Os autores agradecem a Nina Bispham por sua assistência técnica. Este trabalho foi financiado pela American Heart Association (12POST11920023), eo NIH (K23DK088833, K23DK087859).

Este protocolo segue as diretrizes do Conselho de Revisão Institucional Múltipla Colorado (COMIRB). 1. Preparação para a sessão de testes <ol><li> Os participantes devem seguir estas restrições para medições mais precisas: 12 hr rápido de alimentos e cafeína, 12 hr contenção de exercício, 12 hr restrição de fumar, se,&gt; 4 contenção meia-vida aplicável a partir de medicamentos, se possível (pode não ser viável em um população, tais como pacientes com DRC), e as mulheres na pré-menopausa deve ser testada em dias 1-7 do ciclo menstrual para minimizar influências hormonais. </li><li> Preparar 500 ml do tampão de dissociação por adição de 2 ml de 0,5 M ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 0,05 g de heparina (180 unidades USP / mg), e 2,5 g de albumina de soro bovino a 476,8 ml de tampão fosfato salino (PBS) a pH de 7,4. Este pode ser armazenado a 4 ° C durante vários meses. </li><li> Ligue ultra-som, computador, ea hemodinâmica não-invasivaWorkstation (NIHem, equipamentos de rigidez arterial). Conecte os cabos a saída de ultra-som para a caixa de gatilho a onda R computador. </li></ol> 2. Coleta e Processamento de células do endotélio vascular <ol><li> Uma enfermeira ou médico treinado realiza a coleta (passos 2,2-2,5, 2,7) e pesquisador coleta e processa os fios (passos 2.6, 2,8-2,19) </li><li> Prepare o site antecubital com um anti-séptico tópico, aplicar um torniquete, localizar veia e canular com um 18 G cateter. Coloque um adaptador heplock no final da IV. </li><li> Calçar luvas estéreis e colocar cortinas fenestrados estéreis sobre o site. </li><li> Coloque 2 J-fios nas cortinas. Puxar o arco do &quot;J&quot; para desenrolar o &quot;J&quot; forma de dois fios. </li><li> Destampar o heplock e alimentar J-fio na veia com aproximadamente 8 cm. Empurre para trás e para a frente várias vezes antes de retirar o fio. Evite sangue bruto no fio. </li><li> Use o alicate para cortar os fios para que eles se encaixam em umTubo de 50 ml contendo ~ 30 mL de tampão de dissociação </li><li> Repita o passo 2.5 para segundo fio. </li><li> Repita o passo 2.6 para segundo fio. Retornar tubo para laboratório molhado. </li><li> Apertar os fios com um par de pinças e segurar os fios no interior do tubo, mas por cima da solução. Por 10 minutos, use uma pipeta motorizada para coletar várias vezes o buffer de dissociação do tubo de 50 ml e liberá-lo para que ele corre para baixo do comprimento dos fios para enxaguar e vibrar os fios, em seguida, sacudi o excesso de fluido dos fios para dentro do tubo. </li><li> Centrifugar durante 7 minutos a 400 xg e 4 ° C. </li><li> Prepare a solução de formaldeído em papel alumínio coberto tubo através da combinação de 100 ml de solução de formaldeído + 900 ml de PBS. </li><li> Lentamente remova o tubo de centrífuga, ligar a bomba de vácuo, coloque uma ponteira na extremidade do tubo de sucção e deixar ~ 400 ml no tubo, limpando fora o resto, sem perturbar o sedimento. </li><li> Cubra com papel alumínio e pipeta solução de formaldeído 1 ml emo tubo para fixar a amostra. Não ressuspender. Incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Prepare 8 lâminas por meio de rotulagem com o assunto e informações visita de estudo e elaboração de um oval em cada slide com uma caneta pap. </li><li> Adicionar 15 ml de PBS, ressuspender, e centrifuga-se durante 5 min a 400 xg e 4 ° C. </li><li> Repita o passo 2.15, adicione 12 ml de PBS, ressuspender, e centrifugar por 6 min a 400 xg e 4 ° C. </li><li> Lentamente remova o tubo de centrífuga, ligar a bomba de vácuo, coloque uma ponteira na extremidade do tubo de sucção e deixar ~ 2 ml no tubo, limpando fora o resto, sem perturbar o sedimento. </li><li> Ressuspender e pipeta uniformemente entre as 8 lâminas nas áreas ovais. </li><li> Coloque em estufa a 37 ° C durante 5 horas e, em seguida, armazenar a -80 ° C até que esteja pronto para análise (amostras estará bem por muitos anos). </li></ol> 3. Avaliação da febre aftosa BA e aPWV <ol><li> Tenha investigação mudança assunto em calções descartáveis ​​e têm him / sua supina mentira em um, não ofuscante, clima controlado sala silenciosa. </li><li> Coloque o número apropriado de ECG para o ultra-som específico e dispositivo de rigidez arterial (este procedimento usa o não-invasiva hemodinâmica Workstation [NIHem] para medir a rigidez arterial, que requer 4 eletrodos) e manguito de pressão arterial no assunto. </li><li> Após 20 min, começam as leituras de pressão sanguínea. Realizar pelo menos 3, e repetir até que as medições estão dentro de 5 mmHg, descansando 2 minutos entre cada leitura. </li><li> Comece tonometria pela palpação do pulso da artéria braquial e colocar o tonômetro de gravar formas de onda braquial usando o programa de software. </li><li> Repita o procedimento para as artérias radiais, femorais e carótidas. </li><li> Meça a distância de cada um desses sites de entalhe supersternal usando uma fita métrica (braquial, radial e carótida) e governante custom / paquímetro (femoral). </li><li> Calcule carótida-braquial, carótida-radial e carotídeo-femoral (aPWV), utilizando o programa de software. </li><li> Lugarantebraço manguito de pressão sanguínea apenas distal ao olécrano e registro de pelo menos 10 ciclos cardíacos de imagens de ultrassom da artéria braquial de base e medições da velocidade do fluxo sanguíneo, com um software vascular definir o modo para disparar. Um braço mecânico pode ser utilizado para segurar a sonda de ultra-sons, se desejado. </li><li> Inflar antebraço manguito de pressão arterial a 250 mmHg e começar timer. Instrua participante a permanecer muito quieto. </li><li> Comece a velocidades de gravação com um conjunto de software vascular modo para acionar quando o cronômetro lê 4:45. Desencadear a liberação do manguito às 5:00 e mudar o ultra-som para gravar imagens em modo B (diâmetro) quando o relógio lê 05:10. </li><li> Continuar a gravar até que o relógio lê 07:00. </li><li> Grave pelo menos 10 ciclos cardíacos de imagens de ultrassom da artéria braquial de base com um software vascular definir o modo de desencadear. </li><li> Tire a pressão arterial do sujeito. Se a pressão arterial sistólica&gt; 100 mmHg, coloque 0,4 mg de nitroglicerina sublingual sob o assunto e# 39; s língua e começar timer, a menos que o paciente tem outra contraindicação. </li><li> Começar a gravar B-mode (imagens de diâmetro), quando o relógio lê 03:00 com o software vascular definir o modo de desencadear. </li><li> Parar a gravação quando o relógio lê 08:00. </li><li> Monitor de pressão arterial até que ele retorne à linha de base </li></ol> 4. Preparando Human Umbilical Vein células endoteliais (HUVEC) Controle de Slides <ol><li> Crescer HUVECs a passagem 5-6 e ~ 80% de confluência. </li><li> Tripsinizar com 3 ml de tripsina ou o que for necessário para o prato / balão. </li><li> Neutraliza-se a tripsina utilizando um volume igual de solução de tripsina de neutralização. </li><li> Centrifugar a 200 xg durante ~ 5 min e remover a tripsina e solução neutralizante por vácuo. </li><li> Ressuspender em ~ 10 ml de PBS para lavagem. </li><li> Centrifugar a 200 xg ~ 5 min. Remover PBS. </li><li> Remover PBS e corrigir em 1800 mL PBS + 200 mL de formaldeído. </li><li> Ressuspender em PBS (~ 10 ml). </li><li> Centrifugar a 200 xg ~5 min. Remover PBS, ressuspender em um volume adequado para adicionar ~ 200 mL por slide. </li><li> Armazenar slides em -80 ° C até que esteja pronto para análise (amostras estará bem por muitos anos). </li></ol> 5. Coloração das células endoteliais vasculares <ol><li> Tome lâminas de -80 ° C freezer e espere 5 minutos à temperatura ambiente (este procedimento é para um lote de 10 slides, incluindo um controle HUVEC slide). </li><li> Limpe o excesso de água com uma tarefa delicada limpar (não toque centro de slide). </li><li> Re-hidratar os slides adicionando alterado PBS a cada slide e deixá-los por 10 min. </li><li> Enquanto os slides estão de pé, preparar 5% de soro de burro e outras soluções. <ol><li> Prepare 5% de soro de burro pela adição de 300 ml de soro burro para 5.700 l de alteração PBS (a um pH de 7,4) para até 10 lâminas (aumentar essa quantidade para mais). </li><li> Dilui-se o anticorpo primário de interesse em 1000 ul de 5% de soro. Por exemplo, nitrotirosina e NADPHoxidase (1:300 e 1:1.500) poderiam ser utilizados como marcadores de estresse oxidativo. </li><li> Prepare AF568 secundário diluindo 5 ul de AF568 a 1.500 μll de 5% de soro. </li><li> Prepare caderina VE diluindo 2 ul de caderina VE de 1000 ul de 5% de soro. </li><li> Prepare AF488 diluindo 5 ul de caderina VE de 1000 ul de 5% de soro. </li><li> Mantenha AF568, VE caderina e AF488 em folha através de todo o processo e, em seguida, colocar no balancim em 4 ° C geladeira enquanto prepara slides. </li></ol></li><li> Após 10 min de reidratação, lâminas secas com uma tarefa delicada wipe. </li><li> Adicionam-se 5% de soro de burro, durante 60 minutos e colocar uma peça de película de plástico de parafina sobre a zona circular para assegurar a cobertura completa do produto químico. </li><li> Descarte o filme plástico e parafina lâminas secas com uma tarefa delicada wipe. Não lavar. Adicionar anticorpo primário durante 60 minutos e colocar uma peça de película de plástico de parafina sobre a zona circular para assegurara cobertura completa do produto químico. </li><li> Descarte o filme parafina plástico, lavar com PBS alterado a partir de garrafa de esguicho e mergulhar em colunas de slides para 5 min. Enquanto as lâminas são de imersão, movê-los em uma sala escura. Trabalhar no escuro para todas as etapas restantes. </li><li> Lâminas secas com Kimwipes, adicionar AF568 (anticorpo secundário), durante 45 minutos e colocar uma peça de película de plástico de parafina sobre a zona circular para assegurar a cobertura completa do produto químico. Cubra da luz. </li><li> Descarte o filme parafina plástico no recipiente de resíduos de risco biológico. Lavar com PBS alterado a partir de garrafa de esguicho, e em seguida, mergulhe em colunas por 5 min. </li><li> Lâminas secas com Kimwipes, em seguida, adicioná-caderina VE durante 60 minutos e colocar uma peça de película de plástico de parafina sobre a zona circular para assegurar a cobertura completa do produto químico. Cubra da luz. </li><li> Descarte o filme parafina plástico no recipiente de resíduos de risco biológico. Lavar com PBS alterado a partir de garrafa de esguicho, e em seguida, mergulhe em colunas por 5 min. </li><li> Lâminas secos comuma tarefa delicada limpar, adicionar AF488 durante 30 minutos e colocar uma peça de película de plástico de parafina sobre a zona circular para assegurar a cobertura completa do produto químico. Cubra da luz. </li><li> Descarte o filme parafina plástico no recipiente de resíduos de risco biológico. Lavar com PBS alterado a partir de garrafa de esguicho, e em seguida, mergulhe em colunas por 5 min. </li><li> Lâminas secos com uma tarefa delicada limpar e deixar as lâminas para secar por 20 min. Cubra da luz. </li><li> Adicione uma gota só de fluoroshield meio de montagem com 4 &#39;, cloridrato de 6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) para cada slide e cubra cada um com uma lamela. </li><li> Colocar as lâminas em 4 ° C geladeira coberto com papel alumínio. Imagem deve ser concluído no prazo de 48 horas. </li></ol> 6. Imaging and Analysis of Vascular células endoteliais <ol><li> Prepare microscópio para a imagem células endoteliais coradas de acordo com especificações do microscópio específico. Um único técnico cego deve analisar qualquer proteína particular para um morcegoch de células. </li><li> Digitalizar slides de forma sistemática. Identificar as células endoteliais por coloração positiva para o VE caderina e confirmar a integridade nuclear por coloração positiva para DAPI. </li><li> Imagem 30 células por lâmina para análise posterior. Repita o procedimento para cada slide no lote manchado, incluindo a HUVEC. </li><li> Analisar a intensidade da coloração do anticorpo primário de interesse usando um software de qualidade. </li><li> Para minimizar o possível efeito de confusão de diferenças de intensidade de coloração entre diferentes sessões de coloração, os valores do relatório como razão da expressão da proteína nas células endoteliais recolhidos para o mesmo a expressão da proteína em HUVEC. </li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Obtenção de resultados precisos para a febre aftosa BA e aPWV requer a aquisição de imagens de ultra-som de alta qualidade e formas de onda de pressão, respectivamente. Central para isso é formação adequada e contínua ea utilização de cada técnica pelo operador 44. Além disso, é fundamental para controlar o maior número de variáveis ​​externas que possam influenciar os resultados como possível padronizar a sessão de testes (por exemplo, antes de 12 horas rápido, clim...

