Os autores agradecem o Research Foundation Flanders (FWO-Vlaanderen, Bélgica, G.0601.11) eo KU Leuven Research Foundation GOA/11/002. IB, TJ e LT beneficiar de uma bolsa da FWO-Vlaanderen.

Nota: Todas as acções em que são envolvidas as células devem ser realizadas num ambiente estéril de trabalho em um fluxo laminar. 1. Manutenção da Linha HEK293T celular <ol><li> Crescer as células HEK293T em um frasco T-75, a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2 umidificada. </li><li> Passagem das células quando uma confluência de 80% seja atingido. Nota: Isto normalmente leva de 3 a 4 dias. As células em cultura contínua permitir 20-25 passagens utilizáveis ​​para a seleção. <ol><li> Coloque salina tamponada com fosfato da Dulbecco (PBS) sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio, PBS-tripsina-etilenodiaminotetracético ácido acético (EDTA) (500 ml de PBS suplementado com 10 ml de solução de tripsina-EDTA e 4,5 ml de 4% de EDTA) e meio de crescimento (500 ml meio de Eagle modificado por Dulbecco - alta concentração de glicose [DMEM], suplementado com 10% de soro fetal de bovino [FBS] e 1 mM de penicilina-estreptomicina [PS]) à temperatura ambiente, meia hora antes. </li><li> Removero meio de crescimento a partir das células de idade. Lavar as células mortas com 3 ml de PBS e retire a PBS novamente. </li><li> Adicionar 3 ml de PBS com tripsina-EDTA, incubar durante 1 minuto à temperatura ambiente e remover a solução Nota: A morfologia das células irá mudar de a em forma de esfera em forma de estrela. </li><li> Soltar as células do fundo do balão, agitando ligeiramente e recolher as células por lavagem dos vários tempos de fundo com 10 ml de meio de crescimento fresco. </li><li> Transferir 1 ml da cultura celular para um novo frasco T-75 contendo 14 mL de meio de crescimento fresco, e incubar a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2 umidificada. </li></ol></li></ol> 2. Transfecção transiente de células HEK293T <ol><li> Crescer as células HEK293T em um frasco T-75 3 dias antes do ensaio real mobilização de cálcio ocorre. Certifique-se usar três T-75 frascos, um para a transfecção com a construção receptor, um para transfecção com um vetor vazio expressão, como controle negativo, e one para o controlo de transfecção. Nota: O passaging das células é realizada tal como descrito na etapa 1.2. Quando várias placas de 96 poços têm de ser rastreados, T-150 frascos pode ser usado para obter um maior rendimento de células (para fazer isso, duplos todas as quantidades listados nas etapas 1.2.5, 2.3, 3.1.3 e 3.1.4) . </li><li> Incubar os frascos a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 incubadora humidificada, durante 20-24 horas até que as culturas de células aproximar 50-70% de confluência. </li><li> Co-transfectar uma população de células com o vector de expressão que codifica o GPCR de interesse e o constructo Gu 16, o segundo frasco com o vector vazio e o constructo Gu 16, e a terceira com o controlo da transfecção e o Gu 16 construto. Nota: Neste protocolo, o receptor Drosophila SNPF foi clonado num vector de expressão mamífero pcDNA3.1 13. JetPRIME foi utilizado para realizar a transfecção, mas outros reagentes de transfecção podem ser usados ​​também. <ol><li> Adicione pelootal de 7,8 mg de DNA (3,9 mg construção receptor ou vazio vetor, e 3,9 mg Gu 16 construção de expressão) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e adicionar 500 mL de buffer JetPRIME. Misture bem em vortex o tubo, e girar para baixo em breve. </li><li> Adicionar 37.5 ul de reagente JetPRIME, vortex e girar durante 1 min a 14.000 x g. Incubar a mistura de transfecção de 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar gota a gota mix transfecção para o meio de cultura celular e certifique-se pipetar diretamente no meio de evitar o contato com as paredes da garrafa de cultura. Incubar os frascos a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 incubadora humidificada, durante 20-24 horas. </li></ol></li></ol> 3. Ensaio de Mobilização de Cálcio <ol><li> Recolher as células transfectadas e semear-los em placas, de fundo claro, preto de parede de 96 poços. <ol><li> Coloque o PBS, PBS-tripsina-EDTA e o meio de transferência de DMEM (500 ml de DMEM suplementado com 10% de FBS dialisadoe 1% PS) à temperatura ambiente, meia hora antes. </li><li> Cubra a 96 poços negros de parede, placas claras de fundo com 60 mL de PBS com fibronectina (0,0025%) por poço (5,85 ml de PBS e 150 mL de fibronectina [0,1%] por placa). Incubar as placas à temperatura ambiente durante 1 hora com a tampa colocada. Remover a solução a partir dos poços e incuba-se as placas mais uma vez durante 1 hora, sem a tampa, à temperatura ambiente. Em alternativa, é possível utilizar placas pré-revestidas durante a fixação das células reforçada. </li><li> Tire o meio de crescimento de idade das células e lavar as células mortas fora com 3 ml de PBS e remover o PBS. </li><li> Adicionar 3 ml PBS-tripsina-EDTA, incubar por 1 min, em seguida, retire a solução. Nota: A morfologia das células a partir de alterações em forma de estrela, em forma de esfera para. </li><li> Soltar as células do fundo do balão, agitando ligeiramente e recolhê-las, por lavagem várias vezes com 10 ml de meio de transferência de DMEM. Transferência das células para um tubo Falcon de 50 ml. </li><li> Contar onúmero de células por ml (feita com um NucleoCounter aqui, mas de uma câmara de Burker é aceitável). Adicionar 100 ul da cultura de células em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 100 mL de tampão de lise e misture tocando no tubo. Adicionar 100 ul de tampão de estabilização e misture tocando. </li><li> Encher um NucleoCassette com a suspensão de células e contagem das células com o contador. Multiplicar o número de células por três, como as células foram diluídas por um factor de três, ao adicionar a lise e estabilização em tampão passo 3.1.6. </li><li> Dilui-se as células a uma concentração final de 600.000 células / ml e 150 ul de semear as células por poço em placas revestidas para obter uma densidade de células de cerca de 90.000 células por / poço. Evitar as bolhas de ar e bata a placa para espalhar as células uniformemente de forma a obter uma camada de células contíguas. Incubar as placas a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 incubador humidificado durante 16-24 horas. </li></ol></li><li> Carregar as células com o corante fluorescente e preparar o coplaca mpound. <ol><li> Preparar a solução salina balanceada de Hank (HBSS) / HEPES / Ca 2 + / albumina sérica bovina (BSA) buffer: adicionar 165 mL de solução stock de CaCl2 (1 M de CaCl2 em água destilada [dH 2 O] - armazenar à temperatura ambiente), solução estoque 500 HEPES ul (1 M HEPES em dH 2 O, pH 7,4 - armazenar à temperatura ambiente), e 0,05 g de BSA a 50 ml HBSS. Note-se que o ácido gordo livre de BSA é utilizado para os ensaios de cálcio, como os ácidos gordos podem activar receptores específicos, prejudicando o sinal de cálcio do receptor de interesse. </li><li> Preparar a solução probenecida (100x, 250 mm): dissolver 0,71 g de probenecide em NaOH 5 ml (1 m) e adicionar 50 ul HEPES solução estoque e 5 ml da / HEPES / Ca 2 + tampão HBSS / BSA - sempre preparar nova solução. Nota: O probenecid inibe transportadores de aniões inorgânicos que podem desalojar Fluo-4 a partir do citoplasma, reduzindo, assim, o sinal fluorescente. Recomenda-se a realização da carga de corante nasa presença e ausência de probenecid para determinar se transportadores de aniões inorgânicos apresentam um problema potencial nas linhas celulares particulares sob investigação, como probenecida pode mesmo diminuir o sinal mediada por agonista. </li><li> Preparar o tampão de lavagem: adicionar 500 uL de solução probenecida para 50 ml de HBSS / HEPES / Ca 2 + / tampão de BSA, ajustar o pH para 7,4 e filtra a solução tampão. Sempre preparar tampão fresco, e 50 ml de solução tampão por placa é necessária. </li><li> Prepare uma solução de ácido plurónico a 10%: misturar 50 mL de ácido plurónico (20% w / v em dimetil-sulfóxido [DMSO]) com 50 ul de DMSO - se ocorrer a cristalização, de calor a 37 ° C e sempre preparar uma solução fresca. </li><li> Preparar uma solução de Fluo-4 AM (1 mM): adicionar 44 ul solução de 10% de ácido plurónico a um frasco que contém 50 ug de Fluo-4 AM e vortex até que esteja completamente dissolvido. Evitar a exposição à luz para evitar o branqueamento do fluoróforo. </li><li> Prepare tampão de carregamento: adicionar 8,8 ml DMEM supplemented com 10 mM de HEPES e 2,5 mM de probenecid (pH 7,4) à solução de Fluo-4 AM (44 ul) e vortex. Sempre use tampão fresco. </li><li> Descartar meio das células, lavar as células com 200 ul de PBS por poço, e remover o PBS. </li><li> Adicionar 55 ul de tampão de carga por poço e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. Envolva a placa em folha de alumínio para evitar a exposição da chapa para iluminar. </li><li> Seque os compostos antes da tela, se forem solúveis em solventes que são prejudiciais (por exemplo, acetonitrilo) para o sistema de expressão celular. </li><li> Solubiliza-se os peptídeos em tampão de lavagem em tubos siliconizados de 1,5 ml de microcentrífuga. Prepara-se uma série de diluições para realizar uma análise de concentração-resposta e determinação do valor de EC 50 de um ligando. Adicionar 70 ml da ligante no correspondente poço da placa de composto (placas de 96 poços em forma de V) e incluem controles positivos (agonista endógeno) e negativos (tampão de lavagem) em cada placa. Não<html> e: Se um composto não é solúvel na solução de lavagem, pode-se experimentar outros solventes que não sejam prejudiciais para as células sob investigação, tais como água ou soluções que emulsionar e solubilizar óleos e outras substâncias insolúveis em água (por exemplo, Kolliphor EL) . </li><li> Medir todas as amostras em triplicado. Tenha em atenção que 50 ul de um ligando a partir da placa de composto vai ser transferido para um poço com 100 ul de tampão de lavagem de placa de células durante o ensaio, de modo a preparar os compostos de 3x a concentração final desejada. </li><li> Descartar o tampão de carregamento da placa de células e adicionar tampão de lavagem de 100 ul a cada poço. Incubar a placa de 15 min à temperatura ambiente, e evitar a exposição à luz. </li><li> Descartar o tampão de lavagem de placa de células e adicionar 100 ul de tampão de lavagem de novo a cada poço. </li><li> Incubar a placa de células, a placa composta, e uma cremalheira de ponta (96 cavidades, as pontas das pipetas dispositivo estação) durante 15 min a 37 ° C. </li></ol></li></ol>título &quot;&gt; 4. Ensaio sobre o dispositivo Estação <ol><li> Criar e carregar o arquivo de protocolo desejado com o software e ativar a unidade de controle de temperatura para a câmara de leitura. Aqui, medir a resposta de cálcio a 37 ° C durante 2 min numa linha de cada vez com 1,52 segundos de intervalo entre as leituras sucessivas (uma medição completa da placa de 96 poços demora aproximadamente 25 min) a 525 nm. Definir a excitação de Fluo-4 a 488 nm e transferir um volume total de 50 ul de composto para a placa de células, 18 segundos após o início da leitura, com a velocidade de distribuição fixada em 26 ul / seg e uma altura pipeta de 135 uL. </li><li> Posicione o composto e placa de células, eo rack ponta nas gavetas apropriadas do dispositivo estação. </li><li> Realizar uma única leitura da placa de células, ao mesmo comprimento de onda de excitação e de emissão no modo terminal, antes de iniciar a tela real no modo FLEX. Nota: Esta medida dá unidade fluorescência relativa valores (RFU) e permite a detecção de variabilidade entre nóslls da placa. Valores entre 20.000 e 40.000 são consideradas aceitáveis. </li><li> Iniciar o ensaio e analisar os dados com o software. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

