Este trabalho foi apoiado pela Research Triangle MRSEC da NSF (DMR-1121107).

1. ELP Expression <ol><li> Inocular 3 ml de meio Terrific Broth estéreis com um estoque DMSO ou placa de ágar colônia de E. coli adequada para a expressão da proteína que contém o plasmídeo ELP-codificação desejada sob o controlo do promotor de T7-lac. Adicionar o antibiótico apropriado e incubar a 37 ° C durante a noite (O / N) com agitação contínua a 200 rpm. </li><li> Adicionar 1 ml de cultura O / N a 1 L de Terrific Broth meio estéril em um balão de 4 L. Adicionar o antibiótico apropriado e incubar a 37 ° C durante 24 h, com agitação contínua a 200 rpm. NOTA: O &quot;permeável&quot; a expressão da linha de base observado com o promotor de T7-lac é suficiente para a expressão de nível elevado de muitos ELPs se a cultura é incubada durante 24 horas. No entanto, uma abordagem mais convencional pode ser utilizado, em que a expressão de proteínas é ainda induzida pela adição de 0,2-1 mM de isopropil-beta-D-tiogalactósido (IPTG), quando a densidade óptica da cultura chega a 0,6. </li&gt; <li> Transferir a cultura do balão de 4 L com uma garrafa de centrífuga de 1 L e centrifuga-se a 4 ° C durante 15 min a 2.000 x g. </li><li> Desprezar o sobrenadante. NOTA: Se mais de 1 L de cultura é cultivada eles podem ser condensados ​​por adição de mais um litro de cultura para o sedimento e repetindo o passo 1.3. Até 2 L de cultura pode ser condensado em um único pelete celular. </li><li> Ressuspender o sedimento em tampão fosfato salino (PBS), água, ou outro tampão desejado para atingir 45 ml de suspensão de células e transferir para um tubo de 50 ml. </li></ol> 2 ELP purificação:. Etapas preliminares e Primeira Rodada de Inverse Transição Ciclismo <ol><li> Sonicar a pelete celular foi novamente suspensa para um total de 9 minutos em ciclos de 10 seg &#39;on&#39; e 20 segundos &quot;off&quot; com uma potência de saída de 85 W, mantendo a amostra em gelo. Resumidamente permitir que a amostra esfriar no gelo e, em seguida, repita a 9 min ciclo mais uma vez. NOTA: Se o ELP está prevista para ter uma muito baixa T t </sub&gt; o intervalo de &#39;off&#39; pode ser aumentado até 40 segundos para evitar o aquecimento da solução acima do T t. </li><li> Transferir o lisado para uma de 50 ml de fundo redondo tubo de centrífuga. </li><li> Adicionar 2 ml de 10% (w / v) polietileneimina (PEI) para cada litro de cultura e agite para misturar. NOTA: PEI é um polímero carregado positivamente, que auxilia na condensação dos contaminantes genéticos carregados negativamente. Não execute esta etapa se o ELP é carregada negativamente, como o PEI também pode condensar e remover o produto ELP. </li><li> Centrifugar a 4 ° C durante 10 min a 16.000 x g. </li><li> Transferir o sobrenadante para um ambiente limpo 50 ml rodada tubo de centrifugação de fundo e descartar o sedimento. </li><li> Opcional &quot;cozer a&quot; etapa: incubar a amostra a 60 ° C durante 10 minutos para desnaturar os contaminantes de proteína e, em seguida, transferir a 4 ° C ou de gelo até o ELP é completamente ressolubilizado. Centrifugar a amostra a 4 ° C durante 10 min a 16.000 x g. Transfira o sobrenadante para um clean 50 ml rodada tubo de centrifugação de fundo e descartar o sedimento. NOTA: Não realizar este passo, se um péptido ou proteína é fundida com o PEL e espera-se desnaturar na condição de calor elevado. Isto pode causar a transição ELP a tornar irreversível ao calor ou podem destruir a actividade da porção fundida. </li><li> Induzir a transição ELP com a adição de NaCl cristalino (não superior a 3 M). Alternativamente, o citrato de sódio (não superior a 0,3 M) pode ser usado para ELPs que têm maior T t s ou baixos rendimentos. NOTA: A solução deve ficar turva uma vez que o sal se dissolveu, o que indica a fase de separação da solução de PEL. ELPs muito hidrofílicos com alta T t s pode exigir um certo grau de aquecimento, em combinação com a adição de sal, para induzir a separação de fases do PEL neste indução preliminar da transição ELP. </li><li> Centrifugar a temperatue ambiente (RT) por 10 min a 16.000 xg (spin quente). NOTA: Um pellet ELP deve bE observado, cujo tamanho depende do rendimento do PEL expressão. Este pellet ELP pode parecer à primeira vista opaca, mas após o resfriamento