A doença renal crônica (DRC) é um importante problema de saúde pública que atinge proporções epidêmicas, afetando ~ 11,5% da população nos Estados Unidos sozinho 1. O risco de morte cardiovascular ou um evento cardiovascular em pacientes com doença renal crônica é significativamente maior em comparação com a população em geral 2-4. Embora os pacientes com DRC apresentam uma alta prevalência de fatores de risco cardiovascular tradicionais, isso só explica parte do seu aumento da incidência de doenças cardiovasculares (DCV) 5. A disfunção vascular é um importante fator de risco cardiovascular não tradicional ganhando crescente reconhecimento no campo da nefrologia 6-9. Enquanto muitas mudanças provavelmente contribuem para o desenvolvimento de disfunção arterial, entre aqueles de maior preocupação é o desenvolvimento de disfunção endotelial vascular, mais comumente avaliado como auditivos dilatação dependente do endotélio (EDD), e endurecimento da large artérias elásticas 10. Existem várias técnicas para avaliar EDD e rigidez artéria elástica grande, mas o mais comumente utilizados são a dilatação da artéria braquial mediada pelo fluxo FMD BA e velocidade da onda de pulso da aorta (aPWV), respectivamente. Outra técnica comumente usada para avaliar EDD está medindo antebraço resposta do fluxo sanguíneo para agentes farmacológicos tais como a acetilcolina, utilizando oclusão venosa pletismografia 11,12. No entanto, esta metodologia requer cateterização da artéria braquial, que é mais invasivo do que a febre aftosa BA e pode ser contra-indicado em pacientes com DRC. Uma técnica alternativa para avaliar a rigidez arterial é medir a complacência arterial local (o inverso da rigidez) da artéria carótida, embora isso não seja tão amplamente utilizado ou validado com desfechos clínicos como aPWV 13. Os pacientes com DRC demonstrar tanto prejudicada FMD BA 14-16 e aumento da velocidade da onda de pulso da aorta-aPWV 13,17,18, mesmo antes de precisar de diálise. É importante do ponto de vista clínico, essas duas medidas não invasivas de disfunção vascular são preditores independentes de eventos cardiovasculares e mortalidade, tanto em pacientes com DRC 19-21, bem como em outras populações 22-26. Estas técnicas podem ser aplicadas ao estudo de várias populações de risco de DCV, incluindo pacientes com DRC. Os mecanismos exatos pelos quais a disfunção arterial desenvolve na DRC são completamente compreendida; No entanto, o óxido nítrico reduzida (NO) a biodisponibilidade é um contribuinte crítico 27-30 e um mecanismo comum de ambos auditivos EDD e aumento da rigidez arterial 10,31. Em DRC, estresse oxidativo é aumentada e contribui para a redução da biodisponibilidade 32-34. O estresse oxidativo é definido como biodisponibilidade excessiva de espécies reativas de oxigênio (ROS) em relação às defesas antioxidantes. Estímulos fisiológicos, including sinalização inflamatória, promover sistemas de enzimas oxidantes para produzir ROS, incluindo ânion superóxido (O 2 ● -) (por exemplo, a enzima oxidante NADPH oxidase.) 35. A produção de superóxido leva a um reduz a biodisponibilidade de óxido nítrico (NO). Prejudicada biodisponibilidade por sua vez pode contribuir para o desenvolvimento da DRC, como a disfunção endotelial é um preditor independente de CKD incidente 36. Isto é consistente com os dados de animal, indicando que a inibição da eNOS induz hipertensão (sistêmica e glomerular), isquemia glomerular, glomeruloesclerose, e túbulo-intersticial lesão 37. De fato, redução da biodisponibilidade parece ser necessário para o desenvolvimento e progressão da doença renal experimental que imita a doença humana, sugerindo um papel fundamental para a disfunção endotelial em CKD humano 38,39. Os marcadores de estresse oxidativo vascular pode ser avaliada em vascular células endoteliais coletadas de sujeitos da pesquisa, usando uma técnica originalmente desenvolvida por Colombo et al. 40 e modificado Seals et al 41-43. Usando 2 estéreis J-fios, as células são recolhidas a partir da veia antecubital, recuperadas, fixadas e depois positivamente identificado como as células endoteliais e analisados ​​para a expressão de proteínas de interesse utilizando a imunofluorescência. Nós fornecemos aqui uma discussão sobre essa metodologia que pode ser utilizada para a) medida FMD BA; b) medir aPWV; c) medir a expressão de proteínas da célula endotelial vascular de marcadores de estresse oxidativo. O foco está em pacientes com DRC, não necessitando de diálise crônica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:736px;" width="736">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:109px;">Company</td>
			<td style="width:244px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">J-wire</td>
			<td style="width:109px;">St. Jude</td>
			<td style="width:244px;">404584</td>
			<td>2 per collection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Disposable shorts (MediShorts)</td>
			<td>Quick Medical&#160;</td>
			<td>4507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Non-invasive hemodynamic workstation (NIHem)</td>
			<td style="width:109px;">Cardiovascualr Engineering</td>
			<td style="width:244px;">N/A</td>
			<td>Includes custom ruler.&#160; An alternate system is the Sphygmocor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Ultrasound</td>
			<td style="width:109px;">G.E.</td>
			<td>Model: Vivid7 Dimension</td>
			<td>We use a G.E., but there are many companies and models</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Vascular software (Vascular Imager)&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Medical Imaging Applications</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">R-wave trigger box</td>
			<td style="width:109px;">Medical Imaging Applications</td>
			<td>N/A</td>
			<td>custom made</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Rapid Cuff Inflation System</td>
			<td style="width:109px;">Hokanson</td>
			<td style="width:244px;">Model: Hokanson E20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Forearm blood pressure cuff</td>
			<td style="width:109px;">Hokanson</td>
			<td style="width:244px;">N/A</td>
			<td>custom cuff with 6.5 x 34 cm bladder&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">HUVECs</td>
			<td style="width:109px;">Invitrogren&#160;</td>
			<td>C-015-5C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Donkey serum</td>
			<td style="width:109px;">Jackson&#160;</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Pap pen</td>
			<td style="width:109px;">Research Products International</td>
			<td>195505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">VE Cadherin</td>
			<td style="width:109px;">Abcam</td>
			<td style="width:244px;">ab33168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">AF568</td>
			<td style="width:109px;">Life Technologies</td>
			<td>A11011</td>
			<td>depends on specifications of microscpe&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">AF488</td>
			<td style="width:109px;">Life Technologies</td>
			<td>A11034</td>
			<td>depends on specifications of microscpe&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Nitrotyrosine antibody&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Abcam</td>
			<td>ab7048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">NADPH oxidase antibody</td>
			<td>Upstate</td>
			<td>07-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">DAPI&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Vector</td>
			<td style="width:244px;">H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Delicate task wipe (Kimwipe)&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Fisher Scientific</td>
			<td>06-666-A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plastic paraffin film (parafilm)&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Confocal microscope&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Olympus&#160;</td>
			<td>Model: FV1000 FCS/RICS</td>
			<td>many options exist&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of vascular function in patients with chronic kidney disease

