SV agradece o apoio financeiro do NIH K22AI077353 ea Fundação Landenberger. KR agradece o financiamento do NIH (5SC1GM083754).

<ol>
	<li>Maniatis, T., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extensive+network+of+coupling+among+gene+expression+machines.">An extensive network of coupling among gene expression machines.</a> Nature. 416, 499-506 (2002).</li><li>Wahle, E., Ruegsegger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'-End+processing+of+pre-mRNA+in+eukaryotes.">3'-End processing of pre-mRNA in eukaryotes.</a> FEMS microbiology reviews. 23, 277-295 (1999).</li><li>Colgan, D. F., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+regulation+of+mRNA+polyadenylation.">Mechanism and regulation of mRNA polyadenylation.</a> Genes Dev. 11, 2755-2766 (1997).</li><li>Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+3'+untranslated+region+in+post-transcriptional+regulation+of+protein+expression+in+mammalian+cells.">The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells.</a> RNA biology. 9, 563-576 (2012).</li><li>Danckwardt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prothrombin+3'end+formation+signal+reveals+a+unique+architecture+that+is+sensitive+to+thrombophilic+gain-of-function+mutations.">The prothrombin 3'end formation signal reveals a unique architecture that is sensitive to thrombophilic gain-of-function mutations.</a> Blood. 104, 428-435 (2004).</li><li>Moreira, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+upstream+sequence+element+of+the+C2+complement+poly(A)+signal+activates+mRNA+3'+end+formation+by+two+distinct+mechanisms.">The upstream sequence element of the C2 complement poly(A) signal activates mRNA 3' end formation by two distinct mechanisms.</a> Genes Dev. 12, 2522-2534 (1998).</li><li>Hall-Pogar, T., Zhang, H., Tian, B., Lutz, C. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+mRNA+3'+end+processing+is+distinctively+regulated+by+eIF3f,+CDK11,+and+splice+factor+9G8.">HIV-1 mRNA 3' end processing is distinctively regulated by eIF3f, CDK11, and splice factor 9G8.</a> Mol Cell. 36, 279-289 (2009).</li><li>Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+transcription+initiation+by+RNA+polymerase+II+in+a+soluble+extract+from+isolated+mammalian+nuclei.">Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei.</a> Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).</li><li>Aurup, H., Williams, D. M., Eckstein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2'-Fluoro-+and+2'-amino-2'-deoxynucleoside+5'-triphosphates+as+substrates+for+T7+RNA+polymerase.">2'-Fluoro- and 2'-amino-2'-deoxynucleoside 5'-triphosphates as substrates for T7 RNA polymerase.</a> Biochemistry. 31, 9636-9641 (1992).</li><li>Keller, W., Bienroth, S., Lang, K. M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+and+polyadenylation+factor+CPF+specifically+interacts+with+the+pre-mRNA+3'+processing+signal+AAUAAA.">Cleavage and polyadenylation factor CPF specifically interacts with the pre-mRNA 3' processing signal AAUAAA.</a> EMBO J. 10, 4241-4249 (1991).</li><li>Takagaki, Y., Ryner, L. C., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+factors+are+required+for+3'-end+cleavage+of+pre-mRNAs.">Four factors are required for 3'-end cleavage of pre-mRNAs.</a> Genes Dev. 3, 1711-1724 (1989).</li><li>Takagaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multisubunit+factor,+CstF,+is+required+for+polyadenylation+of+mammalian+pre-mRNAs.">A multisubunit factor, CstF, is required for polyadenylation of mammalian pre-mRNAs.</a> Genes Dev. 4, 2112-2120 (1990).</li><li>Ruegsegger, U., Blank, D., Keller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pre-mRNA+cleavage+factor+Im+is+related+to+spliceosomal+SR+proteins+and+can+be+reconstituted+in+vitro+from+recombinant+subunits.">Human pre-mRNA cleavage factor Im is related to spliceosomal SR proteins and can be reconstituted in vitro from recombinant subunits.</a> Mol Cell. 1, 243-253 (1998).</li><li>Vries, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pre-mRNA+cleavage+factor+II(m)+contains+homologs+of+yeast+proteins+and+bridges+two+other+cleavage+factors.">Human pre-mRNA cleavage factor II(m) contains homologs of yeast proteins and bridges two other cleavage factors.</a> EMBO J. 19, 5895-5904 (2000).</li><li>Gilmartin, G. M., Nevins, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ordered+pathway+of+assembly+of+components+required+for+polyadenylation+site+recognition+and+processing.">An ordered pathway of assembly of components required for polyadenylation site recognition and processing.</a> Genes Dev. 3, 2180-2190 (1989).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+human+pre-mRNA+3'+processing+complex.">Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex.</a> Mol Cell. 33, 365-376 (2009).</li><li>Bentley, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rules+of+engagement:+co-transcriptional+recruitment+of+pre-mRNA+processing+factors.">Rules of engagement: co-transcriptional recruitment of pre-mRNA processing factors.</a> Curr Opin Cell Biol. 17, 251-256 (2005).</li><li>Tian, B., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+cleavage+and+polyadenylation:+the+long+and+short+of+it.">Alternative cleavage and polyadenylation: the long and short of it.</a> Trends Biochem Sci. 38, 312-320 (2013).</li><li>Ryner, L. C., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+accurate+and+efficient+mRNA+3'+end+cleavage+and+polyadenylation+of+a+simian+virus+40+early+pre-RNA+in+vitro.">Requirements for accurate and efficient mRNA 3' end cleavage and polyadenylation of a simian virus 40 early pre-RNA in vitro.</a> Molecular and Cellular Biology. 7, 495-503 (1987).</li><li>Hirose, Y., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatine+phosphate,+not+ATP,+is+required+for+3'+end+cleavage+of+mammalian+pre-mRNA+in+vitro.">Creatine phosphate, not ATP, is required for 3' end cleavage of mammalian pre-mRNA in vitro.</a> J Biol Chem. 272, 29636-29642 (1997).</li><li>Ryan, K., Khleborodova, A., Pan, J., Ryan, X. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+activators+of+pre-mRNA+3'+cleavage.">Small molecule activators of pre-mRNA 3' cleavage.</a> RNA. 15, 483-492 (2009).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A in vitro reacção de corte pré-mRNA 3 &#39;, realizada em extratos nucleares de células HeLa ou com fatores de clivagem fracionado a partir de extractos, permitiu a identificação dos fatores de clivagem do núcleo e seus principais complexos 16-21. Muitas outras proteínas associadas a estes factores, foram recentemente identificadas 22, e a reacção in vitro, pode continuar a lançar luz sobre a forma como estas proteínas contribuem para a reacção. Talvez, porque a rea...

