Os autores gostariam de agradecer a assistência técnica da C. Zambataro durante as filmagens do presente protocolo. Agradecemos o apoio da Fundação Glenn de Pesquisa Médica (SM), a Fundação Hillblom, e os Institutos Nacionais de Saúde para um prêmio Centro de Choque Nathan (P30AG025708) e PO1AG025901. JMF foi apoiada por T32AG000266 adjudicado ao Instituto Buck de Pesquisa sobre o Envelhecimento.

<ol>
	<li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry.">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> Am. J. Physiol. 271 (3 Pt 2), H1250-H1255 (1996).</li><li>Shioya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+isolating+healthy+heart+cells+from+mouse+models.">A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models.</a> J. Physiol. Sci. 57 (6), 327-335 (2007).</li><li>Guo, G., Huss, M., Tong, G. Q., Wang, C., Li Sun, L., Clarke, N. D., Robson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+cell+fate+decisions+revealed+by+single-cell+gene+expression+analysis+from+zygote+to+blastocyst.">Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst.</a> Dev. Cell. 18 (4), 675-685 (2010).</li><li>Narsinh, K. H., Sun, N., Sanchez-Freire, V., Lee, A. S., Almeida, P., Hu, S., Jan, T., Wilson, K. D., Leong, D., Rosenberg, J., Yao, M., Robbins, R. C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptional+profiling+reveals+heterogeneity+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells.</a> J. Clin. Invest. 121 (3), 1217-1221 (2011).</li><li>D'haene, B., Vandesompele, J., Hellemans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+and+objective+copy+number+profiling+using+real-time+quantitative+PCR.">Accurate and objective copy number profiling using real-time quantitative PCR.</a> Methods. 50 (4), 262-270 (2010).</li><li>Cook, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Anatomy+of+the+Laboratory+Mouse.">The Anatomy of the Laboratory Mouse.</a> Informatics. , (1965).</li><li>Gaillard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aorta.">Aorta.</a> Radiopaedia. , (2008).</li><li>St&#229;hlberg, A., Andersson, D., Aurelius, J., Faiz, M., Pekna, M., Kubista, M., Pekny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+cell+populations+with+single-cell+gene+expression+profiling:+correlations+and+identification+of+astrocyte+subpopulations.">Defining cell populations with single-cell gene expression profiling: correlations and identification of astrocyte subpopulations.</a> Nucleic Acids Res. 39 (4), e24-e24 (2011).</li><li>Zhong, J. F., Chen, Y., Marcus, J. S., Scherer, A., Quake, S. R., Taylor, C. R., Weiner, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+processor+for+gene+expression+profiling+of+single+human+embryonic+stem+cells.">A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells.</a> Lab Chip. 8 (1), 68-74 (2008).</li><li>Bahar, R., Hartmann, C. H., Rodriguez, K. A., Denny, A. D., Busuttil, R. A., Dollé, M. E., Calder, R. B., Chisholm, G. B., Pollock, B. H., Klein, C. A., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+cell-to-cell+variation+in+gene+expression+in+ageing+mouse+heart.">Increased cell-to-cell variation in gene expression in ageing mouse heart.</a> Nature. 441 (7096), 1011-1014 (2006).</li><li>Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature,+nurture,+or+chance:+stochastic+gene+expression+and+its+consequences.">Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences.</a> Cell. 135 (2), 216-226 (2008).</li><li>Elowitz, M., Levine, A., Siggia, E., Swain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; Acesso livre e produção deste deste artigo é patrocinado Sigma-Aldrich.</p

Este método tem a possibilidade de gerar cardiomiócitos para um número de funcionais, bem como estudos de expressão gênica. O exame de células individuais é uma área crescente na análise de expressão gênica. A vantagem de examinar os níveis de transcrição ao nível da célula é que ela permite o exame de uma população celular pura, que não é possível a partir de preparações de tecido inteiro. Além disso, a análise única célula permite a análise de variação estocástica dos níveis de mRNA em células individuais para definir populações de células que foram previamente pensado para ser 8,9 homogênea. Além de identificar genes que são potencialmente estocásticos em sua expressão genética 10,11,12, o método também permite a identificação de populações de células raras definidos por seus perfis de expressão gênica. Embora este método oferece uma série de emocionantes usos potenciais em análise de expressão gênica, há somressalvas e considerações e na utilização de células individuais. A principal limitação para a análise única célula, é a coleção de células suficientes no experimento para alcançar significância estatística em relação à métrica de interesse, por exemplo variância. Nos casos em que o número de células isoladas do tecido de interesse não é uma limitação, pode-se examinar centenas de células por grupo, utilizando abordagens como a próxima geração de sequenciamento, ou matrizes nanofluidic. No entanto, em alguns casos, pode haver dificuldade na obtenção de células suficientes a partir do tecido de interesse. Isso pode em parte ser causada por procedimentos intensivos tempo idiossincrática para a recolha do tipo de célula-alvo. No entanto, um planejamento cuidadoso e preparação antes de prosseguir com a coleta de células individuais podem ainda permitir a análise de células rigorosa único com erro técnico limitado. Ao examinar os resultados deve-se considerar, que, apesar de este procedimento para isolar células tem sido utilizado em inúmeros Studies (incluindo microscopia, eletrofisiologia, etc), o isolamento em si poderia potencialmente efeito a expressão do gene. Como acontece com qualquer método que manipula as amostras biológicas, os resultados de suas descobertas devem ser cuidadosamente validada para garantir a expressão única célula é representativa do próprio tecido e viés não técnicos. Métodos, tais como a hibridização in situ pode ser útil para verificar esses resultados no tecido intacto. Por último, é fundamental para garantir que os dados gerados é cuidadosamente verificado para controle de qualidade. Os dados mostrados na Figura 8 demonstra que as análises de qPCR pode ser muito robusto em sua especificidade, como o ensaio # 13 (A13) ou ter um alto nível de variabilidade que pode levar a variância técnicas, tais como ensaio # 34 (A34).