Pacientes com doença renal crônica (DRC) tem aumentado significativamente o risco de doença cardiovascular (DCV) em comparação com a população em geral, e isso é apenas parcialmente explicada por fatores de risco para DCV tradicionais. A disfunção vascular é um importante fator de risco não-tradicional, caracterizada por disfunção endotelial vascular (mais comumente avaliadas como deficientes endotélio-dependente dilatação [EDD]) e enrijecimento das grandes artérias elásticas. Embora existam várias técnicas para avaliar EDD e rigidez artéria elástica grande, o são mais comumente usado dilatação fluxo-mediada da artéria braquial (FMD BA) e velocidade da onda de pulso da aorta (aPWV), respectivamente. Ambas as medidas não invasivas de disfunção vascular são preditores independentes de eventos cardiovasculares futuros em pacientes com e sem doença renal. Os pacientes com DRC demonstrar tanto prejudicada FMD BA, e aumentou aPWV. Embora os mecanismos exatos pelos quais a disfunção vascular desenLops na DRC são completamente compreendidos, aumento do estresse oxidativo e conseqüente redução de óxido nítrico (NO) biodisponibilidade são importantes contribuintes. Alterações celulares no stress oxidativo pode ser avaliada através da recolha de células endoteliais vasculares a partir da veia antecubital e medição da expressão de marcadores de proteína de stress oxidativo por imunofluorescência. Nós fornecemos aqui uma discussão destes métodos para medir a febre aftosa BA, aPWV e expressão da proteína de célula endotelial vascular.