A biossíntese da maioria dos RNAs mensagem eucarióticas maduros (mRNAs) requer várias modificações pós-transcricional, como nivelamento, splicing e poliadenilação. Estas modificações são geralmente acoplado a assegurar o correcto processamento 1 e aumentam fortemente a estabilidade do mRNA. A 3 &#39;a formação final de mamífero pré-ARNm é gerada por clivagem endonucleolítica de ARN nascente, seguido pela adição de resíduos de adenilato a 5&#39; clivada do produto por poli (A) polimerase (PAP) 2-4. Nos mamíferos, a clivagem é realizada por um complexo de proteína de multicomponentes, de aproximadamente 800 kDa, que monta em sequências pré-ARN específicas. O poli (A) sequência de sinal, uma sequência AAUAAA hexanucleotide canónica altamente conservada, dirige o local de clivagem de cerca de 10-30 nt a jusante. Este local é especificamente reconhecido pelo factor de clivagem e poliadenilação especificidade (CPSF) e a 73 kDa subunidadeCSPF contém a actividade de endonuclease. O fator de estimulação clivagem (CstF) liga-se a mais degenerada GU-ou U-ricos seqüência elemento a jusante da poli (A) site. Também é necessária para a clivagem é o factor de clivagem de mamífero I (MCIF), e o factor de clivagem de mamífero II (CFII). MCIF liga os sítios específicos UGUA (N) em elementos de seqüência a montante (usa) que foram definidos por uma série de genes e parecem estar envolvidos em processos fisiológicos importantes 5-8. In vitro, as reacções de processamento de RNA são geralmente analisada pela utilização de substratos de RNA radiomarcados 9-12. Estes podem ser sintetizados por meio de escoamento de transcrição a partir do promotor de T7 de bacteriófago ou SP6. Quando se estuda um local de poliadenilação que não foi caracterizado antes, é necessário utilizar o ADN genómico, em vez de ADNc para gerar o substrato de RNA, como sequências a jusante importantes podem não estar presentes em cDNA. Substratos projeto para incluir, pelo menos, 150 nt upstream e 50 nt a jusante do sítio de clivagem / final no mRNA maduro. O produto de clivagem migra mais rapidamente do que o substrato; no entanto, porque os outros fragmentos podem ser gerados por acção de nucleases não específica, a especificidade da reacção tem de ser verificado pela sua dependência em relação as sequências de sinal de processamento de correcção. Consequentemente, os substratos de RNA, com um ponto de mutação na sequência AAUAAA (por exemplo AAGAAA) servir como um controlo negativo para a reacção de clivagem. Dado que uma pequena quantidade de ARN marcado radioactivamente é usado para as reacções de clivagem, RNases presentes em abundância elevada na maior parte dos extractos nucleares pode ser problemático, e limitar a escolha do material de partida para a preparação do extracto. Células HeLa tendem a conter níveis baixos de RNases endógenos e, portanto, um bom desempenho nestes ensaios. A clivagem endonucleolítica dos substratos de RNA in vivo e in vitro, é imediatamente seguido por poli (A) adição, quis a intermediário clivada não está presente em quantidades detectáveis. Assim, para estudar ou uma sequência ou as proteínas envolvidas na reacção de clivagem do RNA específico, as experiências são feitas em condições que impedem a ocorrência de poliadenilação. Não há dependência de clivagem em poliadenilação, ou vice-versa, de modo que se pode parar de poliadenilação, sem prejudicar a reacção de clivagem. Deste modo, o ATP é substituído por um análogo da cadeia de terminação que carece de um grupo hidroxilo a 3 &#39;, de modo que apenas um único nucleótido podem ser incorporados no local de poli (A) e apenas ARN clivado pode ser detectado. Dada a complexidade e elevado grau de particularidade deste tipo de ensaio, os autores descrevem um protocolo detalhado de vídeo para estudar a clivagem endonucleolítica através da maquinaria de clivagem / poli (A) de precursores de mRNA in vitro. Nós descrevemos como preparar extratos nucleares competentes, gerar substratos RNA radioativos, realizar a reacção de corte, bem como analisar e interpretar o resultadoprodutos ing. Figura 1 mostra um exemplo de ARN que codificam para a extremidade do substrato de HIV-1 pre-ARNm da 3 &#39;a ser utilizada para um ensaio de clivagem. A extremidade 3 &#39;do genoma de RNA do HIV é composto por muitas sequências reguladoras importantes, tais como o local poli (A), uma região rica em G+ L, e o elemento de utilização, que são necessárias para a maturação eficiente dos transcritos de ARNm virais 13 . Neste exemplo, seria de esperar que o substrato RNA a ser 338 nt e após clivagem 237 nt. Se poliadenilação foi autorizada a ocorrer, uma mancha de produtos seria observado entre 237 e 437 nt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="757">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1L Celstir Flask</td>
			<td style="width:141px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">356884</td>
			<td style="width:281px;">Different sizes available</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4 Position Slow Speed Stirrer</td>
			<td style="width:141px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">12621-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Swinging Bucket Centrifuge</td>
			<td style="width:141px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:281px;">Allegra x-15R with SX4500 Rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultra Centrifuge</td>
			<td style="width:141px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Optima L-100 XP Ultra with SW41 Rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Table Top Centrifuge 5417R</td>
			<td style="width:141px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Refridgerated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Thermomixer incubator</td>
			<td style="width:141px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">250ml Conicle Tubes</td>
			<td style="width:141px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50ml Conicle Tubes</td>
			<td style="width:141px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultra-clear Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:141px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">JOKLIK Modified MEM</td>
			<td style="width:141px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">04-719Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:141px;">Atlas&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F-0500-A</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Glut:Pen:Strep</td>
			<td style="width:141px;">Gemini Bio-Products</td>
			<td style="width:119px;">400-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1M Tris-HCl pH 8.0</td>
			<td style="width:141px;">Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">46-031-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:141px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">194844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DTT</td>
			<td style="width:141px;">Alexis Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">280-001-G-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5M Sodium Chloride Solution</td>
			<td style="width:141px;">Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">46-032-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA 0.5M Solution</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E7889-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PMSF</td>