O ensaio de mobilização de cálcio à base de fluorescência foi aplicado com êxito para confirmar a caracterização funcional do sistema de sinalização peptidérgica Drosophila SNPF, que já foi realizada por Mertens et al. com um ensaio de bioluminescência e por Feng et al. com 13,15 ensaio eletrofisiológico. Os valores de EC 50 obtidos com o ensaio de fluorescência em células HEK293T são cerca de 10 vezes menos do que os obtidos com o ensaio de bioluminescência realizadas em células CHO (Drome-SNPF-1: fluo = 2,04 nM, lumi = 51 nM; Drome-SNPF- 2: fluo = 5,89 nM, lumi = 42 nM; Drome-SNPF-3: fluo = 5,55 nM, lumi = 31 nM; Drome-SNPF-4: fluo = 0,50 nM, lumi = 75 nM). Estas variações podem ser explicada por vários factores, incluindo o facto de um dos sistemas de expressão utilizados podem ser mais adequados para a expressão funcional de um determinado receptor, ou a dobragem de alguns receptores podem ser menos eficiente na ctipos celulares ertain. Os valores de EC50 de todos os quatro peptídeos Drome-SNPF estão na gama nanomolar, quando testado no seu receptor tanto com a fluorescência e a bioluminescência, geralmente suportar a relevância fisiológica da sua interacção-receptor do peptídeo in vivo. Note-se que qualquer controlo de transfecção com um receptor para o qual o ligando de activação é conhecido foi incluído no ecrã apresentado aqui, porque o sistema de sinalização de Drosophila SNPF é normalmente o controlo de transfecção em montagens experimentais. O controlo positivo com um ligando endógeno das células HEK293T (PAR 1) e o controlo negativo (tampão de lavagem) foram incluídos na tela. Os resultados do PAR 1 mostrou que as células estavam numa boa condição. O controlo negativo (tampão de lavagem) não provocou um sinal de fluorescência, o que indica que o meio em que os péptidos são dissolvidos era livre de quaisquer contaminantes que possam influence os resultados. O sistema de sinalização de Drosophila SNPF previamente caracterizados foi aqui utilizado para explicar o ensaio de mobilização de cálcio baseados em fluorescência. Para esta finalidade, a série de concentração de ligantes activantes foram testados imediatamente. No entanto, quando um receptor órfão é trazido para a sobre-expressão de um ensaio de rastreio para testar uma biblioteca contendo centenas de compostos, recomenda-se a primeira tela relativamente elevadas concentrações finais dos ligantes (por exemplo,., 10 ou 1 uM). Após a detecção de um composto de activação, uma série de diluições do composto que podem ser rastreados de modo a compor uma curva de concentração-resposta e determinação do valor de EC 50. Uma vez que o ligando de activação de um receptor é determinada, a via de sinalização intracelular pode ser investigada através da adaptação do protocolo. O ensaio pode ser realizado como descrito acima, mas sem a co-transfecção do L ^5, 16 subunidade. Quando uma resposta de cálcio é medida, isso significa que os pares de receptor com um endógeno Gu q subunidade do sistema de expressão celular. Quando nenhum sinal fluorescente é observada, os protocolos para medir mudanças nas concentrações de outros mensageiros secundários (por ex., Campo) pode ser aplicada. Da relação estrutura-actividade (SAR) estudos também pode ser levada a cabo para definir sequência do núcleo do péptido requerida para a activação do receptor. Em primeiro lugar, sequências truncadas são avaliados para definir a sequência mínima de aminoácidos do péptido que ainda é capaz de activar o receptor. Em seguida, os péptidos podem ser testados em que sistematicamente cada aminoácido foi substituído por um resíduo de alanina. Testando série alanina-substituição sintética sobre o receptor, que permite determinar a importância de cada um dos aminoácidos para a activação do receptor de 24,25. Apesar de seu uso freqüente e eficiência comprovadacácia, deve ser enfatizado que o ensaio descrito aqui pode precisar de algumas adaptações para obter os melhores resultados para os receptores específicos de interesse. A subunidade Gu 16 tem a vantagem de que ele se liga a maior parte dos GPCRs, mas também pode ter um efeito negativo dominante sobre os receptores que par via Gu q 22 endogenamente. Neste caso, pode ser útil para testar diversas combinações de proteínas G durante a optimização de um novo ensaio de cálcio e para comparar os resultados para os receptores acoplados à q Gu na ausência ou na presença de Gu 16. Ensaios alternativos que são independentes da proteína G interagindo para detectar a activação do receptor também pode ser realizada, tal como a translocação de arrestina marcada com GFP, ou a detecção de alterações no potencial de membrana (p. ex., Pelo FLIPR Membrana Assay Kit Potencial). Além do Fluo-04:00 usado aqui, uma grande variedade de outros fluoróforos sensível ao cálcio, cada um com seu próprio espectral e isquêmicapropriedades ai, está disponível. O fluoróforo mais adequado pode ser seleccionado com base na GPCR, tipo de célula e o leitor de placas disponível, mas a verificação experimental é necessário. As quantidades de ADN transfectado e o ADN / transfecção razão reagente necessidade de ser determinado para cada combinação de linha de células-reagente receptor de transfecção. Finalmente, deve-se ter em mente que as células em cultura contínua permitir apenas 20-25 passagens utilizáveis ​​para executar os ensaios de rastreio.