FMD BA é quantificada como a variação de pico no diâmetro da artéria braquial seguinte hiperemia reactiva. Assim, o diâmetro em repouso é comparado com o diâmetro após o final de um período de 5 min manga de pressão arterial de oclusão (Figura 1). O painel A mostra uma imagem representativa de ultra-som da artéria braquial e Painel B mostra um gráfico da onda R mudança fechado em diâmetro de liberação do manguito de 2 min seguinte, obtida através de software disponível com...

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Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

O grau de disfunção vascular e contribuindo mecanismos fisiológicos podem ser avaliados em pacientes com doença renal crônica através da medição do fluxo-mediada dilatação da artéria braquial, a velocidade da onda de pulso da aorta, e expressão da proteína de célula endotelial vascular.

Avaliação da função vascular em pacientes com doença renal crônica

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

assessment-vascular-function-patients-with-chronic-kidney

Research

JoVE Journal

Medicine

16.1K visualizações.  University of Colorado, Denver.  O grau de disfunção vascular e contribuindo mecanismos fisiológicos podem ser avaliados em pacientes com doença renal crônica através da medição do fluxo-mediada dilatação da artéria braquial, a velocidade da onda de pulso da aorta, e expressão da proteína de célula endotelial vascular. 

Vídeo: Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Examining the Characteristics of Episodic Memory using Event-related Potentials in Patients with Alzheimer's Disease

Our laboratory uses event-related EEG potentials (ERPs) to understand and support behavioral investigations of episodic memory in patients with amnestic mild cognitive impairment (aMCI) and Alzheimer's disease (AD). Whereas behavioral data inform us about the patients' performance, ERPs allow us to record discrete changes in brain activity. Further, ERPs can give us insight into the onset, duration, and interaction of independent cognitive processes associated with memory retrieval. In patient populations, these types of studies are used to examine which aspects of memory are impaired and which remain relatively intact compared to a control population. The methodology for collecting ERP data from a vulnerable patient population while these participants perform a recognition memory task is reviewed. This protocol includes participant preparation, quality assurance, data acquisition, and data analysis. In addition to basic setup and acquisition, we will also demonstrate localization techniques to obtain greater spatial resolution and source localization using high-density (128 channel) electrode arrays.

Examining the Characteristics of Episodic Memory using Event-related Potentials in Patients with Alzheimer&#039;s Disease

The methodology for collecting high-density event-related potential data while patients with Alzheimer's disease perform a recognition memory task is reviewed. This protocol will include subject preparation, quality assurance, data acquisition, and data analysis.

Examinando as características de memória episódica com potenciais relacionados a eventos em Pacientes com Doença de Alzheimer

Our laboratory uses event-related EEG potentials (ERPs) to understand and support behavioral investigations of episodic memory in patients with amnestic ...

Medicina

Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being analyzed 1, 2. This classical banding technique, however, is not reliable in identifying complex chromosomal aberrations such as those associated with cancer. To overcome the limitations of the banding technique, Spectral Karyotyping (SKY) is introduced to provide much reliable information on chromosome abnormalities.
SKY is a multicolor fluorescence in-situ hybridization (FISH) technique to detect metaphase chromosomes with spectral microscope 3, 4. SKY has been proven to be a valuable tool for the cytogenetic analysis of a broad range of chromosome abnormalities associated with a large number of genetic diseases and malignancies 5, 6. SKY involves the use of multicolor fluorescently-labelled DNA probes prepared from the degenerate oligonucleotide primers by PCR. Thus, every chromosome has a unique spectral color after in-situ hybridization with probes, which are differentially labelled with a mixture of fluorescent dyes (Rhodamine, Texas Red, Cy5, FITC and Cy5.5). The probes used for SKY consist of up to 55 chromosome specific probes 7-10.
The procedure for SKY involves several steps (Figure 1). SKY requires the availability of cells with high mitotic index from normal or diseased tissue or blood. The chromosomes of a single cell from either a freshly isolated primary cell or a cell line are spread on a glass slide. This chromosome spread is labeled with a different combination of fluorescent dyes specific for each chromosome. For probe detection and image acquisition,the spectral imaging system consists of sagnac interferometer and a CCD camera. This allows measurement of the visible light spectrum emitted from the sample and to acquire a spectral image from individual chromosomes. HiSKY, the software used to analyze the results of the captured images, provides an easy identification of chromosome anomalies. The end result is a metaphase and a karyotype classification image, in which each pair of chromosomes has a distinct color (Figure 2). This allows easy identification of chromosome identities and translocations. For more details, please visit Applied Spectral Imaging website (<a href="http://www.spectral-imaging.com/" target="_blank">http://www.spectral-imaging.com/</a>).
SKY was recently used for an identification of chromosome segregation defects and chromosome abnormalities in humans and mice with Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease (ADPKD), a genetic disease characterized by dysfunction in primary cilia 11-13. Using this technique, we demonstrated the presence of abnormal chromosome segregation and chromosomal defects in ADPKD patients and mouse models 14. Further analyses using SKY not only allowed us to identify chromosomal number and identity, but also to accurately detect very complex chromosomal aberrations such as chromosome deletions and translocations (Figure 2).

