcleo de células epiteliais frouxamente arranjadas. Cada incisivo tem uma alça cervical labial e uma lingual, mas apenas a alça cervical labial contém as células-tronco. A extremidade proximal de um incisivo, isolado de camundongos Sox2-GFP pós-natais de dois dias, foi capturada, permitindo a identificação e visualização das células-tronco epiteliais incisivas expressoras de Sox2.
Em alças cervicais isoladas dos camundongos transgênicos vermelhos Sox2-GFP e Fucci, células-tronco positivas para GFP e células não proliferativas positivas para vermelho de Fucci foram identificadas. A expressão de Sox2-GFP foi utilizada como relator para analisar o efeito do ativador de sinalização Wnt/beta-catenina BIO, que afetou negativamente as células-tronco que expressam Sox2, bem como a expressão de GFP. Essa técnica pode ser otimizada para imagens ao vivo do comportamento das células-tronco.
Explantes prensados ou cultivados também podem ser processados enzimaticamente em suspensões unicelulares para análise posterior.