			<td style="width:141px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">36978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A702-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">cOmplete EDTA-Free Protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:141px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">04 693 132 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes Kit</td>
			<td style="width:141px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">66372</td>
			<td>MWCO 7000 0.5ml-3ml</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">15ml Dounce Tissue grinder set</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9938-1SET</td>
			<td>Different sizes available</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Expand High Fidelity PCR Kit</td>
			<td style="width:141px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11 732 650 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10mM dNTP Mix</td>
			<td style="width:141px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">Y02256</td>
			<td>10mM each nucleotide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MaxiScript SP6/T7 Kit</td>
			<td style="width:141px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">m7G(5&#39;)ppp(5&#39;) G RNA Cap</td>
			<td style="width:141px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">S1404S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Century Marker Template Plus</td>
			<td style="width:141px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM7782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Easytides UTP [alpha-32p]-250uCi</td>
			<td style="width:141px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">BLU507H250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel loading buffer II</td>
			<td style="width:141px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">8546G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DEPC treated water</td>
			<td style="width:141px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM9906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10x TAE</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP13354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">10x TBE</td>
			<td style="width:141px;">Ameresco Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">0658-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10x PBS</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP399-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP169-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td style="width:141px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TEMED</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium Acetate</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A637-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">40% 19:1 Acrylamide:Bis-acrylamide</td>
			<td style="width:141px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycogen</td>
			<td style="width:141px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10 901 393 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100% Absolute Ethanol 200 Proof</td>
			<td style="width:141px;">Acros</td>
			<td style="width:119px;">61509-0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acid Phenol-Chloroform</td>
			<td style="width:141px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">9720</td>
			<td>For RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scintilation Fluid</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">SX18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rnase Inhibitor</td>
			<td style="width:141px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">N261B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Poly (Vinyl alcohol) PVA</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P8136-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Creatine Phosphate</td>
			<td style="width:141px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">2380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100mM dATP</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2560-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:141px;">Acros</td>
			<td style="width:119px;">23042-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1700-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Adjustable Sequencing Unit</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z351881-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Binder Clips</td>
			<td style="width:141px;">Office Depot</td>
			<td style="width:119px;">838-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">20cmx42cm glass plates</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z352543</td>
			<td>1SET</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">20cmx22cm glass plates</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z35252-7</td>
			<td>1SET</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">20cmx42cm Aluminum Cooling Plates</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z352667</td>
			<td>1EA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4mmx22cm Spacers</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z35230-6</td>
			<td>1SET</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4mmx42cm Spacers</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z352314-1</td>
			<td>1SET</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">8-well Comb</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z35195-4</td>
			<td>1EA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">16-well Comb</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z351962</td>
			<td>1EA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">32-well Comb</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z351970</td>
			<td>1EA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel Repel Coating</td>
			<td style="width:141px;">C.B.S. Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SGR-0401</td>
			<td>or SGR-0101 for individual bottle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel Loading Tips</td>
			<td style="width:141px;">Rainin</td>
			<td style="width:119px;">GT-10-4</td>
			<td>0.1-10uL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sequencing PowerPac HV</td>
			<td style="width:141px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">PowerPac HV</td>
			<td>5000V/500mA/400W</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel Dryer Model 583</td>
			<td style="width:141px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">Model 583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hydrotech Vacuum Pump for gel dryer</td>
			<td style="width:141px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glogos II Glow-in-the-dark Markers</td>
			<td style="width:141px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">420201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Film 8x10</td>
			<td style="width:141px;">Midsci</td>
			<td style="width:119px;">BX810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Film 14x17</td>
			<td style="width:141px;">Phenix</td>
			<td style="width:119px;">F-BX1417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Autoradiography Cassette</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FBCA 1417</td>
			<td>8x10 size available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of rna processing reactions using cell free systems: 3' end cleavage of pre-mrna substrates in vitro

