Agradecemos a A. e B. Shea Tager por sua colaboração em curso, e para fornecer o tecido pulmonar utilizado para fins de demonstração aqui. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health conceder HL-092961. Este trabalho foi realizado em parte do Centro de Sistemas em nanoescala (CNS), um membro da Rede Nacional de Nanotecnologia Infra-estrutura, que é apoiado pela National Science Foundation sob NSF prêmio ECS-0335765. CNS é parte da Faculdade de Artes e Ciências da Universidade de Harvard.

1. Faixa de tecido de pulmão Preparação <ol><li> Tecido pulmonar é altamente compatível e difícil de cortar em tiras para a caracterização AFM. Para transitoriamente estabilizar a estrutura do pulmão para o corte, inflar os pulmões do rato isolado intratraqueal com 50 ml / kg de peso corporal de 2% gel baixo ponto de agarose (preparado em PBS) aquecido a 37 ° C. Amarrar a traquéia e os pulmões inflados fresco em um banho de PBS a 4 ° C por 60 minutos. O gel de agarose vai endurecer e nos espaços gentilmente estabilizar a estrutura do pulmão durante este intervalo de 5. Maiores concentrações de agarose, de 3-4%, ou seja, podem ser usados ​​para aumentar ainda mais a estabilização de tecidos para o corte. </li><li> Corte a agarose estabilizado tecido pulmonar do rato com uma navalha ou lâmina de bisturi em tiras de 5 x 5 mm de comprimento e largura e 400 m de espessura, em seguida, lavar as tiras em um banho de PBS pré-aquecido a 37 ° C usando um de 100 ml copo de vidro em uma bancada placa aquecida mexa por 5 minutos para remover agarose residual. Para excluir grandes vias aéreas e vasos, cortar tiras de regiões distantes dos principais subpleural-tronco brônquios. Se as vias aéreas e navios de grande porte estão a ser trabalhada, cortar tiras de tecido pulmonar mais proximal ao tronco principal brônquios. </li></ol> 2. AFM Microindentation e imagens de fluorescência <ol><li> Para isolar áreas de interesse para microindentation AFM, o tecido pode ser visualizado por microscopia de contraste de fase, ou imunocoradas e visualizados por microscopia de fluorescência. Para a imunocoloração, bloco tiras de tecido com 5% de soro a partir da fonte do anticorpo secundário desejado (em PBS) por 2 horas sem fixação ou permeabilização à temperatura ambiente. </li><li> Incubar as tiras de tecido com o anticorpo primário apropriado (por exemplo, de coelho anti-colágeno-I para visualizar colágeno intersticial (1:250 diluição), de coelho anti-laminina (1:250 diluição) para visualizar membrana basal) em um poço de uma placa de 12 poços em um rocker, agitando suavemente por 1 hora, lave amostra 3 vezes por 5 minutos cada com PBS, seguido pelo anticorpo secundário apropriado conjugado com etiqueta fluorescente (por exemplo, Alexa Fluor 546 cabra anticorpo anti-coelho secundário (1:250 diluição)) para 1 horas à temperatura ambiente. </li><li> Lave as tiras de tecido extensivamente com PBS e armazene em PBS a 4 ° C </li><li> Imediatamente antes da caracterização AFM, anexar a tira de tecido para um poli-l-lisina revestido lamínula de 15 mm, levantando as lamelas de baixo do tecido flutuante, certificando-se a tira de tecido se espalha uniformemente sobre a superfície lamela, se necessário sanduíche, a faixa com um pano limpo segundo, não revestido lamela e aplicar pressão suave para auxiliar na fixação de tecidos para a lamela poli-l-lisina-revestido. </li><li> Calibrar o sistema de AFM seguir instruções do fabricante antes de cada rodada de experimentos microindentation. Determinar dois parâmetros críticos: 1) Primavera do cantilever constante utilizando o método de flutuação térmica no ar 6, e, 2) a sensibilidade de deflexão do cantilever, que é um parâmetro usado para dimensionar o sinal de saída fotodiodo para a distância real cantilever deflexão, Δd. Calibrar a sensibilidade de deflexão pela obtenção de uma curva de força-deslocamento padrão em PBS numa lâmina de vidro limpo, então calcular a inclinação da curva força-deslocamento (Fig.1b). Na medição da curva força-deslocamento, a ponta do AFM é estendida e retraída em direção da superfície da amostra em um único local (sem rastering em direções XY), com a deflexão do cantilever, Δd, monitorizada como uma função de ponta