Spectral Karyotyping (SKY) is an advanced cytogenetics technique to identify genomic and chromosomal aberrations. This technique takes advantage of chromosome painting probes, which allow classification of all chromosomes. SKY can also identify complex chromosome aberrations and segregation defects in mice and humans with various diseases, including polycystic kidney disease.

Cariotipagem espectral para o Estudo de Anomalias cromossômicas em humanos e camundongos com doença renal policística

Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being ...

Utilizing Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation to Improve Language Function in Stroke Patients with Chronic Non-fluent Aphasia

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been shown to significantly improve language function in patients with non-fluent aphasia1. In this experiment, we demonstrate the administration of low-frequency repetitive TMS (rTMS) to an optimal stimulation site in the right hemisphere in patients with chronic non-fluent aphasia. A battery of standardized language measures is administered in order to assess baseline performance. Patients are subsequently randomized to either receive real rTMS or initial sham stimulation. Patients in the real stimulation undergo a site-finding phase, comprised of a series of six rTMS sessions administered over five days; stimulation is delivered to a different site in the right frontal lobe during each of these sessions. Each site-finding session consists of 600 pulses of 1 Hz rTMS, preceded and followed by a picture-naming task. By comparing the degree of transient change in naming ability elicited by stimulation of candidate sites, we are able to locate the area of optimal response for each individual patient. We then administer rTMS to this site during the treatment phase. During treatment, patients undergo a total of ten days of stimulation over the span of two weeks; each session is comprised of 20 min of 1 Hz rTMS delivered at 90% resting motor threshold. Stimulation is paired with an fMRI-naming task on the first and last days of treatment. After the treatment phase is complete, the language battery obtained at baseline is repeated two and six months following stimulation in order to identify rTMS-induced changes in performance. The fMRI-naming task is also repeated two and six months following treatment. Patients who are randomized to the sham arm of the study undergo sham site-finding, sham treatment, fMRI-naming studies, and repeat language testing two months after completing sham treatment. Sham patients then cross over into the real stimulation arm, completing real site-finding, real treatment, fMRI, and two- and six-month post-stimulation language testing.

We explore the use of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) to improve language abilities in patients with chronic stroke and non-fluent aphasia. After identifying a site in the right frontal gyrus for each patient that responds optimally to stimulation, we target this site during ten days of rTMS treatment.

Utilizando estimulação magnética transcraniana repetitiva para melhorar a função da linguagem em pacientes com AVC crônico com afasia não-fluente

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been shown to significantly improve language function in patients with non-fluent aphasia1. In this ...

5/6th Nephrectomy in Combination with High Salt Diet and Nitric Oxide Synthase Inhibition to Induce Chronic Kidney Disease in the Lewis Rat

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements of homeostasis, integrative animal models are necessary to study development and progression of CKD. To study development of CKD and novel therapeutic interventions in CKD, we use the 5/6th nephrectomy ablation model, a well known experimental model of progressive renal disease, resembling several aspects of human CKD. The gross reduction in renal mass causes progressive glomerular and tubulo-interstitial injury, loss of remnant nephrons and development of systemic and glomerular hypertension. It is also associated with progressive intrarenal capillary loss, inflammation and glomerulosclerosis. Risk factors for CKD invariably impact on endothelial function. To mimic this, we combine removal of 5/6th of renal mass with nitric oxide (NO) depletion and a high salt diet. After arrival and acclimatization, animals receive a NO synthase inhibitor (NG-nitro-L-Arginine) (L-NNA) supplemented to drinking water (20 mg/L) for a period of 4 weeks, followed by right sided uninephrectomy. One week later, a subtotal nephrectomy (SNX) is performed on the left side. After SNX, animals are allowed to recover for two days followed by LNNA in drinking water (20 mg/L) for a further period of 4 weeks. A high salt diet (6%), supplemented in ground chow (see time line Figure 1), is continued throughout the experiment. Progression of renal failure is followed over time by measuring plasma urea, systolic blood pressure and proteinuria. By six weeks after SNX, renal failure has developed. Renal function is measured using 'gold standard' inulin and para-amino hippuric acid (PAH) clearance technology. This model of CKD is characterized by a reduction in glomerular filtration rate (GFR) and effective renal plasma flow (ERPF), hypertension (systolic blood pressure&gt;150 mmHg), proteinuria (&gt; 50 mg/24 hr) and mild uremia (&gt;10 mM). Histological features include tubulo-interstitial damage reflected by inflammation, tubular atrophy and fibrosis and focal glomerulosclerosis leading to massive reduction of healthy glomeruli within the remnant population (&lt;10%). Follow-up until 12 weeks after SNX shows further progression of CKD.

A two-stage method to establish chronic kidney disease (CKD) in the Lewis rat by surgically removing 5/6th of renal mass is described. Combination of the surgical procedure, NOS-inhibition and a high-salt diet leads to a model resembling human CKD, allowing study of causal mechanisms and development of novel therapeutic interventions.

5/6th Nephrectomy em combinação com uma dieta alta de sal e Óxido Nítrico Sintase inibição para induzir o Doença Renal Crônica no Rato Lewis

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements ...