Receptores acoplados à proteína (GPCRs) constituem uma das maiores e mais diversas famílias entre todas as proteínas da superfície celular. A sua presença em vertebrados, invertebrados, plantas, leveduras e fungo, assim como em Protozoa e os primeiros diploblásticos Metazoa indica que GPCRs estão entre as mais antigas moléculas ligadas a transdução de sinal 1. Ativando seus ligantes naturais integram uma grande diversidade de estímulos externos, incluindo peptídeos, aminas biogênicas, odores, glicoproteínas, e fótons 2. Como tal, estes sistemas de sinalização de receptor-ligando estão envolvidas numa grande variedade de processos fisiológicos. O espectro funcional ampla torna idealmente adequada para o desenvolvimento de medicamentos terapêuticos, que cobrem uma vasta gama de doenças humanas. Sobre 50-60% das metas de drogas atuais são representados por GPCRs 3,4. Além de sua grande importância na indústria farmacêutica, GPCRs também estão no centro das atenções para o desenvolvimento de umnova geração de inseticidas específicos da espécie 5,6 e pesticidas em geral. Porque os ligantes naturais de muitos GPCRs ainda não são identificados, eles são classificados como GPCRs órfãos. O deorphanization desses receptores irá melhorar a compreensão de seus papéis fisiológicos em organismos e pode descobrir alvos putativos para novas aplicações de drogas 7. Desde a era genômica, a estratégia de farmacologia reversa é amplamente aplicado para o deorphanization de GPCRs 8. A abordagem implica que um receptor órfão é usado como um &quot;gancho&quot; de &#39;peixe fora »o seu ligando de activação a partir de um extracto biológico ou a partir de uma biblioteca de compostos sintéticos. O GPCR de interesse é, por conseguinte, clonado e subsequentemente transfectadas em um sistema de expressão celular. Nos métodos mais utilizados, a activação do receptor é determinada medindo as alterações na concentração de moléculas de segundo mensageiro 9 </sup&gt;. Os principais ensaios de rastreio do receptor de contar com proteínas bioluminescentes sensível ao cálcio (por exemplo, aquorina) 10 ou fluorescentes indicadores de cálcio (por exemplo, Fluo-4) 11. Os ensaios baseados em fluorescência, em que as células que expressam receptores são carregados com um indicador fluorescente de cálcio antes de rastreio de ligando, tem a vantagem de que eles permitem o rastreio de alto rendimento, devido à sua facilidade de uso, o tempo de leitura curto, e a flexibilidade de triagem vários receptores órfãos sobre uma única placa 12. Aqui, o ensaio de mobilização de cálcio baseados em fluorescência é completamente descrita e ilustrada pelo processo deorphanization da Drosophila melanogaster curto neuropeptídeo F receptor (SNPF). Este sistema de sinalização neuropeptidérgicas foi inicialmente caracterizado por Mertens et al. em 2002 13 com um ensaio de bioluminescência cálcio realizada em células de ovário de hamster chinês (CHO)14 e por Feng et al., Em 2003, com um ensaio eletrofisiológico utilizando oócitos Xenopus 15. A presença do sistema de sinalização SNPF parece estar limitada ao filo dos artrópodes, em que está implicado numa ampla variedade de processos, incluindo a regulação da alimentação, o crescimento, as reacções de stress, a locomoção, e ritmos circadianos 16. A pesquisa sobre sistemas de sinalização neuropeptidérgicas em insetos podem não só levar a novos alvos para o desenvolvimento de inseticidas, mas o conhecimento do seu funcionamento também podem ser extrapolados para outros organismos como muitos sistemas de sinalização foram geralmente bem conservados ao longo da evolução 17. Na última década, um grande progresso tem sido feito no processo deorphanization de GPCRs neuropeptídeo insetos. Apesar destes esforços, apenas um pequeno número de receptores foram acompanhados ao seu ligando cognato, e muita informação de seqüência paranovos GPCRs órfãos tornou-se disponível, devido à expansão da genômica 18. A disponibilidade de médio / alto throughput abordagens de triagem, como o teste de mobilização de cálcio à base de fluorescência que tem provado ser uma técnica amplamente aplicado 9,18, é, portanto, de valor inestimável. O ensaio de mobilização de cálcio à base de fluorescência, tal como descrito aqui é realizada na embrionária 293T de rim humano (HEK293T) A linha de células e utiliza uma sonda fluorescente para determinar as alterações na concentração intracelular de cálcio após a activação do receptor. Para garantir a elevada expressão e os níveis de tradução do receptor, uma sequência de consenso de Kozak 19 é adicionado à extremidade 5 &#39;da sequência de codificação do receptor, a qual é subsequentemente clonado num vector de expressão (por exemplo, séries vector pcDNA para linhas de células de mamíferos). Como é difícil prever o endógeno de proteína G-acoplamento de um GPCR órfãos com base em informação da sequênciasozinho, o segundo mensageiro moléculas (por exemplo, cálcio ou cAMP) que são modulados depois de activação do receptor muitas vezes permanecem desconhecidos antes da identificação do ligando. Para contornar este problema, as proteínas G promíscuos da família G q (por exemplo, murino Gu Gu humano 15 ou 16 [usado aqui]) ou as proteínas G quiméricos (por exemplo, Gu qi5) que interagem com a maior parte dos GPCRs e induzir a libertação de cálcio pode ser co-expressa 20,21,22. Após a ligação do ligando ao seu receptor, o GPCR sofre uma alteração conformacional que conduz à activação de vias intracelulares específicos. A molécula de guanosina difosfato (GDP), com destino em condições de repouso para o Gu 16 subunidade, será substituído por um trifosfato de guanosina (GTP) molécula. Isto provoca a dissociação da proteína G heterotrimérica num Gu 16 e Gβγ subunidade. O Gu 16 subunidade ativa a fosfolipase C &amp;º 946; (PLCβ), que por sua vez hidrolisa o difosfato de fosfatidilinositol ligada à membrana (PIP 2), resultando em diacilglicerol (DAG) e trifosfato de inositol (IP 3). IP 3 irá espalhar ao longo do citoplasma e activa os canais de cálcio de IP 3-dependentes presentes na membrana do retículo endoplasmático, o qual induz a libertação de cálcio para o interior do citoplasma. A libertação de cálcio após a activação do receptor ocorre dentro de segundos e pode ser detectado através do carregamento de células antes do ensaio de rastreio com um corante sensível ao cálcio, Fluo-4, como acetoximetilo (AM) 11. O grupo éster AM permite o fluoróforo para atravessar a membrana celular e é clivada por esterases citoplasmáticas, uma vez no interior da célula. Consequentemente, as cargas negativas do corante fluorescente é desmascarado, impedindo-o de difundir para fora da célula e que lhe permite interagir com os iões de cálcio. O sinal o fluorescentef Fluo-4 é insignificante em células sob condições de repouso apenas contêm as concentrações de cálcio na gama nanomolar. No entanto, quando o cálcio é libertado após a activação do receptor, o sinal pode aumentar a concentração de forma dependente a mais de 100 vezes, este meio garantindo uma grande relação de sinal-para-ruído. Fluo-4 também apresenta uma larga gama dinâmica para relatar [cálcio] em torno de um K d (cálcio) de 345 nM, tornando-o adequado para medir alterações de cálcio fisiologicamente relevantes em uma ampla variedade de células. A excitação de Fluo-4 ocorre a 488 nm e a emissão de fluorescência é medida a 525 nm 11. Fluorimeters como o leitor de placas de imagiologia por fluorescência (FLIPR) 23, o NOVOSTAR, ou o FlexStation (dispositivo de estação) 12 / são sistemas de alto rendimento médio que permitem adição simultânea composto e a detecção do sinal de Fluo-4, mediante a activação do receptor por cada poço em uma placa de ensaio. O ensaio de mobilização de cálcio descrito aqui baseia-se na estaçãodispositivo do sistema de microplacas de 96 poços. O software SoftMax Pro (software) é usado para