A extremidade 3 &#39;do ARNm de mamíferos não é formada por terminação abrupta de transcrição por ARN-polimerase II (RNPII). Em vez disso, RNPII sintetiza mRNA precursor além do final de RNAs maduros, e um processo ativo de atividade endonuclease é necessário em um site específico. A clivagem do RNA precursor ocorre normalmente de 10-30 nt a jusante do local de poliA de consenso (AAUAAA) após os dinucleótidos CA. As proteínas do complexo de clivagem, um complexo de proteínas multifatorial de aproximadamente 800 kDa, realizar essa atividade nuclease específica. Sequências de RNA específicas a montante e a jusante do local de poliA controlar o recrutamento do complexo de clivagem. Imediatamente após a clivagem, os pré-mRNAs são polyadenylated pela polimerase poli (PAP) para produzir amadurecer mensagens RNA estáveis. Processamento da extremidade 3 &#39;de um transcrito de ARN pode ser estudado utilizando extractos nucleares celulares com substratos de ARN específicos radiomarcados. Em suma, um longo 32 &lt;/ Sup&gt; clivada RNA precursor marcado com P é incubado com extractos nucleares in vitro, e a clivagem é avaliada por electroforese em gel e autorradiografia. Quando ocorre a clivagem adequada, um curto 5 &#39;clivada do produto é detectado e quantificado. Aqui, nós descrevemos o ensaio de clivagem em pormenor utilizando, como um exemplo, o processamento da extremidade 3 &#39;de HIV-1 ARNm.