Computerized Dynamic Posturography for Postural Control Assessment in Patients with Intermittent Claudication

Computerized dynamic posturography with the EquiTest is an objective technique for measuring postural strategies under challenging static and dynamic conditions. As part of a diagnostic assessment, the early detection of postural deficits is important so that appropriate and targeted interventions can be prescribed. The Sensory Organization Test (SOT) on the EquiTest determines an individual&#39;s use of the sensory systems (somatosensory, visual, and vestibular) that are responsible for postural control. Somatosensory and visual input are altered by the calibrated sway-referenced support surface and visual surround, which move in the anterior-posterior direction in response to the individual&#39;s postural sway. This creates a conflicting sensory experience. The Motor Control Test (MCT) challenges postural control by creating unexpected postural disturbances in the form of backwards and forwards translations. The translations are graded in magnitude and the time to recover from the perturbation is computed.
Intermittent claudication, the most common symptom of peripheral arterial disease, is characterized by a cramping pain in the lower limbs and caused by muscle ischemia secondary to reduced blood flow to working muscles during physical exertion. Claudicants often display poor balance, making them susceptible to falls and activity avoidance. The Ankle Brachial Pressure Index (ABPI) is a noninvasive method for indicating the presence of peripheral arterial disease and intermittent claudication, a common symptom in the lower extremities. ABPI is measured as the highest systolic pressure from either the dorsalis pedis or posterior tibial artery divided by the highest brachial artery systolic pressure from either arm. This paper will focus on the use of computerized dynamic posturography in the assessment of balance in claudicants.

Individuals with intermittent claudication exhibit poor balance compared to healthy controls. Computerized dynamic posturography is an objective method for measuring an individual's postural responses to balance disturbances. This provides an objective reflection of the person&#x2019;s ability to respond to situations under which sensory stimuli are altered and unexpected perturbations occur.

Posturografia Dinâmica Computadorizada para Avaliação do controle postural em pacientes com claudicação intermitente

Computerized dynamic posturography with the EquiTest is an objective technique for measuring postural strategies under challenging static and dynamic ...

Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension and Assessment of Right Ventricular Function in the Piglet

An original piglet model of Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) associated with chronic Right Ventricular (RV) dysfunction is described. Pulmonary Hypertension (PH) was induced in 3-week-old piglets by a progressive obstruction of the pulmonary vascular bed. A ligation of the left Pulmonary Artery (PA) was performed first through a mini-thoracotomy. Second, weekly embolizations of the right lower pulmonary lobe were done under fluoroscopic guidance with n-butyl-2-cyanoacrylate during 5 weeks. Mean Pulmonary Arterial Pressure (mPAP) measured by ritght heart catheterism, increased progressively, as well as Right Atrial pressure and Pulmonary Vascular Resistances (PVR) after 5 weeks compared to sham animals. Right Ventricular (RV) structural and functional remodeling were assessed by transthoracic echocardiography (RV diameters, RV wall thickness, RV systolic function). RV elastance and RV-pulmonary coupling were assessed by Pressure-Volume Loops (PVL) analysis with conductance method. Histologic study of the lung and the right ventricle were also performed. Molecular analyses on RV fresh tissues could be performed through repeated transcutaneous endomyocardial biopsies. Pulmonary microvascular disease in obstructed and unobstructed territories was studied from lung biopsies using molecular analyses and pathology. Furthermore, the reliability and the reproducibility was associated with a range of PH severity in animals. Most aspects of the human CTEPH disease were reproduced in this model, which allows new perspectives for the understanding of the underlying mechanisms (mitochondria, inflammation) and new therapeutic approaches (targeted, cellular or gene therapies) of the overloaded right ventricle but also pulmonary microvascular disease.

Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) and Right Ventricular (RV) dysfunction were induced in piglets by progressive obstruction of the pulmonary arteries. Consequences were remarkably similar to those observed in CTEPH patients. This animal model would be a very useful tool for pathophysiology and therapeutic experiments on CTEPH and RV failure.

Tromboembólica crônica Hipertensão Pulmonar e Avaliação da Função Ventricular Direita no Piglet

An original piglet model of Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) associated with chronic Right Ventricular (RV) dysfunction is described. ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function in diabetic nephropathy and podocyte-specific VEGF-A knock-out mice; therefore, this protocol describes the full kidney work-up used in our lab to assess these mouse models of glomerular disease, enabling a vast amount of information regarding kidney and glomerular function to be obtained from a single mouse. In comparison to alternative methods presented in the literature to assess glomerular function, the use of the method outlined in this paper enables the glomerular phenotype to be fully evaluated from multiple aspects. By using this method, the researcher can determine the kidney phenotype of the model and assess the mechanism as to why the phenotype develops. This vital information on the mechanism of disease is required when examining potential therapeutic avenues in these models. The methods allow for detailed functional assessment of the glomerular filtration barrier through measurement of the urinary albumin creatinine ratio and individual glomerular water permeability, as well as both structural and ultra-structural examination using the Periodic Acid Schiff stain and electron microscopy. Furthermore, analysis of the genes dysregulated at the mRNA and protein level enables mechanistic analysis of glomerular function. This protocol outlines the generic but adaptable methods that can be applied to all mouse models of glomerular disease.

This protocol describes a full kidney work-up that should be carried out in mouse models of glomerular disease. The methods allow for detailed functional, structural, and mechanistic analysis of glomerular function, which can be applied to all mouse models of glomerular disease.