operar o dispositivo de estação, assim como para análise dos dados. O programa imediatamente exibe os resultados na forma de gráficos de formato de 96 poços. Vários poços podem ser seleccionados simultaneamente para comparar os resultados destes poços no mesmo gráfico. A unidade fluorescente relativa (RFU) valores de poços em cada coluna são medidos simultaneamente para um período de dois minutos, a começar antes da adição de compostos aos poços e continuada depois da medição do sinal de fluorescência após a activação do receptor. Tipicamente, a tendência de uma curva agonista alinha com a linha de base até um composto de activação é adicionado às células, o que resulta num rápido aumento do sinal fluorescente. A altura do pico é correlacionada com a concentração de agonista final no poço. Após o pico, o sinal fluorescente cai lentamente até ao nível da linha de base. O medições RFU can ser convertidos em curvas de concentração-resposta para determinar o valor de EC50 (concentração eficaz semi-máxima) de um ligando. Em geral, pelo menos três crivos independentes, cada um incluindo três réplicas de uma série de concentração, deve ser realizada para compor uma curva de concentração-resposta fiável. Recomenda-se incluir vários controles positivos e negativos no projeto experimental. Primeiro de tudo, um controlo de transfecção, ou seja, a aplicação de um receptor com um ligando conhecido, deve ser testado. Isto permite verificar se o agente de transfecção foi operacional. A incorporação de uma experiência de controlo com um agonista para um receptor endógeno de a linha de células e um controlo negativo (por exemplo, tampão de lavagem) são também recomendado para monitorizar a saúde e viabilidade das células e para excluir a possibilidade de que o tampão de lavagem foi contaminada com um fator que pode desencadear uma auto-fluoreresposta perfume. Agonistas utilizados com frequência são de um péptido derivado a partir do-activated receptor-1 da protease (PAR 1), que actua como um agonista de PAR 1 selectivo, ou carbacol, que activa o receptor de acetilcolina. Células transfectadas com um vector de expressão vazio também devem ser testados para excluir que os compostos activos interagem com os receptores endógenos da célula. Optimização de vários parâmetros descritos no protocolo abaixo pode ser necessário para os diferentes sistemas de sinalização. A figura esquemática do ensaio de mobilização de cálcio completo à base de fluorescência é apresentada na Figura 1. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema geral do ensaio de mobilização de cálcio baseados em fluorescência. Automatizado de manuseamento de líquido e de fluorescência simultânea medições são realizadas com a estaçãoleitor de microplacas dispositivo, accionado pelo software. O dispositivo estação contém três gavetas: uma para a placa de celular, placa composto e rack ponta. Os compostos de transferências pipetador embutidas de uma coluna da placa de composto para a coluna correspondente da placa de células (passo 1). Cada poço da placa de células contém uma monocamada de células HEK293T que foram co-transfectadas com o GPCR de interesse e o promíscuo Gu 16 subunidade. Quando um composto activa o receptor, o PIB Gu 16 ligado é substituído por GTP. A subunidade Gu 16 dissocia-se, posteriormente, a partir do complexo Gβγ e activa a fosfolipase Cp (PLCβ), que por sua vez hidrolisa o fosfatidilinositol bifosfato (PIP 2), resultando em diacilglicerol (DAG) e trifosfato de inositol (IP 3). IP 3 ativa IP canais de cálcio de 3-dependente presente na membrana do retículo endoplasmático, induzindo a libertação de cálcio into citoplasma. A interacção do cálcio com Fluo-4 (com a qual as células são carregadas previamente para o composto de adição) resulta num sinal de fluorescência (passo 2). O software apresenta os resultados como a unidade fluorescente relativa (RFU) valores em função do tempo, e as alturas dos picos correlacionar com a concentração de ligando de um modo dependente da concentração. Estes dados podem então ser convertidos em uma curva de concentração-resposta para determinar o valor de EC 50 de um par receptor-ligando (passo 3).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="610">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Trypsin-EDTA solution (0.25%)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td style="width:109px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">195173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose&#160; (DMEM)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5796</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F7524</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Penicillin-Streptomycin (P-S)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:215px;">jetPRIME</td>
			<td style="width:109px;">Polyplus transfection</td>
			<td style="width:119px;">114-01</td>
			<td style="width:167px;">FuGENE HD Transfection Reagent (Promega); Lipofectamine LTX &#38; Plus Reagent (Life technologies)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F0392</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F0895</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Reagent A100, Lysis buffer</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;">910-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Reagent B, Stabilizing buffer</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;">910-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">CaCl2</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HEPES</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">HBSS buffer: Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Probenecid</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NaOH (1 M)</td>
			<td>Vel</td>
			<td>2781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Pluronic acid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P-3000MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Dimethyl-sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Fluo-4 AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td style="width:167px;">Fluo-3, Rhod-2, Fluo-5, Calcium Green-1,.. (Invitorgen)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">TPP tissue culture flasks (T-75 and T-150)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z707503 and Z707554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:215px;">FlexStation device</td>
			<td style="width:109px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">NOVOstar (BMG Labtechnologies); FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader) (Molecular Devices)</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:215px;">Black-walled polystyrene plates (96 wells) with clear bottom</td>
			<td style="width:109px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">655090</td>
			<td style="width:167px;">Corning 96 well flat clear bottom black polystyrene poly-D-lysine coated microplates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NucleoCassette</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;">941-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NucleoCounter NC-100</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microcentrifuge tubes, siliconized</td>
			<td style="width:109px;">BioCision</td>
			<td style="width:119px;">BCS-2470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Polystyrene V-shaped 96-well plates</td>
			<td style="width:109px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>651101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">96-Well, FlexStation Pipet Tips</td>
			<td style="width:109px;">Molecular Devices</td>
			<td>9000-0912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Soft Max Pro software</td>
			<td style="width:109px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of g protein-coupled receptors by a fluorescence-based calcium mobilization assay