ele aparecerá translúcida e pode ser na cor marrom. O pellet ELP se tornará mais incolor como purificação de receitas e contaminantes são removidos. </li><li> Descartar o sobrenadante e adicionar 1-5 mL de tampão desejado para o pelete. Ressuspender o sedimento por pipetagem ou definindo o tubo para rodar a 4 ° C. NOTA: O volume requerido de tampão vai depender do tamanho do sedimento ELP, e, assim, o rendimento da expressão ELP, onde uma quantidade suficiente de tampão deve ser adicionado para permitir a ressolubilização do pelete ELP. ELPs com benefício alto teor de cisteína a partir de purificação em água com tampão Tris 10 mM de cloridrato de (2-carboxietil) fosfina (TCEP-HCl) a um pH de 7 a eliminar interacções dissulfureto, com as proteínas contaminantes. ELPs com benefício elevado teor de carga de purificação a um pH ajustado para neutralizar a sua carga e reduzir elementoctrostatic interacções com as proteínas contaminantes. </li><li> Transferir a solução ELP ressuspenso em 1 ml de partes alíquotas em tubos de microcentrífuga limpo de 1,5 ml. </li><li> Centrifugar a 4 ° C durante 10 minutos a 16.000 xg (spin frio). Uma pequena bolinha de contaminantes insolúveis devem ser observadas. </li><li> Transferir o sobrenadante para um tubo limpo e descartar o sedimento. </li></ol> . 3 ELP Purificação: rodadas subseqüentes de Inverse Transição Ciclismo <ol><li> Induzir a transição ELP com calor e / ou a adição de NaCl. As amostras podem ser incubadas num bloco de aquecimento ou em banho-maria durante 15 minutos a uma temperatura superior a T t. Se, no entanto, o ELP é fundida a uma proteína (excluindo a utilização de calor) ou se o PEL tem um elevado t T, que não pode ser alcançado com o calor sozinho, uma solução de NaCl a 5 M pode ser adicionada gota a gota para induzir a transição ELP. NOTA: A solução deve turvar, indicando a separação de fases do ELP da solução. </li><li&gt; Centrífuga por 10 min a 16.000 xg (spin quente). Se o calor foi usado no passo 3.1, executar este passo de centrifugação a uma temperatura acima do que foi necessário para induzir a transição ELP. Se só NaCl foi utilizado na etapa 3.1, realizar esta etapa de centrifugação à TA. Nota: Um pellet ELP devem ser observadas. </li><li> Rejeitar o sobrenadante, adicionar 500-750 ul de tampão desejado, e ressuspender o sedimento por pipetagem ou definindo o tubo para rodar a 4 ° C. </li><li> Centrifugar a 4 ° C durante 10 minutos a 16.000 xg (spin frio). Uma pequena bolinha de contaminantes insolúveis devem ser observadas. </li><li> Transferir o sobrenadante para um tubo limpo e descartar o sedimento. </li><li> Repita os passos 3.1 a 3.5 até que nenhum sedimento contaminante é observado durante a etapa 3.4. </li></ol> 4. Processamento Pós-purificação (opcional) <ol><li> Se desejado, a amostra dializar contra um tampão adequado para remover o excesso de sal a partir da solução purificada ELP. NOTA: ELPs ser liofilizados devem serdialisados ​​contra DDH 2 OO / N a 4 ° C. </li><li> Se desejado, liofilizar o ELP para armazenamento a longo prazo por congelação da solução a -80 ° C durante 30 min antes da liofilização S / N. NOTA: a liofilização não deve ser utilizado para ELPs com proteínas anexas. </li><li> Se desejado, recuperar o péptido livre ou proteína a partir de um péptido ou proteína de fusão ELP removendo a etiqueta ELP: <ol><li> Digerir o péptido ou proteína de fusão com protease ELP biotinilada (como recomendado pelo fornecedor de protease) ou com uma fusão de protease ELP correspondente ao sítio de protease geneticamente concebido entre o péptido ou proteína e ELP. </li><li> Se for o caso, remover a protease biotinilado utilizando pérolas modificadas com estreptavidina (como recomendado pelo fornecedor de protease). </li><li> Induzir a transição do ELP clivada e / ou ELP fusão protease pela adição gota a gota de uma solução 5 M de NaCl. </li><li> Centrifuga-se a TA durante 10 min a 16.000 x g. Nota: Um pellet ELP devem ser observadas. </li><li>Recolher o sobrenadante e descartar o pellet ELP. Dialisar o sobrenadante contra um tampão desejado ou usar um filtro centrífugo para realizar uma troca do tampão, a fim de remover a elevada concentração de sal a partir do péptido puro ou uma solução de proteína. </li><li> Confirmar a clivagem