Avaliação da função renal em modelos do rato da doença Glomerular

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Interventional Diagnostic Procedure: A Practical Guide for the Assessment of Coronary Vascular Function

Approximately 40% of patients undergoing invasive coronary angiography for investigation of angina are found to have no obstructive coronary artery disease (ANOCA). Abnormal coronary function underlies coronary vasomotion syndromes including coronary endothelial dysfunction, microvascular angina, vasospastic angina, post-PCI angina and myocardial infarction with no obstructive coronary arteries (MINOCA). Each of these endotypes are distinct subgroups, characterized by specific disease mechanisms. Diagnostic criteria and linked therapy for these conditions are now established by expert consensus and clinical guidelines.
Coronary function tests are performed as an adjunctive interventional diagnostic procedure (IDP) in appropriately selected patients during coronary angiography. This aids differentiation of patients according to endotype. The IDP includes two distinct components: a diagnostic guidewire test and a pharmacological coronary reactivity test. The tests last approximately 5 minutes for the former and 10-15 minutes for the latter. Patient safety and staff education are key.
The diagnostic guidewire test measures parameters of coronary flow limitation (fractional flow reserve [FFR], coronary flow reserve [CFR], microvascular resistance [index of microvascular resistance (IMR)], basal resistance index, and vasodilator function [CFR, resistive reserve ratio (RRR)]).
The pharmacological coronary reactivity test measures the vasodilator potential and propensity to vasospasm of both the main coronary arteries and the micro-vessels. It involves intra-coronary infusion of acetylcholine and glyceryl trinitrate (GTN). Acetylcholine is not licensed for parenteral use and is therefore prescribed on a named-patient basis. Vasodilatation is the normal, expected response to infusion of physiological concentrations of acetylcholine. Vascular spasm represents an abnormal response, which supports the diagnosis of vasospastic angina.
The purpose of this practical guide is to provide information on the preparation and administration of the IDP in clinical practice. It discusses some key preparation and safety considerations, as well as tips for procedural success. The IDP supports stratified medicine for a personalized approach to health and wellbeing.

The purpose of this practical guide is to provide information on the preparation and administration of an interventional diagnostic procedure in clinical practice. It discusses some key preparation and safety considerations, as well as tips for procedural success.

Procedimento Diagnóstico Intervencionista: Um Guia Prático para a Avaliação da Função Vascular Coronária

Approximately 40% of patients undergoing invasive coronary angiography for investigation of angina are found to have no obstructive coronary artery ...

Muscle Function Obtained with Motion Mode Ultrasound and Surface Electromyography during Core Endurance Exercise

Motion mode (M-mode) ultrasound allows researchers and clinicians to measure the change of muscle thickness across time. Muscle thickness can be measured between fascial borders at a given time point during an exercise. This selected time point produces a one-dimensional image resulting in real-time, live observation of anatomy. Ultrasound used during functional movement can be referred to as dynamic ultrasound; this is feasible and reliable with the use of a linear transducer, elastic belt, and foam block to secure consistent transducer placement. The lateral abdominal wall is commonly investigated using ultrasound due to the overlapping nature of the muscles. Surface electromyography (sEMG) can complement M-mode ultrasound imaging because it measures the electrical representation of muscle activation. There is minimal evidence using M-mode ultrasound and sEMG simultaneously during core exercise. Exercises that challenge the core musculature involve both isometric holds (e.g., side plank), as well as oscillatory extremity movements (e.g., dead bug). In this study, both instruments will be used simultaneously to measure core muscle function during exercise. Ultrasound measurements will be obtained using a linear transducer and ultrasound unit, and sEMG measurements will be acquired from a wireless sEMG system. To make comparisons between participants and exercises, normalization methods using static, exercise starting positions for both instruments will be used. An activation ratio will be used for ultrasound and calculated by dividing the contracted thickness (thickness during a time point of exercise) by the rested (starting position) thickness. Muscle thickness will be measured in centimeters from the superior inferior fascial border to inferior superior fascial border. These methods aim to offer an innovative and practical measurement of muscle function with M-mode ultrasound and sEMG during core endurance exercises.

This protocol uses motion mode ultrasound and surface electromyography simultaneously to measure muscle function of the core. Muscle thickness and activation of the local stabilizers (e.g., transverse abdominis, internal oblique) and global movers (e.g., external oblique) is achievable during specific time points of the side plank and dead bug exercises.

Função Muscular Obtida com Ultrassonografia em Modo de Movimento e Eletromiografia de Superfície durante o Exercício de Resistência do Núcleo

Motion mode (M-mode) ultrasound allows researchers and clinicians to measure the change of muscle thickness across time. Muscle thickness can be measured ...

Acupoint Application Combined with Acupoint Massage for Treating Constipation in a Patient with Chronic Obstructive Pulmonary Disease

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is a common and frequent disease in elderly patients, with a tendency for progressive exacerbation. Constipation that reduces the quality of life and triggers the risk of diseases is a common concomitant symptom in patients with COPD. Currently, western medical treatment does not achieve the desired results for patients. A high recurrence rate accompanies it, whereas traditional Chinese medicine (TCM) has a long history and rich experience in treating chronic diseases. Both acupoint application and acupoint massage are characteristic therapies of TCM, with minor side effects, high safety, simple operation, and outstanding advantages. They are effective in treating constipation for patients with COPD and are considered an ideal alternative therapy for patients with chronic constipation. The purpose of this article is to introduce the method of acupoint application combined with acupoint massage for the treatment of constipation in patients with COPD, including the selection of points, items, treatment time, and operation procedure.

Here we demonstrate acupoint application combined with acupoint massage for treating constipation in a patient with chronic obstructive pulmonary disease (COPD).