Os resultados representativos de um ensaio de clivagem do ARN de poli (A), locais de HIV-1 (Figura 2). Podemos observar que a ARN substrato não clivado, que é a banda de migração mais lenta no topo do gel. O produto de clivagem específica é a mais intensa banda fragmento mais curto que é executado mais rapidamente no gel com o tamanho esperado, e é especificamente ausente do ensaio de clivagem da mutpoly (A) de controlo que contém uma mutação de ponto na sequência de poli-A (mutPolyA) ARN su...

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Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3&#039; End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

RNA polimerase II sintetiza um RNA precursor que se estende para além da extremidade 3 &#39;do ARNm maduro. A fim de o RNA maduro é gerado cotranscriptionally, num local ditada por sequências de RNA, através da actividade de endonuclease do complexo de clivagem. Aqui, detalhamos o método para estudar as reações de clivagem in vitro.

Análise das reacções de processamento de RNA utilizando células Sistemas gratuitas: 3 &#39;Fim de clivagem de pré-mRNA Substratos<em&gt; In vitro</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

analysis-rna-processing-reactions-using-cell-free-systems-3-end

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

12.7K visualizações.  The Scripps Research Institute.  RNA polimerase II sintetiza um RNA precursor que se estende para além da extremidade 3 'do ARNm maduro. A fim de o RNA maduro é gerado cotranscriptionally, num local ditada por sequências de RNA, através da actividade de endonuclease do complexo de clivagem. Aqui, detalhamos o método para estudar as reações de clivagem in vitro. 