Durante mais de 20 anos, a farmacologia inversa tem sido a estratégia mais proeminente para descobrir os ligandos activadores de órfãos receptores acoplados à proteína (GPCRs). O início de um ensaio de farmacologia inversa é a clonagem e subsequente transfecção de um GPCR de interesse num sistema de expressão celular. O receptor heterólogo expresso é então desafiados com uma biblioteca de compostos de ligandos candidatos para identificar o ligando (s) de activação do receptor. A activação do receptor pode ser avaliada por medição das alterações da concentração de moléculas de segundo mensageiro repórter, como o cálcio ou o cAMP. O ensaio mobilização de cálcio à base de fluorescência descrito aqui é um meio-de transferência freqüentemente utilizado teste de reversão farmacologia. O GPCR órfãos é expressa de forma transiente em rim embrionário humano 293T (células HEK293T) e um constructo promíscuo Gu 16 é co-transfectado. Após ligação do ligante, a ativação do Gu 16 subunidade induz a liberação de cálcio from do retículo endoplasmático. Antes do rastreio do ligando, as células que expressam receptores são carregados com um indicador de cálcio fluorescente Fluo-4 acetoximetilo. O sinal de fluorescência de Fluo-4 é insignificante em células sob condições de repouso, mas pode ser amplificado mais do que uma dobra de 100 sobre a interacção com iões de cálcio, que são libertados após activação do receptor. A técnica descrita não requer o estabelecimento demorada das linhas de células transfectadas de forma estável, em que o material genético transfectada é integrado no genoma da célula hospedeira. Em vez disso, uma transfecção transiente, gerando expressão temporária do gene alvo, é suficiente para realizar o ensaio de rastreio. A configuração permite-throughput screening meio de centenas de compostos. A co-transfecção da promíscuo Gu 16, a qual acopla a maior parte dos GPCRs, permite que a via de sinalização intracelular a ser reorientada para a libertação de cálcio, independentemente da via de sinalização nativa no pavimento endógenomentos. As células HEK293T são fáceis de manusear e provaram a sua eficácia ao longo dos anos em ensaios deorphanization receptores. No entanto, a otimização do ensaio para receptores específicos podem permanecer necessário.