completa do péptido livre ou proteína a partir da etiqueta ELP por dodecil sulfato de sódio a electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). </li></ol></li></ol> 5 Caracterização:. SDS-PAGE <ol><li> Preparar amostras ELP para SDS-PAGE através da mistura de 10 uL de ELP diluído em água com 10 ul de tampão de amostra contendo 2-mercaptoetanol. NOTA: 40 ug de ELP é muitas vezes suficiente para avaliar o tamanho e pureza do produto ELP. </li><li> Incubar a amostra a 100 ° C durante 2 min e, em seguida, carrega-se num gel de poliacrilamida juntamente com uma escada de proteína de tamanho apropriado. </li><li> Submeter o gel a 180 V até que o corante aproxima-se do fundo do gel (cerca de 45 min). </li><li> Manchar ogel com uma solução 0,5 M de CuCl 2 por 5 min, enquanto que de balanço. NOTA: ELPs normalmente não são visualizadas por Coomassie Brilliant mancha azul, como algumas seqüências ELP não interagem com este corante. Azul Brilhante de Coomassie interage principalmente com resíduos de arginina e interage fracamente com outros resíduos de histidina de base e de lisina e resíduos aromáticos-triptofano, tirosina e fenilalanina 26. Assim ELPs e péptido ou proteína ELP fusões podem ser corados com Azul Brilhante de Coomassie apenas se a sua sequência primária inclui um número suficiente destes resíduos específicos. </li><li> Verificar que o PM do ELP banda corresponde à do MW teórico esperado a partir do gene CEL e que não há bandas de contaminantes externos estão presentes. NOTA: Alguns ELPs migrar com uma aparente MW até 20% maior do que o seu MW esperado 9, 27. </li></ol> 6 Caracterização:. Matriz assistida por laser de Dessorção /ionização Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF-MS) <ol><li> Prepara-se uma solução de PEL em 50% de acetonitrilo aquoso contendo ácido trifluoroacético a 0,1% para se obter uma concentração de cerca de PEL 25 uM. NOTA: Esta solução deve ser livre de sal, para ELP deve ser dialisados ​​contra H2O após purificação. </li><li> Prepara-se uma solução matriz de ácido sinapinico saturada em 50% de acetonitrilo aquoso contendo ácido trifluoroacético a 0,1%. </li><li> Adicionar 1 ml de solução ELP a 9 ul da solução de matriz para alcançar uma concentração de cerca de 2,5 ELP pmoles / ul. NOTA: esta mistura pode ser ainda mais diluída com solução de matriz para optimizar o sinal de MALDI-TOF. </li><li> Depósito 1-2 ul da mistura ELP-matriz sobre uma placa de metal de MALDI e deixar o local secar completamente. </li><li> Obter 5-10 espectros com MALDI-TOF para determinar a massa de cobrar taxa de (m / z) do ELP e inferir a sua MW medido. </li></ol> 7. Characterization: Turbidimetria e espalhamento dinâmico de luz à temperatura programada <ol><li> Determine o T t do ELP por turbidimetria a temperatura programada: <ol><li> Prepara-se uma série de diluições (por exemplo, de 5-100 fiM) de soluções ELP no tampão desejado. </li><li> Usando um espectrofotómetro de UV-Vis com temperatura controlada, medir a densidade óptica (DO) a 350 nm ao longo de um intervalo de temperaturas (por exemplo, 20-80 ° C) a uma taxa de aquecimento de 1 ° C / min. NOTA: Se não houver aumento de OD é visto o T t pode exceder o limite superior da temperatura do instrumento. A t t aparente pode ser diminuída pela adição de NaCl. Iniciar a 1 M de NaCl e aumentar em passos de 0,5 M até a transição ELP é detectada dentro de um intervalo de temperatura mensurável. </li><li> Verificar a reversibilidade da transição ELP medindo a diminuição no OD durante o mesmo intervalo de temperatura, a uma taxa de arrefecimento de 1 ° C / min. </li><li> Determine o T t do homopolímero ELP, identificando o ponto de inflexão no perfil de turbidez (DO traçada em função da temperatura). NOTA: Esta temperatura pode ser facilmente definida a partir do derivado da curva de OD, em que a temperatura correspondente ao máximo do derivado é definido como o T t. Arquiteturas ELP mais complexos irá exibir perfis de turbidez mais complicadas e deve continuar a ser analisados ​​como descrito na seção 7.2. </li></ol></li><li> A caracterização adicional do ELPs que exibem propriedades térmicas mais complexos (por exemplo, copolímeros de dibloco ELP que se auto-montar em micelas esféricas) é obtido por dispersão de luz dinâmica (DLS): <ol><li> Prepara-se uma solução ELP no tampão desejado e fazer passar a amostra através de um filtro com um tamanho de 20-450 nm de poro. NOTA: A escolha do tamanho dos poros do filtro dependerá da presença, tamanho, e a estabilidade de quaisquer conjuntos de PEL em solução. O menor tamanho dos poros do filtro viável é o preferido para eliminar os contaminantes, como por exemplopoeira, que diminuem a qualidade de medidas de DLS. A tamanho dos poros do filtro maior deve ser usado quando a resistência significativa é experimentado quando se passa uma solução ELP através de poros do filtro menores. </li><li> Medir o raio hidrodinâmico (R H) ao longo de um intervalo de temperaturas que corresponde a uma região de interesse identificada no perfil de turbidez. NOTA: unimers ELP normalmente têm um R H &lt;10 nm, as assembléias de nanopartículas têm um R H ~ 20-100 nm e agregados têm um R H&gt; 500 nm. Cada aumento em I H deve corresponder a um aumento da densidade óptica a 350 nm, medido por espectrofotometria de UV-Vis, como uma função da temperatura, que é proporcional ao tamanho da partícula. </li></ol></li></ol>

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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+purification+by+reversible+phase+transition+following+Escherichia+coli+expression+of+genes+encoding+up+to+251+repeats+of+the+elastomeric+pentapeptide+GVGVP.">Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP.</a> Protein expression and purification. 7, 51-57 (1996).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides.">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nat Biotechnol. 17, 1112-1115 (1999).</li><li>McDaniel, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+thermally+responsive+nanoparticles+of+a+genetically+encoded+peptide+polymer+by+drug+conjugation.">Self-assembly of thermally responsive nanoparticles of a genetically encoded peptide polymer by drug conjugation.</a> Angewandte Chemie. 52, 1683-1687 (2013).</li></ol>

Os autores não têm concorrentes interesses financeiros para divulgar.

ELPs oferecer um meio barato e livre de cromatografia de purificação por exploração do seu comportamento de fase de estímulo-resposta. Esta abordagem toma vantagem do comportamento TCIS de ELPs e péptidos ou ELP proteína fusões de eliminar ambos os contaminantes solúveis e insolúveis após expressão de ELPs geneticamente codificados em E. coli. Esta facilidade de purificação pode ser utilizado para produzir ELPs para uma variedade de aplicações, ou podem ser exploradas para a purificação de péptidos recombinantes ou proteínas, em que o ELP pode actuar como uma marca de purificação que pode ser removido com o processamento pós-purificação. ELP purificação envolve etapas preliminares para lisar a E. coli e remover os detritos celulares insolúveis genómico e a partir do lisado da cultura em bruto (Figura 1), seguido por remoção de contaminantes solúveis e insolúveis residuais por ITC (Figura 2). Centrifugação após a activação da transição ELP pela adição de calor ou sal se separa do PEL de contaminantes solúveis no sobrenadante, numa etapa denominada de rotação quente. Após resolubilizing ELP, a solução é centrifugada de novo a uma temperatura inferior a T t para remover o pelete de contaminantes insolúveis, num passo denominado um spin frio. Alternando rotações quentes e frios aumenta a pureza da solução ELP com cada ciclo, com um custo pequeno para produzir. Os rendimentos de purificação variar dependendo do ELP T t, comprimento, e peptídeos ou proteínas fundidas. Normalmente, este protocolo produz 100 mg de ELP purificado por litro de E. cultura coli, porém os rendimentos podem chegar a até 500 mg / L. A pureza do produto final ELP é confirmada por SDS-PAGE (Figura 3). O MW do ELP purificada deve corresponder de perto com o MW teórico codificada pelo gene ELP. No entanto, alguns ELPs migrar em SDS-PAGE com um aparente MW até 20% mais elevado do que o PM esperado 9, 27. Uma análise mais precisa do ELPMW pode ser alcançado por MALDI-TOF-MS, o que também pode fornecer informação adicional sobre a pureza do produto ELP, juntamente com as técnicas analíticas ortogonais, tais como a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Após purificação, o ELP T t é medido por turbidimetria a