de deslocamento, Δz . </li></ol> Recomendamos a utilização de um silício cantilever triângulo nitreto com a 5 mícrons de diâmetro esférico borosilicato ponta (Novascan). Usando sondas AFM com uma fonte constante de 0,06 N / m, temos mecanicamente caracterizada materiais macios, com módulos de cisalhamento que mede de 100 a 50.000 Pa. <ol start="6"><li> Limpe a superfície inferior da lamela amostra com papel de tecido, prenda-a com uma lâmina de vidro padrão com graxa de vácuo, montar a lâmina de vidro no palco amostra AFM, e cobrir o tecido com 500 mL de PBS (temperatura ambiente). </li><li> Definir o microscópio para visualização olho peças para alinhar a ponta do AFM no centro do campo de visão, ajustando o estágio da amostra do microscópio. Escolha uma área de interesse no tecido movendo o estágio amostra AFM, em seguida, mudar para o CCD de câmera para gravar imagens de contraste de fase e / ou imagens de fluorescência do tecido, como desejado. </li><li> Realizar operação padrão engajamento AFM, movendo a ponta do AFM lentamente para baixo até que esteja em contato com a amostra. </li><li> Caracterização precisa microindentation AFM de amostras moles requer profundidades recuo pequeno para evitar grandes cepas locais que invalida o modelo de Hertz utilizado para o cálculo módulo de elasticidade. Para evitar grandes deformações, execute o recuo no modo de disparo, definindo a deflexão máxima cantilever (ponto gatilho) a 500 nm. Este limite de deflexão irá conter oforça de recuo máximo para menos de 30 nN (F = primavera cantilever deslocamento * constante, ou F max = 0,06 nN / nm * 500 nm = 30 nN). </li></ol> A velocidade de recuo deve ser selecionado para ser suficientemente lento para explorar as propriedades elásticas em vez viscoelástico da amostra macio 7. A faixa de velocidade de 2-20 mM por segundo é adequado para o tecido pulmonar. <ol start="10"><li> Para uma única medição de uma área de interesse, mover a sonda de AFM para o local de interesse e realizar um recorte único para coletar uma curva força-deslocamento padrão (a sonda se move apenas na direção Z, sem varredura XY). </li><li> Para mapeamento automatizado de uma região de interesse, mude para Força-mode Map, selecione o tamanho da digitalização e pontos de amostra dentro da área selecionada. Em Força-Map modo, o rasters ponta do AFM em toda a superfície da amostra entre os movimentos de recuo, e coleta individuais curvas força-deslocamento em cada ponto em uma grade de amostragem definida. Mais pontos de amostragem irá proporcionar maior resolução espacial, mas prolongar o tempo necessário para o mapeamento. Nós achamos prático usar uma grade de 16 x amostra de 16 para mapear uma área de 80 x 80 mícrons a uma velocidade de recuo de 20 mM por segundo, que pode ser concluído em aproximadamente 10 minutos. </li></ol> 3. AFM extração de dados <ol><li> Para calcular o módulo de Young, o traçado da curva força-deslocamento para o modelo de Hertz indentação esférica utilizando mínimos quadrados não-linear montagem curva 8 (Fig.1 A, C): <img src="/files/ftp_upload/2911/2911eq1.jpg" alt="Equação 1" /> onde F = k c * Δ d, é a força para dobrar o cantilever, k c é a mola cantilever constante, R é raio da ponta esfera, δ = Δ z - Δ d é de recuo e υ é a proporção da amostra Poisson (υ = 0,4 para o tecido pulmonar 9). </li><li> Para avaliar a qualidade do ajuste, calcule o valor SSR, ou a soma dos quadrados da diferença entre os dados e os valores de ajuste, durante o ajuste de curva não-linear. Eliminar as medições não confiáveis ​​ou não-interpretável, descartando dados &quot;ruins&quot; as curvas com valores de SSR grande. </li><li> Se desejar, converter módulo de elasticidade (E) para módulo de cisalhamento (G), usando a relação E = 2 x (1 + υ) x G. Para visualizar padrões espaciais de rigidez coletados em Força-mode Map, os dados do gráfico de módulo no contorno mapas (por exemplo, 16 x 16 grade de amostragem cobrindo uma área de 80 x 80 mm). </li><li> Para processar uma grande quantidade de dados da curva de força, um algoritmo personalizado pode ser escrito para ajustar automaticamente as curvas força-deslocamento, o extrato de módulos e / ou elastographs trama usando os mesmos procedimentos e parâmetros, conforme descrito em 3.2 e 3.3 (por exemplo, Matlab). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 (A) Esquema de AFM microindentation de uma amostra suave em um substrato rígido usando uma sonda esférica (Reproduzido com permissão de Dimitriadis E., et al. 2002 Biophys J 8). (B) Representante curva força-deslocamento coletados a partir de uma lâmina de vidro limpa em PBS para determinar a sensibilidade de deflexão do cantilever. (C) Representante curvas força-deslocamento coletados de moles (azul) e rígida (vermelho) amostras mostrando os parâmetros correspondentes a partir de (A). 4. Resultados representativos: Figura 2A mostra uma faixa parênquima pulmonar anexado em poli-l-lisina lamela revestido em PBS com uma sonda de AFM no lugar diretamente acima da região de interesse e pronto para o mapeamento microindentation. Figura 2B mostra que no tecido adequadamente cortadas e coradas, a micro-arquitetura alveolar do parênquima pulmonar está bem preservada, como pode ser observado através da coloração de imunofluorescência para laminina componente da membrana do porão sem fixação ou de permeabilização. A Figura 2 mostra a coloração CD de imunofluorescência para colágeno I em fresco nos pulmões de camundongos unfixed colhidas previamente tratados com PBS (Fig. 2C), ou tratados com bleomicina (Fig. 2D) para induzir a fibrose 10. Figura 3A mostra amostragem às forças de deslocamento de parcelas obtidas microindentation AFM. Com a mesma força aplicada, AFM ponta gera um grande recuo em uma região moles (linha azul), resultando em um relativamente &quot;flat&quot; curva de força-deslocamento versus um recuo pequeno e um &quot;steep&quot; curva de força-deslocamento para uma região mais aguerrida ( linha vermelha). A fim de obter curvas força limpo, depois de cada reentrância a ponta do AFM precisa ser retraído completamente da superfície da amostra e livre de contato antes do recuo seguinte. Este estado contato livre corresponde à região plana da curva na Figura 3A, onde a ponta traduz sem deflexão cantilever. Figura 3B mostra uma curva típica falsa sem uma região plana que ocorre quando a ponta não está completamente retraído a partir da superfície da amostra (amostra macio por exemplo, umttaches a ponta) o que torna impossível determinar o ponto de contato. Se a ponta é completamente preso em amostra suave, a curva pode parecer como mostrado na Figura 3C, sem deflexão clara, mas o ruído pequeno. A Figura 4 mostra dados de módulo de cisalhamento extraído de força-deslocamento curvas exibidas espacialmente como mapas rigidez (elastographs), as escalas onde a cor com o módulo de cisalhamento. Elastographs demonstram diferenças marcantes na faixa e distribuição de módulo de cisalhamento no tecido normal (Fig. 4A) e fibrose (Fig. 4B) parênquima pulmonar, e grandes variações espaciais no módulo de cisalhamento, especialmente dentro da amostra de pulmão fibrótico. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. (A) Micrografia contraste de fase mostrando uma sonda de AFM com um rato strip parênquima pulmonar. Barra de escala, 50 mm. (B) imunocoloração de laminina no tecido normal do mouse pulmão mostrando a micro-arquitetura alveolar de parênquima pulmonar normal. Caixa branca indica típico 80-by-80μm área de mapeamento elasticidade. Barra de escala: 20 mM. (C e D) imunocoloração de colágeno I em solução salina (C) e bleomicina (D) tratados rato parênquima pulmonar. Barras de escala, 100 mm. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. (A) Representante interpretável curvas força-deslocamento coletados de solução salina (azul) e tratados com bleomicina (vermelho) do mouse parênquima pulmonar, respectivamente. Linhas pretas são o melhor ajuste resultante do modelo Hertz esférica e são rotulados com os seus correspondentes calculados Young moduli. (B, C) Representante un-interpretável curvas força-deslocamento. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Elastographs Representante coletados de solução salina (A) e tratados com bleomicina (B) do mouse parênquima pulmonar. As barras coloridas indicam módulo de cisalhamento em kilopascals. Rótulos dos eixos indicam escala espacial em micrômetros. Barra de escala: 20 mM