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 71378 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 60128 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido pirúvico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4562 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54457 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1020 </td><td></td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 monobásico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> Dextrose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G6721 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 72068 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O3777 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 21115 </td><td></td></tr><tr><td> Protease, Tipo XIV </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5147 </td><td></td></tr><tr><td> Collaoxigenase, Tipo I </td><td> Worthington </td><td> C9891 </td><td></td></tr><tr><td> 1x tampão Suspensão DNA (10 mM Tris, pH 8,0, 0,1 mM EDTA) </td><td> TEKnova, </td><td> PN T0221 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B8667 </td><td></td></tr><tr><td> Pentobarbital sódico </td><td> Henry Schein Vet. * Oferta </td><td> Contactar com fornecedor para encomendar </td><td> * Devem ser adquiridos através de um veterinário ou animais de laboratório profissional </td></tr><tr><td> ExoSAP TI </td><td> Affymetrix / USB </td><td> 78201 </td><td></td></tr><tr><td> CellsDirect Mix Rxn 2x </td><td> Invitrogen </td><td> 11737-030 </td><td></td></tr><tr><td> SuperScript III RT Platinum Taq Mix </td><td> Invitrogen </td><td> 10928-042 </td><td></td></tr><tr><td> RT-Mix STA Primer </td><td> IDT </td><td> Personalizado </td><td></td></tr><tr><td> Água livre de nuclease </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> W4502 </td><td></td></tr><tr><td> WTA2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50rxn </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick kit de purificação de PCR </td><td> Qiagen </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiacube </td><td> Qiagen </td><td> 9001292 </td><td></td></tr><tr><td> Espectrofotômetro NanoDrop </td><td>NanoDrop </td><td> 2000c </td><td></td></tr><tr><td> Bioanalyzer DNA kit 7500 </td><td> Agilent </td><td> 7500 kit </td><td></td></tr><tr><td> Um kit Labeling Cor </td><td> Roche-NimbleGen </td><td> 5223555001 </td><td></td></tr><tr><td> Mus musculus série 12x135k </td><td> Roche-NimbleGen </td><td> 5543797001 </td><td></td></tr><tr><td> GenePix 4200A Scanner </td><td> Dispositivos moleculares </td><td> 4200A </td><td></td></tr><tr><td> TransPlex Kit Completo Amplification Whole Transcriptoma (WTA2 Kit) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50RXN </td><td></td></tr></tbody></table>

single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes

Enquanto numerosos estudos têm examinado as mudanças de expressão gênica de homogenatos de tecido do coração, isso impede de estudar a variação estocástica inerente entre as células dentro de um tecido. Isolamento de populações puras de cardiomiócitos através de uma perfusão colagenase de corações de camundongos facilita a geração de microarrays única célula para a expressão do gene toda transcriptoma, ou qPCR de metas específicas usando arrays nanofluidic. Descrevemos aqui um procedimento para examinar única célula perfis de expressão gênica dos cardiomiócitos isolados do coração. Este paradigma permite a avaliação das métricas de interesse que não são dependentes da média (por exemplo, entre variância células dentro de um tecido) que não é possível ao usar fluxos de trabalho convencionais tecido inteiro para a avaliação da expressão gênica (Figura 1). Temos conseguido amplificação robusta do microgramas única célula transcriptoma rendendo cDNA de dupla fita que facilita o uso de microarrays na icélulas INDIVIDUAIS. No procedimento que descrevem o uso de matrizes NimbleGen que foram escolhidos devido a sua facilidade de uso e capacidade de personalizar o seu design. Alternativamente, uma transcriptase reversa - amplificação do alvo específico (RT-STA) reação, permite qPCR de centenas de alvos por nanofluidic PCR. Usando um desses enfoques, é possível examinar a variabilidade de expressão entre as células, bem como examinar perfis de expressão de tipos de células raras a partir de um tecido. No geral, o único celular abordagem a expressão do gene permite a geração de dados que podem potencialmente identificar perfis de expressão idiossincrática que normalmente são em média para fora quando examinar expressão de milhões de células de homogenatos típicos gerados a partir de tecidos todo.

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Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Perfil de expressão única célula permite a análise detalhada de expressão gênica de células individuais. Descrevemos métodos para o isolamento dos cardiomiócitos, e preparar a lisados ​​resultando tanto para microarray transcriptoma todo ou qPCR de metas específicas.

Profiling única célula transcricional dos cardiomiócitos de rato adulto

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

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17.2K visualizações.  Buck Institute for Research on Aging. Perfil de expressão única célula permite a análise detalhada de expressão gênica de células individuais. Descrevemos métodos para o isolamento dos cardiomiócitos, e preparar a lisados ​​resultando tanto para microarray transcriptoma todo ou qPCR de metas específicas.