Série de concentrações que variam de 50 uM para 0,001 nM foram testadas para todos os quatro peptídeos de Drosophila SNPF (Drome-SNPF-1: AQRSPSLRLRFamide, Drome-SNPF-2: SPSLRLRFamide, Drome-SNPF-3: PQRLRWamide, Drome-SNPF-4: PMRLRWamide) em células HEK293T transientemente que expressam o receptor de Drosophila SNPF eo promíscuo Gu 16 subunidade. O GPCR foi activado por todos os quatro péptidos em concentrações finais até 0,1 nM, e a activação do receptor foi dependente da concentração. Figura 2 mostra os gráficos correspondentes a uma das três réplicas da série de concentração Drome-SNPF-1. O controlo negativo (tampão de lavagem) não induziu um sinal de fluorescência, enquanto que o controlo positivo (PAR 1 - 1 uM) induziu forte activação do receptor-1, conduzindo a um sinal de alta fluorescente (± 30.000 RFU) activado por proteases endógenas. Deve notar-se que um desvio dea curva típica pode indicar anomalias. Por exemplo, um aumento contínuo da curva sem retornar à linha de base pode ser relacionada com sinais não mediados por receptores, tais como a presença de ionóforo de cálcio, ou uma bicamada lipídica interrompido causando escapes de cálcio. O software permite a entrada de fórmulas para determinar a porcentagem de ativação ou os erros padrão das diferentes concentrações entre outros. Os dados resultantes são utilizados para compor as curvas de concentração-resposta preliminares para estimar os valores de EC 50, como mostrado para os quatro peptídeos Drome-SNPF na Figura 3. As curvas da Figura 3 também incluem dados para o controlo negativo, onde a concentração de série os péptidos Drome-SNPF foram testados em células HEK293T transfectadas com um vector pcDNA3.1 vazio. Os resultados indicam que a adição de péptidos a estas células não têm nenhum efeito sobre os receptores endógenos, mas, de facto activcomeu o receptor de interesse. O ensaio de mobilização de cálcio à base de fluorescência foi então repetido três vezes de forma independente. Com base nas curvas de concentração-resposta preliminares do ecrã inicial, as concentrações testadas foram adaptadas para cobrir a gama dinâmica da curva (Figura 4). Os valores de EC50 de Drome-SNPF-1 (2,04 ± 1,48 nM [intervalo de confiança de 95%]), Drome-SNPF-2 (5,89 ± 3,74 nM), Drome-SNPF-3 (5,55 ± 3,95 nM) e Drome-SNPF- 4 (0,50 ± 1,01 nM) são semelhantes, o que indica que eles são igualmente potentes para activar o receptor. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig2.jpg" /> Figura 2. Gráfica saída do software para uma resposta mediada por receptores de fluorescência de uma série de concentração. Doze concentrações finais que variam de 50 (iM a 0,001 nM) of Drome-SNPF-1 péptido foram testados no receptor Drome-SNPF. A ativação é expressa em unidade fluorescente relativa valores (RFU). O gráfico superior mostra os resultados de seis concentrações mais elevadas e o gráfico inferior das seis concentrações mais baixas. O controlo positivo (+) é um PAR (1 uM) e o controlo negativo (-) é o tampão de lavagem. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig3.jpg" /> Figura 3. Curvas de concentração-resposta preliminares de péptidos Drosophila SNPF determinados por um único ensaio de mobilização de cálcio baseados em fluorescência. As curvas de concentração-resposta do receptor de Drosophila SNPF expresso transitoriamente em células HEK293T para os quatro peptídeos de Drosophila SNPF são mostrados em azul. Para os controlos negativos (a vermelho), os péptidos foram testados em HEK293TAs células transfectadas com um vector pcDNA3.1 vazio. As respostas fluorescentes são mostrados como relativa (%) para o valor mais elevado (100% de activação). As curvas são o resultado de uma experiência em que cada série de concentração foi avaliada em triplicado. As barras verticais representam os erros padrão da média (SEM), que por vezes são menores do que os símbolos utilizados (neste caso, apenas os símbolos estão representados). <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig4.jpg" /> Figura 4. Curvas de concentração-resposta e valores de EC 50 correspondentes de péptidos Drosophila SNPF determinados por três ensaios de mobilização de cálcio e de fluorescência baseada independentes. As curvas de resposta à concentração do receptor Drosopihla SNPF expressos transitoriamente em células HEK293T para os quatro peptídeos de Drosophila SNPF são o resultado de três me independenteasurements cada realizadas em triplicata (n ≥ 9). As respostas fluorescentes são mostrados como relativa (%) para o valor mais elevado (100% de activação). Os asteriscos indicam as concentrações para as quais barras de erro n ≤ 9. Indicam SEM, que por vezes são menores do que os símbolos utilizados (neste caso, apenas os símbolos estão representados). CE 50 valores são mostrados com seus intervalos de confiança de 95%.

