Hoje, vamos demonstrar um método para tela de uma biblioteca de peptídeos, contra um receptor mestre recentemente descoberto, que é o receptor de proteína G X2, também conhecido como receptor MRGPRX2. As células de mastro são parte integrante do sistema imunológico, e desempenham um papel crucial nas respostas imunes inatas e adaptativas. As células de mastro são ativadas pelo receptor Fc epsilon R1 ligado ao antígeno, ou pelo receptor X2 recentemente descoberto.
Ativação do receptor X2 ligado à superfície, tem sido ligado a várias doenças imunológicas e inflamadas e, portanto, é importante entender o mecanismo de ligação deste receptor aos seus ligantes. Para isso, desenvolvemos uma biblioteca de pequenas moléculas de peptídeos, e as examinamos contra receptores X2 super-expressos sobre hexis. No estudo, uma biblioteca de peptídeos foi construída utilizando técnicas simples e versáteis de escaneamento alanino, e truncações de aminoácidos.
Heck293 diz que, expressando receptores X2 quando ativados com os peptídeos e hexis de tipo largo foram usados como controle. Na liberação de truncação após a ativação foi monitorado para estudar a ativação baseada em X2. Experimentalmente, o Corante Sensível ao Cálcio Fura-2 AM é animado em 340 e 380 nanômetros, enquanto a emissão é registrada em 510 nanômetros.
Após a ligação de cálcio, a intensidade da fluorescência em 340 aumenta, enquanto a de 380 nanômetros, diminui. O corante é então depositado na proporção da intensidade da fluorescência em 340, para o de 380 nanômetros. O 340 de uma razão de 380, é proporcional ao cálcio intracelular, o valor dele, pode ser calculado, pela Equação de Grynkiewicz.
A razão de tabbing de duas intensidades de fluorescência, efeito de fatores experimentais como diluição, fotobleaching, vazamento de corante e densidades de aroma são detectadas. Então, sem mais atrasos, vamos começar o experimento. Para identificar os ligantes do receptor MRGPR X2 da célula de mastro, o gerador N-Truncado, C-Truncado e a biblioteca de peptídeos N+C-Truncados, truncando os aminoácidos N-terminal, C-terminal e N+C-terminal de má procividade pam-12.
Use síntese de peptídeos de fase sólida para sintetizar os peptídeos. Modifique o terminal final para um grupo de marés definidas, e o terminal C para o grupo amide. Gerar e alaninas podem a biblioteca de peptídeos, substituindo os respectivos aminoácidos de pam-12 por Alanine, um de cada vez.
Modifique o terminal final para um grupo setide e o terminal C para o grupo amide. Prepare o meio de cultura suplementando dMEM de alta glicose, com soro bovino 10% fetal, dois milimônios L-Glutamina, cem unidades por ml de penicilina, e cem microgramas, por ml de estreptomicina. Além das células da cultura tee sue traited, 375 frascos de cultura a 37 graus Celsius, 5%CO2, até que sejam 75 a 80% confluentes.
Uma vez 75% confluente, lave as células e adicione de dois a três ml de Prova-C, para desprender as células. Uma vez que as células se despem, colete as células em Proof-C. Adicione seis a nove ml de meio fresco.
Centrifugar as células a 1620g por três a cinco minutos. Após a centrifugação, descarte o sobrenatante para coletar a pelota. Resuspend as células em meio de cultura fresca.
Diluir as células, conforme a concentração desejada. Com 200 microlitadores da suspensão celular com a concentração de 200.000 células, despeje o ambon em cada poço para buscar 40.000 células por poço. Guarde as células por 24 horas nos 37 graus Celsius, incubadora de 5% de CO2.
Use corante Fura-2 AM para o experimento. Adicione 50 microliter DMSO em 50 microgramas Fura-2 AM, para preparar uma solução milimiliar de corante Fura-2 AM. Adicione um microliter de um corante Fura-2 AM mililitro por ml de meio fresco para preparar o meio de diluição de uma concentração de corante micromolar.
Retire a placa de 96 poços da incubadora e descarte o meio. Substitua o meio por meio de diluição fresco. Adicione 200 microliters de meio de diluição em cada poço.
Incubar as células por 30-40 minutos em 37 graus Celsius, incubadora de 5% de CO2. Enquanto as células estão sendo incubadas, defina o leitor de placas. Coloque a temperatura em 37 graus Celsius.