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Não há conflitos de interesse declarados.

Caracterização mecânica de tecido pulmonar usando microindentation AFM oferece resolução espacial sem precedentes (Fig. 4), proporcionando uma perspectiva única sobre as variações microescala na rigidez do tecido. Como exemplo de sua utilidade, anterior macro-escala medidas em tiras de tecido normal e fibrótica pulmonar indicaram um aumento de 2 a 3 vezes aproximado em elastância com fibrose 11,12. Em contraste, microindentation AFM revela que enrijecimento dos tecidos é extremamente localizada, com algumas regiões apresentando até ~ aumenta 30 vezes no módulo de cisalhamento acima da média observada no tecido pulmonar normal 10. Como a rigidez da matriz é agora conhecido por influenciam criticamente a função das células, estas medições locais fornecem parâmetros de valor inestimável para melhorar a biofidelity de estudo de cultura celular de células do pulmão. Várias questões práticas surgem com o uso de finas tiras de tecido pulmonar. As superfícies das tiras não são perfeitamente planas, como o perfil do tecido segue a arquitetura dos alvéolos subjacentes. O sistema ajusta automaticamente a posição AFM ponta na direção Z, durante o recuo quando a amostra variação da altura da superfície é menor do que 15 mícrons para ajudar a superar este desafio. As medições são feitas em temperatura ambiente, e não 37 ° C, por isso os desvios nas propriedades mecânicas causadas por essa variação de temperatura não pode ser avaliado, ainda que seria esperado a ser menor. A influência da arquitetura da parede alveolar subjacente sobre observado propriedades mecânicas é difícil determinar com a configuração atual microscopia de luz. Por exemplo, seria desejável para determinar se as paredes alveolares apresentam anisotropia e diferentes propriedades mecânicas quando recuado em direções alinhadas com ou transversal ao plano da parede. No entanto, os espécimes atuais são grossas e do sistema de imagem não tem capacidades 3D, portanto, não é possível determinar a orientação da parede alveolar locais em cada ponto de contato. Finalmente, a influência de constituintes celulares na medida propriedades mecânicas continua a ser totalmente elucidado. Nos métodos detalhados aqui, não são feitos esforços para remover especificamente constituintes celulares do tecido. No entanto, as células presentes na superfície disponível para o recuo é pouco provável que seja viável, dado o tempo decorrido desde a colheita de tecidos e da necessidade de cortar o tecido para ter acesso aos alvéolos. Experimentos específicos para remover as células, ou matrizes de repovoar com células viáveis, e avaliar as alterações resultantes da rigidez do tecido parece garantido. Porque o tecido unfixed fresca é necessária para estas medições, o tempo decorrido desde a colheita de tecidos para a medição deve ser minimizado e as amostras devem ser armazenadas a 4 ° C para evitar alterações nas propriedades mecânicas. Atenção especial deve ser dada sempre que tiras de tecido são transferidos entre recipientes durante a lavagem ou coloração de modo que um mínimo de distorção ou dano é gerado. AFM para aplicação no estado líquido, é um passo crucial para cortar o tecido o mais plano possível e imobilizar a amostra sobre a lamínula de apoio. Se disponível, uma máquina automática de corte tal como um cortador de tecidos vibratome ou pode ser usado para cortar fatias de espessura altamente uniforme. É importante anexar tiras de tecido imediatamente antes das medidas AFM e minimizar o tempo decorrido para medições AFM como a amostra acabará por retirar do lamínulas. Uma observação útil é que tiras maiores parecem atribuir mais estável para cobrir escorrega e permanecer no local por períodos mais longos do que em PBS tiras menores. Microindentation AFM pode caracterizar amostras que abrangem uma ampla gama de 100 Pa a 50 kPa (módulo de cisalhamento) ao usar um padrão de 0,06 N / m cantilever com uma ponta de 5 mm de diâmetro esférico. Esse intervalo pode ser expandida usando sondas com constantes primavera diferente; sondas AFM com pontas de vidro esférico variando 0,6-12 m de diâmetro e primavera constantes variando de 0,01 e 0,58 N / m estão comercialmente disponíveis (por exemplo, Novascan) e comumente utilizado 3. Com uma ponta esférica 5 mm, a área de contato entre a ponta teórica e tecido é de cerca de 5-9 mM 2 para o recuo 400-700 nm (Fig. 1A). Dicas menores ou maiores podem ser usados ​​para fornecer escalas menores ou maiores de resolução espacial. Dicas piramidal também têm sido utilizados na AFM microindentation 13-16, fornecendo áreas menores contato e assim aumentar a resolução espacial no mapeamento, embora ajuste dos dados é mais complexo para esta geometria da ponta. Várias limitações para este método deve ser observado. O pulmão tem sido tradicionalmente caracterizada mecanicamente não-invasiva, por exemplo, usando análise de pressão-volume 17 ou soco recuo de toda pulmões 19,20. Métodos invasivos, como a descrita aqui alterar a arquitetura pulmonar em aspectos importantes, devido à perda da int ar-líquidoerface que normalmente existe no pulmão cheio de ar ea perda de pré-esforço que mantém a inflação pulmonar parcial sobre o relaxamento dos músculos respiratórios. Estas limitações são comuns a todas as medições feitas em tiras de tecido pulmonar 18. Notavelmente, entretanto, a rigidez média medida no parênquima do tecido pulmonar normal (módulo de cisalhamento ~ 0,5 kPa) não diferem substancialmente das estimativas com base no soco recuo de pulmões intactos em volumes descansando 19,20. Enquanto o tecido pulmonar é conhecido por apresentar não-linear com rigidez a deformação crescente, não é possível testar de forma rigorosa se esta propriedade