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Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

O ensaio de mobilização de cálcio e de fluorescência baseada aqui descrito é um sistema de rastreio inverso farmacologia de médio rendimento para a identificação de ligandos funcionalmente activação (s) de órfãos receptores acoplados à proteína (GPCRs).

Caracterização dos receptores acoplados à proteína por uma mobilização de cálcio Ensaio baseado em fluorescência

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

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39.4K visualizações.  KU Leuven.  O ensaio de mobilização de cálcio e de fluorescência baseada aqui descrito é um sistema de rastreio inverso farmacologia de médio rendimento para a identificação de ligandos funcionalmente activação (s) de órfãos receptores acoplados à proteína (GPCRs). 

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In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial applications as well as increases basic fundamental biological knowledge. F&ouml;rster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) between a donor molecule in an electronically excited state and a nearby acceptor molecule has been frequently utilized for studies of protein-protein interactions in living cells. The proteins of interest are tagged with two different types of fluorescent probes and expressed in biological cells. The fluorescent probes are then excited, typically using laser light, and the spectral properties of the fluorescence emission emanating from the fluorescent probes is collected and analyzed. Information regarding the degree of the protein interactions is embedded in the spectral emission data. Typically, the cell must be scanned a number of times in order to accumulate enough spectral information to accurately quantify the extent of the protein interactions for each region of interest within the cell. However, the molecular composition of these regions may change during the course of the acquisition process, limiting the spatial determination of the quantitative values of the apparent FRET efficiencies to an average over entire cells. By means of a spectrally resolved two-photon microscope, we are able to obtain a full set of spectrally resolved images after only one complete excitation scan of the sample of interest. From this pixel-level spectral data, a map of FRET efficiencies throughout the cell is calculated. By applying a simple theory of FRET in oligomeric complexes to the experimentally obtained distribution of FRET efficiencies throughout the cell, a single spectrally resolved scan reveals stoichiometric and structural information about the oligomer complex under study. Here we describe the procedure of preparing biological cells (the yeast Saccharomyces cerevisiae) expressing membrane receptors (sterile 2 &alpha;-factor receptors) tagged with two different types of fluorescent probes. Furthermore, we illustrate critical factors involved in collecting fluorescence data using the spectrally resolved two-photon microscopy imaging system. The use of this protocol may be extended to study any type of protein which can be expressed in a living cell with a fluorescent marker attached to it.

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

By employing a spectrally resolved two-photon microscopy imaging system, pixel-level maps of F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiencies are obtained for cells expressing membrane receptors hypothesized to form homo-oligomeric complexes. From the FRET efficiency maps, we are able to estimate stoichiometric information about the oligomer complex under study.

Em Quantificação in vivo de proteínas G Interações Receptor Acoplado usando espectral Resolvido Microscopia de dois fótons

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Biologia

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

Receptor de imagem proteína G-Coupled (GPCR) mediada por eventos de sinalização que Quimiotaxia de Controle de Dictyostelium discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell or tissue. This process can be analyzed at the level of a single receptor, a population of receptors, or a downstream response. Here we describe how to analyze the downstream response to obtain an estimate of the agonist affinity constant for the active state of single receptors.
Receptors behave as quantal switches that alternate between active and inactive states (Figure 1). The active state interacts with specific G proteins or other signaling partners. In the absence of ligands, the inactive state predominates. The binding of agonist increases the probability that the receptor will switch into the active state because its affinity constant for the active state (Kb) is much greater than that for the inactive state (Ka). The summation of the random outputs of all of the receptors in the population yields a constant level of receptor activation in time. The reciprocal of the concentration of agonist eliciting half-maximal receptor activation is equivalent to the observed affinity constant (Kobs), and the fraction of agonist-receptor complexes in the active state is defined as efficacy (&#949;) (Figure 2).
Methods for analyzing the downstream responses of GPCRs have been developed that enable the estimation of the Kobs and relative efficacy of an agonist 1,2. In this report, we show how to modify this analysis to estimate the agonist Kb value relative to that of another agonist. For assays that exhibit constitutive activity, we show how to estimate Kb in absolute units of M-1.
Our method of analyzing agonist concentration-response curves 3,4 consists of global nonlinear regression using the operational model 5. We describe a procedure using the software application, Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). The analysis yields an estimate of the product of Kobs and a parameter proportional to efficacy (&tau;). The estimate of &tau;Kobs of one agonist, divided by that of another, is a relative measure of Kb (RAi) 6. For any receptor exhibiting constitutive activity, it is possible to estimate a parameter proportional to the efficacy of the free receptor complex (&tau;sys). In this case, the Kb value of an agonist is equivalent to &tau;Kobs/&tau;sys 3.
Our method is useful for determining the selectivity of an agonist for receptor subtypes and for quantifying agonist-receptor signaling through different G proteins.