Nas configurações, selecione Flex. Defina o modo de leitura como fluorescência e leitura inferior. Em Comprimentos de Onda, defina o número de comprimentos de onda para dois.
Coloque a Excitação em 340 nanômetros e 380 nanômetros. Defina a emissão para 510 nanômetros. Deixe a sensibilidade para padrão.
Em Tempo, defina o intervalo para 3,9 segundos. Defina o tempo de execução para 94 segundos para obter 25 números de leituras. Em seguida, selecione o tipo placa de ensaio.
Em seguida, selecione os Poços para Ler. Em Transferência composta, ajuste as transferências para um e volume inicial para cem microliters. Ajuste a altura da pipeta para cem microliters, Volume para 50 microliters e Ponto de Tempo para 36 segundos para adicionar o composto, e para atender a leitura.
Em seguida, selecione o tipo de placa de origem composta. Deixe triturate para não ser usado. Selecione o Layout de Dicas e Dicas de Pipeta.
Para colunas compostas e pontas, o composto será transferido na coluna um da placa composta. Defina a Coluna de Ponta para uma e a Coluna do Composto para uma. Deixe AutoCalibrate para On.Click OK. Após 40 minutos de incubação, remova o meio.
Lave as células com o buffer XDB. Adicione cem microliters de tampão XDB para leitura de fluorescência. Leve o prato para leitura de fluorescência.
Quando pritchett atingir 37 graus Celsius, pressione a câmara de leitura, para colocar a placa de ensaio no leitor de placas de fluorescência. Pressione a fonte para colocar a placa composta. Prepare a placa composta adicionando 200 microliters de peptídeos respeitados ionomysin e EGTA para girar soluções X.
Pressione a ponta pratt para colocar a caixa de gorjetas. Use a ponta preta para evitar a autofluorescência da ponta. Uma vez que as placas tenham sido mantidas, e se você usar as configurações do software e pressionar Leia.
Determine a concentração de cálcio da razão de fluorescência pela Equação de Grynkiewicz. Mostrado são os dados de fluorescência de pam bom peptídeo. Como se pode ver, após a adição de peptídeos em 36 segundos, a fluorescência em 340 nanômetros que é mais mordaz aumenta em 380 nanômetros o recorde diminui.
Os dados são representados como a razão de 340, para o de 380 sinal. Eles mostram que os sinais aumentam após a adição de peptídeos. Este número são os dados representativos para um peptídeo ativador.
A Figura A mostra os sinais de fluorescência para um peptídeo ativador. Os dados representativos correspondem ao cram12 Peptide foi adicionado após a criação de uma linha de base para ciclos de licitação, como mostrado pelo ado. A Figura B mostra a razão de emissão de fluorescência após excitação em 340 nanômetros, para a de emissão de fluorescência após excitação em 380 nanômetros.
Este número são os dados do Representante para o branco. A Figura A mostra os sinais de fluorescência para o vazio. O HTB foi adicionado após diluir uma linha de base para 10 ciclos de alimentação, como mostrado pelo ado.
A Figura B mostra a ração da emissão de fluorescência após excitação em 340 nanômetros para a de emissão de floresnce após excitação em 380 nanômetros. Este número são os dados representativos para as normas de calibração de corantes. A Figura A mostra que a ionomicina foi adicionada na décima leitura, como mostrado pelo ado para obter fluorescência máxima em estado vinculado ao cashem.
EGPA Triton X cem foi adicionado após 20 leituras, como mostrado pelo ado que recebe sinal mínimo. A Figura B mostra a razão de emissão de fluorescência após excitação em 340 nanômetros para a de emissão de fluorescência após excitação em 380 nanômetros. Esses valores são ainda colocados na Equação de Grynkiewicz para obter o cache intracelular de concentração.
Esta figura mostra a caracterização de um Peptídeo Representativo para Confirmar a Sequência e a Pureza. A Figura A mostra que a massa vertical da sequência de peptídeos representativo WNK WAL foi de 857,90 diluir tingimento. O que é mostrado pela razão N sobre Zed na Espectroscopia de Massa.
A Figura B mostra uma pureza de peptídeo de 99%, confirmada pelo HPLC. Este peptídeo pertence à biblioteca de peptídeos truncados N+C. Em conclusão, o método descrito aqui é um fácil e versátil que pode ser eficiente e brilhante para a triagem baseada em cálcio em última escala.
No entanto, existem vários fatores que determinam a qualidade dos dados e, portanto, a maquiagem precisa ser otimizada para um determinado sistema de instrumentos celulares. Obrigado.