persistir até a escala micro, com os métodos empregados aqui. O modelo de Hertz assume homogeneidade da amostra. No entanto, a maioria dos materiais biológicos, incluindo parênquima pulmonar, são cada vez mais heterogénea a diminuir escalas espaciais. Heterogeneidade da amostra pode resultar em artefatos como variação do módulo de Young, dependendo da profundidade de indentação, ou seja, dependendo da camada ou componente que está deformando. A heterogeneidade no plano xy pode ser limitada por escolher cuidadosamente o tamanho da ponta esférica apropriado, dependendo da microestrutura do biomaterial, tal como proposto por Dimitriadis EK et al. 8 É muito mais difícil de prever ou corrigir o erro do modelo Hertz devido ao material heterogeneidade na direção z. Azeloglu et al. propôs recentemente um modelo híbrido computacional para caracterizar as propriedades elásticas do substrato heterogêneo com discreta inclusões embutidos 21. A nova técnica fornece um meio potencial para calcular propriedades inclusão de materiais heterogêneos superar as limitações da análise hertzianas. O modelo de Hertz também assume comportamento elástico absoluto, enquanto que materiais biológicos normalmente exibem comportamentos dependentes do tempo viscoelástico. A caracterização viscoelástica cheio de tecido pode ser obtida através da variação da velocidade de recuo usadas. Importante, testes de macro-escala anterior mecânicas do tecido pulmonar normal e fibrótico demonstra a dependência fraca frequência das propriedades mecânicas do tecido pulmonar e preservação das diferenças entre as propriedades do tecido normal e fibrótica mecânica em todas as freqüências testadas 11. Estas descobertas sugerem fortemente que a medição de propriedades mecânicas utilizando uma velocidade única, com recuo AFM capta um aspecto essencial das mudanças nas propriedades mecânicas do tecido que acompanham fibrose. O coeficiente de Poisson de 0,4 para tecido pulmonar utilizado neste trabalho é de uma medida macroscópica 9. Infelizmente, o coeficiente de Poisson em micro-escala e as alterações sob condição da doença não estão disponíveis na literatura. Como alternativas para E, E / (1-υ 2) ou (1-υ 2) / πE (indicado a constante elástica k) 22 pode ser calculado a partir microindentation AFM e relatados quando o coeficiente de Poisson é desconhecida. Para a maioria dos biomateriais coeficiente de Poisson está na faixa de 0,4-0,5 devido ao seu alto teor de água. Dentro da faixa de 0,3-0,5, o fator 1 / (1-υ 2) varia apenas 1,10-1,33, de modo que variações razoáveis ​​em relação ao de Poisson exercem apenas efeitos modestos sobre o módulo relatados. O aumento no módulo de cisalhamento que relatório para relação tecido fibrótico ao tecido normal é várias vezes em magnitude, o que implica que os erros associados a variações no coeficiente de Poisson são relativos menores para as mudanças nas propriedades mecânicas observadas. O algoritmo de reais e código que pode ser utilizado para a análise da força-deslocamento de dados está sujeito à condição de aplicação específica e as características subseqüentes das diversas populações de força-deslocamento curvas. Se uma análise mais sofisticada é de interesse, pode-se consultar o trabalho de Lin et al. 23. Os autores compilaram uma série de estratégias sinérgicas em um algoritmo que supera muitas das complicações que já impedido os esforços para automatizar a montagem de modelos de dados Hertz recuo. Várias outras áreas estão disponíveis para desenvolvimento e exploração deste método. Nos casos em que alguém está interessado em visualizar as paredes alveolares sem rotulagem de anticorpos, ambos elastina e colágeno pode ser visualizado a partir de seu sinal autofluorescent no espectro verde. Por outro lado, uma melhor imagem, usando cortes mais finos tecidos, técnicas de imagem 3D, ou ambos, poderão aumentar a capacidade de correlacionar arquitetura do tecido subjacente com propriedades mecânicas. Embora os métodos atuais permitem coloração e visualização de componentes da matriz extracelular, como colágeno e laminina, esforços adicionais poderiam ser destinadas a coloração marcadores de superfície celular para identificar populações de células específicas e de caracterizar o microambiente mecânica nas proximidades dessas populações. Alternatively, o tecido poderia ser colhida a partir de camundongos expressando-fluorescente etiquetados marcadores de linhagem de células ou proteínas específicas para perseguir o mesmo objetivo. Finalmente, o método detalhado aqui aparece bem colocada para caracterizar outras características anatômicas do pulmão, tais como vasos que remodelar na hipertensão, e das vias aéreas que remodelar na asma. Com base em seu estado atual de desenvolvimento e potencial para reforçar ainda mais, microindentation AFM aparece pronta para produzir insights valiosos sobre as mudanças na rigidez do tecido que acompanham a progressão da doença no pulmão, e será sem dúvida de valor na caracterização de alterações espaciais e temporais na rigidez de uma variedade de outros tecidos moles.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> AFM ponta </td><td> Novascan </td><td> PT.GS </td><td> 5 micron borosilicato talão, 0,06 N / m </td></tr><tr><td> Poli-L-Lisina lamínulas </td><td> VWR </td><td> 354085 </td><td> BD BioCoat 12 milímetros rodada No.1 de vidro </td></tr><tr><td> Agarose, Temperatura Gelificação Baixo </td><td> Sigma </td><td> A0701 </td><td></td></tr><tr><td> Coelho anti-colágeno I (Rb PAB) de anticorpos </td><td> Abcam </td><td> ab34710-100 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 546 cabra anticorpo anti-coelho </td><td> Invitrogen </td><td> A11010 </td><td></td></tr><tr><td> Coelho anti-laminina </td><td> Sigma </td><td> L9393 </td><td></td></tr></tbody></table>

micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy

Rigidez da matriz influencia fortemente o crescimento, diferenciação e função de células aderentes 1-3. Na escala macro a rigidez dos tecidos e órgãos dentro do corpo humano vão várias ordens de magnitude 4. Muito menos se sabe sobre como a rigidez varia espacialmente dentro dos tecidos, e que o escopo ea escala espacial de mudanças nos processos de rigidez são doenças que resultam na remodelação do tecido. Para entender melhor como as mudanças na matriz de rigidez contribuem para a fisiologia celular na saúde e na doença, a medida da rigidez do tecido obtido em uma escala espaciais relevantes para células residentes são necessários. Isto é particularmente verdadeiro para o pulmão, um tecido altamente compatível e elástica em que a remodelação da matriz é uma característica proeminente em doenças como asma, enfisema, hipertensão e fibrose. Para caracterizar o ambiente local mecânica do parênquima pulmonar em uma escala espaciais relevantes para células residentes, temos desenvolvido métodos para medir diretamente as propriedades locais elástica do tecido pulmonar fresco murino usando microscopia de força atômica microindentation (AFM). Com a escolha adequada de AFM indentor, cantilever, e profundidade de indentação, estes métodos permitem medições do módulo de cisalhamento locais tecido em paralelo com contraste de fase e imagens de fluorescência da região de interesse. Amostragem sistemática de tiras de tecido fornece mapas das propriedades mecânicas dos tecidos que revelam locais variações espaciais no módulo de cisalhamento. Correlações entre propriedades mecânicas e características anatômicas subjacentes e patológicos ilustrar como a rigidez varia de acordo com deposição de matriz na fibrose. Estes métodos podem ser alargada a outros tecidos moles e processos da doença para revelar como as propriedades mecânicas dos tecidos locais variam no espaço e progressão da doença.

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Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

A rigidez da matriz extracelular influencia fortemente os comportamentos múltiplo de células aderentes. Rigidez da matriz varia espacialmente ao longo de um tecido, e sofre modificação nas condições de várias doenças. Aqui nós desenvolvemos métodos para caracterizar as variações espaciais na rigidez do tecido normal e pulmão fibrótico do mouse usando microindentation microscopia de força atômica.

Micro-Mecânica Caracterização do tecido pulmonar Usando Microscopia de Força Atômica

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

micro-mechanical-characterization-lung-tissue-using-atomic-force

Research

JoVE Journal

Biology

22.7K visualizações.  Harvard School of Public Health. A rigidez da matriz extracelular influencia fortemente os comportamentos múltiplo de células aderentes. Rigidez da matriz varia espacialmente ao longo de um tecido, e sofre modificação nas condições de várias doenças. Aqui nós desenvolvemos métodos para caracterizar as variações espaciais na rigidez do tecido normal e pulmão fibrótico do mouse usando microindentation microscopia de força atômica.

Vídeo: Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to investigate cells behavior at sub-cellular level with high spatial and temporal resolution was developed. Thus, an atomic force microscope (AFM) was integrated with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy and fast-spinning disk (FSD) confocal microscopy. The integrated system is broadly applicable across a wide range of molecular dynamic studies in any adherent live cells, allowing direct optical imaging of cell responses to mechanical stimulation in real-time. Significant rearrangement of the actin filaments and focal adhesions was shown due to local mechanical stimulation at the apical cell surface that induced changes into the cellular structure throughout the cell body. These innovative techniques will provide new information for understanding live cell restructuring and dynamics in response to mechanical force. A detailed protocol and a representative data set that show live cell response to mechanical stimulation are presented.

This paper aims to instruct the reader in the operation of an integrated atomic force-optical imaging microscope for mechanical stimulation of live cells in culture. A step-by-step protocol is presented. A representative data set that shows live cell response to mechanical stimulation is presented.