A method for estimating the affinity constant of an agonist for the active state (Kb) of a G protein-coupled receptor is described. The analysis provides absolute or relative measures of Kb depending on whether constitutive receptor activation is measurable. Our method applies to various responses downstream from receptor activation.

Quantificar atividade agonista no G receptores acoplados à proteína

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Fluorescência baseada em Medição da loja operada entrada de cálcio em células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas em fibra muscular esquelética

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce informative probes or labels into expressed receptors that do not perturb receptor function. We used amber codon suppression technology to genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine (azF) at various targeted positions in GPCRs heterologously expressed in mammalian cells. The versatility of the azido group is illustrated here in different applications to study GPCRs in their native cellular environment or under detergent solubilized conditions. First, we demonstrate a cell-based targeted photocrosslinking technology to identify the residues in the ligand-binding pocket of GPCR where a tritium-labeled small-molecule ligand is crosslinked to a genetically-encoded azido amino acid. We then demonstrate site-specific modification of GPCRs by the bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligation reaction that targets the azido group using phosphine derivatives. We discuss a general strategy for targeted peptide-epitope tagging of expressed membrane proteins in-culture and its detection using a whole-cell-based ELISA approach. Finally, we show that azF-GPCRs can be selectively tagged with fluorescent probes. The methodologies discussed are general, in that they can in principle be applied to any amino acid position in any expressed GPCR to interrogate active signaling complexes.

We genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine at various targeted positions in GPCRs and show the versatility of the azido group in different applications. These include a targeted photocrosslinking technology to identify residues in the ligand-binding pocket of a GPCR, and site-specific bioorthogonal modification of GPCRs with a peptide-epitope tag or fluorescent probe.

Geneticamente codificados Molecular Probes para estudar G receptores acoplados à proteína

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

A Fluorescence-based Exonuclease Assay to Characterize DmWRNexo, Orthologue of Human Progeroid WRN Exonuclease, and Its Application to Other Nucleases

WRN exonuclease is involved in resolving DNA damage that occurs either during DNA replication or following exposure to endogenous or exogenous genotoxins. It is likely to play a role in preventing accumulation of recombinogenic intermediates that would otherwise accumulate at transiently stalled replication forks, consistent with a hyper-recombinant phenotype of cells lacking WRN. In humans, the exonuclease domain comprises an N-terminal portion of a much larger protein that also possesses helicase activity, together with additional sites important for DNA and protein interaction. By contrast, in Drosophila, the exonuclease activity of WRN (DmWRNexo) is encoded by a distinct genetic locus from the presumptive helicase, allowing biochemical (and genetic) dissection of the role of the exonuclease activity in genome stability mechanisms. Here, we demonstrate a fluorescent method to determine WRN exonuclease activity using purified recombinant DmWRNexo and end-labeled fluorescent oligonucleotides. This system allows greater reproducibility than radioactive assays as the substrate oligonucleotides remain stable for months, and provides a safer and relatively rapid method for detailed analysis of nuclease activity, permitting determination of nuclease polarity, processivity, and substrate preferences.

Exonucleases play critical roles in ensuring genome stability. Loss of WRN exonuclease function results in premature aging. Studying substrates and other requirements of the nuclease in vitro can help elucidate its role in vivo. Here we demonstrate a rapid and reproducible fluorescence-based assay to measure its nuclease activity.

WRN exonuclease is involved in resolving DNA damage that occurs either during DNA replication or following exposure to endogenous or exogenous genotoxins. ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.

Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.

Visualizando Endocitose clatrina mediada por receptores acoplados à proteína a resolução de evento único através de microscopia TIRF

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Imagiologia G protein-coupled receptor mediada por quimiotaxia e seus eventos de sinalização em células de HL60 de Neutrófilos-like

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group developed an intra-molecular FRET sensor to detect the interaction between G&#945; subunits and GPCRs in live cells following agonist stimulation. Here, we detail the protocol for detecting changes in FRET between the &#946;2-adrenergic receptor and the G&#945;s C-terminus peptide upon treatment with 100 &#181;M isoproterenol hydrochloride as previously characterized1. Our FRET sensor is a single polypeptide consisting serially of a full-length GPCR, a FRET acceptor fluorophore (mCitrine), an ER/K SPASM (systematic protein affinity strength modulation) linker, a FRET donor fluorophore (mCerulean), and a G&#945; C-terminal peptide. This protocol will detail cell preparation, transfection conditions, equipment setup, assay execution, and data analysis. This experimental design detects small changes in FRET indicative of protein-protein interactions, and can also be used to compare the strength of interaction across ligands and GPCR-G protein pairings. To enhance the signal-to-noise in our measurements, this protocol requires heightened precision in all steps, and is presented here to enable reproducible execution.

Simple methods to detect the selective activation of G proteins by G protein-coupled receptors remain an outstanding challenge in cell signaling. Here, F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET) biosensors have been developed by pairwise tethering a GPCR to G protein peptides to probe conformational changes at controlled concentrations in live cells.

Conformações GPCR G Protein selectivos medida usando FRET Sensores em um Fluorometer Ensaio de células vivas de suspensão

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.

This protocol describes confocal microscopy detection of G protein-coupled receptor (GPCR) internalization in mammalian cells. It includes the basic cell culture, transfection, and confocal microscopy procedure and provides an efficient and easily interpretable method to detect the subcellular localization and internalization of fusion-expressed GPCR.

Detecção de activados por ligandos L acoplado a proteína do receptor de internalização por Microscopia Confocal

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...