Resposta celular ao vivo para Estimulação mecânicas estudadas por Microscopia de Força Atômica e Óptica Integrada

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Biologia

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes. More than 700 human miRNAs have been identified so far with each having up to hundreds of unique target mRNAs. Computational tools, expression and proteomics assays, and chromatin-immunoprecipitation-based techniques provide important clues for identifying mRNAs that are direct targets of a particular miRNA. In addition, 3'UTR-reporter assays have become an important component of thorough miRNA target studies because they provide functional evidence for and quantitate the effects of specific miRNA-3'UTR interactions in a cell-based system. To enable more researchers to leverage 3'UTR-reporter assays and to support the scale-up of such assays to high-throughput levels, we have created a genome-wide collection of human 3'UTR luciferase reporters in the highly-optimized LightSwitch Luciferase Assay System. The system also includes synthetic miRNA target reporter constructs for use as positive controls, various endogenous 3'UTR reporter constructs, and a series of standardized experimental protocols.
Here we describe a method for co-transfection of individual 3'UTR-reporter constructs along with a miRNA mimic that is efficient, reproducible, and amenable to high-throughput analysis.

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3&#039;UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and have been shown to play a role in numerous biological processes. To better understand miRNA-UTR interactions, we have created a genome-wide collection of 3 UTR luciferase reporters paired with a novel luciferase gene and assay reagent, the LightSwitch system.

Metas de identificação de microRNAs humanos com o Sistema de ensaio de luciferase lightswitch usando 3&#39;UTR repórter-Constrói e um microRNA em células aderentes Mimic

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Preparação da amostra para microscopia da força atômica de virion único e imagem de fluorescência de super-resolução

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One of the primary risk factors of EAC is Barrett&#8217;s esophagus (BE), a metaplastic change of the normal squamous esophagus in response to chronic heartburn. Despite the well-established connection between EAC and BE, interrogation of the molecular events, particularly altered signaling pathways involving progression of BE to EAC, are poorly understood. Much of this is due to the lack of suitable in vitro models available to study these diseases. Recently, immortalized BE cell lines have become commercially available allowing for in vitro studies of BE. Here, we present a method for immunofluorescent staining of immortalized BE cell lines, allowing in vitro characterization of cell signaling and structure after exposure to therapeutic compounds. Application of these techniques will help develop insight into the mechanisms involved in BE to EAC progression and provide potential avenues for treatment and prevention of EAC.

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&amp;#8217;s Esophagus Cells

There is a discernible need for improved information on molecular drivers of Barrett&#8217;s Esophagus. Immunofluorescent staining is a useful technique for understanding the effects of cell signaling on cell morphology. We present a simple, effective protocol for the use of immunofluorescent staining to assess therapeutic treatment in Barrett&#8217;s Esophagus cells.

O método de imunofluorescência para Caracterização de Células Esôfago de Barrett

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Medindo a rigidez<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aortas Usando Microscopia de Força Atômica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the plant. Many sophisticated techniques have been developed to measure these properties; however, atomic force microscopy (AFM) remains the most convenient for studying cell wall elasticity at the cellular level. One of the most important limitations of this technique has been that only superficial or isolated living cells can be studied. Here, the use of atomic force microscopy to investigate the mechanical properties of primary cell walls belonging to the internal tissues of a plant body is presented. This protocol describes measurements of the apparent Young&#39;s modulus of cell walls in roots, but the method can also be applied to other plant organs. The measurements are performed on vibratome-derived sections of plant material in a liquid cell, which allows (i) avoiding the use of plasmolyzing solutions or sample impregnation with wax or resin, (ii) making the experiments fast, and (iii) preventing dehydration of the sample. Both anticlinal and periclinal cell walls can be studied, depending on how the specimen was sectioned. Differences in the mechanical properties of different tissues can be investigated in a single section. The protocol describes the principles of study planning, issues with specimen preparation and measurements, as well as the method of selecting force-deformation curves to avoid the influence of topography on the obtained values of elastic modulus. The method is not limited by sample size but is sensitive to cell size (i.e., cells with a large lumen are difficult to examine).

Studies of cell wall biomechanics are essential for understanding plant growth and morphogenesis. The following protocol is proposed to investigate thin primary cell walls in the internal tissues of young plant organs using atomic force microscopy.

Caracterizando as Propriedades Mecânicas da Parede Celular Primária em Órgãos de Plantas Vivas Usando Microscopia de Força Atômica

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the ...

Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy

Matrix stiffening has been recognized as one of the key drivers of the progression of liver fibrosis. It has profound effects on various aspects of cell behavior such as cell function, differentiation, and motility. However, as these processes are not homogeneous throughout the whole organ, it has become increasingly important to understand changes in the mechanical properties of tissues on the cellular level.
To be able to monitor the stiffening of collagen-rich areas within the liver lobes, this paper presents a protocol for measuring liver tissue elastic moduli with high spatial precision by atomic force microscopy (AFM). AFM is a sensitive method with the potential to characterize local mechanical properties, calculated as Young&#39;s (also referred to as elastic) modulus. AFM coupled with polarization microscopy can be used to specifically locate the areas of fibrosis development based on the birefringence of collagen fibers in tissues. Using the presented protocol, we characterized the stiffness of collagen-rich areas from fibrotic mouse livers and corresponding areas in the livers of control mice.
A prominent increase in the stiffness of collagen-positive areas was observed with fibrosis development. The presented protocol allows for a highly reproducible method of AFM measurement, due to the use of mildly fixed liver tissue, that can be used to further the understanding of disease-initiated changes in local tissue mechanical properties and their effect on the fate of neighboring cells.

We present a protocol to measure the elastic moduli of collagen-rich areas in normal and diseased liver using atomic force microscopy. The simultaneous use of polarization microscopy provides high spatial precision for localizing collagen-rich areas in the liver sections.

Medição da rigidez hepática usando microscopia de força atômica acoplada à microscopia de polarização

Matrix stiffening has been recognized as one of the key drivers of the progression of liver fibrosis. It has profound effects on various aspects of cell ...

Contact Mode Atomic Force Microscopy as a Rapid Technique for Morphological Observation and Bacterial Cell Damage Analysis

Electron microscopy is one of the tools required to characterize cellular structures. However, the procedure is complicated and expensive due to the sample preparation for observation. Atomic force microscopy (AFM) is a very useful characterization technique due to its high resolution in three dimensions and because of the absence of any requirement for vacuum and sample conductivity. AFM can image a wide variety of samples with different topographies and different types of materials. 
AFM provides high-resolution 3D topography information from the angstrom level to the micron scale. Unlike traditional microscopy, AFM uses a probe to generate an image of the surface topography of a sample. In this protocol, the use of this type of microscopy is suggested for the morphological and cell damage characterization of bacteria fixed on a support. Strains of Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922), and Pseudomonas hunanensis (isolated from garlic bulb samples) were used. In this work, bacterial cells were grown in specific culture media. To observe cell damage, Staphylococcus aureus and Escherichia coli were incubated with different concentrations of nanoparticles (NPs). 
A drop of bacterial suspension was fixed on a glass support, and images were taken with AFM at different scales. The images obtained showed the morphological characteristics of the bacteria. Further, employing AFM, it was possible to observe the damage to the cellular structure caused by the effect of NPs. Based on the images obtained, contact AFM can be used to characterize the morphology of bacterial cells fixed on a support. AFM is also a suitable tool for the investigation of the effects of NPs on bacteria. Compared to electron microscopy, AFM is an inexpensive and easy-to-use technique.

Here, we present the application of atomic force microscopy (AFM) as a simple and fast method for bacterial characterization and analyze details such as the bacterial size and shape, bacterial culture biofilms, and the activity of nanoparticles as bactericides.

Microscopia de Força Atômica em Modo de Contato como Técnica Rápida para Observação Morfológica e Análise de Danos Celulares Bacterianos

Electron microscopy is one of the tools required to characterize cellular structures. However, the procedure is complicated and expensive due to the ...

Medição da rigidez em capilares retinianos de camundongos e matriz subendotelial

Isolation of Mouse Retinal Capillaries and Subendothelial Matrix for Stiffness Measurement Using Atomic Force Microscopy

Retinal capillary degeneration is a clinical hallmark of the early stages of diabetic retinopathy (DR). Our recent studies have revealed that diabetes-induced retinal capillary stiffening plays a crucial and previously unrecognized causal role in inflammation-mediated degeneration of retinal capillaries. The increase in retinal capillary stiffness results from the overexpression of lysyl oxidase, an enzyme that crosslinks and stiffens the subendothelial matrix. Since tackling DR at the early stage is expected to prevent or slow down DR progression and associated vision loss, subendothelial matrix, and capillary stiffness represent relevant and novel therapeutic targets for early DR management. Further, direct measurement of retinal capillary stiffness can serve as a crucial preclinical validation step for the development of new imaging techniques for non-invasive assessment of retinal capillary stiffness in animal and human subjects. With this view in mind, we here provide a detailed protocol for the isolation and stiffness measurement of mouse retinal capillaries and subendothelial matrix using atomic force microscopy.

Autor em destaque: Investigando a rigidez vascular e a inflamação na retinopatia diabética precoce

We recently identified retinal capillary stiffening as a new paradigm for retinal dysfunction associated with diabetes. This protocol elaborates the steps for isolation of mouse retinal capillaries and the subendothelial matrix from retinal endothelial cultures, followed by a description of the stiffness measurement technique using atomic force microscopy.