temperatura programada. Esta técnica monitora o OD de uma solução ELP, enquanto a temperatura é aumentada. O T t é dependente da concentração, por isso é aconselhável para caracterizar uma série de concentrações relevantes para a aplicação pretendida do ELP. Para ELP homopolímeros o perfil turbidez exibe um único aumento acentuado que corresponde à transição de ELP UNIMER agregados à escala mícron (Figura 4A). A t t é definido como a temperatura correspondente ao ponto de inflexão no perfil de turbidez, precisamente determinado como o valor máximo da primeira derivada do OD em relação à temperatura. A reversibilidade doTransição de fase ELP é confirmada por uma diminuição na OD a linha de base como a temperatura é reduzida abaixo da T t (Figura 4B). O perfil de turbidez com o aumento da temperatura ea diminuição rampas serão diferentes em magnitude e cinética devido à resolução de coacervates ELP e histerese variável do ELP ressolubilização. Péptido ou proteína ELP fusões de apresentar um comportamento semelhante TCIS, desta forma, em que o péptido ou proteína de fusão para o ELP afecta o T t. Para a proteína ELP fusões a transição é reversível abaixo da temperatura de fusão da proteína. Enquanto turbidimetria a temperatura programada é um excelente método para a caracterização térmica inicial de produtos ELP, técnicas alternativas, tais como calorimetria de varrimento diferencial (DSC), também pode ser utilizado para medir o ELP T t. ELPs com comportamentos térmicos arquitecturas exposição mais complicados mais complexos, que também pode ser caracterizada pela temperatura progra-turbidimetria mmed. ELP copolímeros de dibloco, por exemplo, apresentam um perfil de turvação característica correspondente à sua auto-montagem desencadeada-temperatura em micelas esféricas na sua temperatura crítica de micelização. Para estes copolímeros dibloco ELP a OD tipicamente primeiro aumenta 0,1-0,5 unidades acima do valor basal, indicando a transição de unimers para micelas, após o que um aumento acentuado na OD (até 2,0 unidades acima do valor inicial), a uma temperatura mais elevada indica a formação de micro-escala agregados (Figura 5A). Informações adicionais sobre a auto-montagem de estruturas ELP desencadeada de temperatura é obtida com DLS, uma técnica que mede a R H de conjuntos ELP em solução. Alterações em R H concorda estreitamente com as mudanças na OD medidos com turbidimetria (Figura 5B). Unimers ELP normalmente exibem um R H &lt;10 nm, enquanto os conjuntos de nanopartículas apresentam um R H ~ 20-100 nm e agregados exibem um R H </sub &gt;&gt; 500 nm. Informação adicional sobre as nanopartículas ELP auto-montadas, como o número de agregação e morfologia, pode ser obtida por dispersão de luz estática ou microscopia electrónica de transmissão criogénica 17, 23, 29. Devido à tunability das propriedades térmicas ELP, uma gama de T t s é obtida por vários projetos ELP. É importante ter em mente que o inerente T t irá influenciar a otimização do protocolo de purificação para cada ELP, onde extremamente baixa ou alta T t s vai exigir o máximo modificação a este protocolo padrão. ELPs com temperaturas extremamente elevadas de transição pode não ser adequada para a purificação com esta abordagem. Se a concepção de novos ELPs e péptidos ou ELP proteína fusões podem comprometer o comportamento térmico do PEL, um marcador de histidina simples pode ser incluído para a purificação por meio de cromatografia de afinidade alternativo de metal imobilizado. Adicionalmente,características da seqüência ELP pode exigir a modificação deste protocolo se o resíduo de hóspedes está carregada. A manipulação do pH pode ser usado como um método para alterar a carga global do PEL num esforço para eliminar as interacções electrostáticas com os contaminantes 17. Além disso, este protocolo é apropriado para a circunstância especial de fusões ELP com peptídeos e proteínas quando são tomadas medidas adequadas para garantir que o processo de purificação não perturbar a atividade da porção fundida. Notas em todo o protocolo sobre as modificações servem para direcionar a purificação da ELPs que podem apresentar estes desafios com relação a T t, carga, ou preocupações de fusão. A purificação de ELPs por meio de seu comportamento TCIS apresenta uma abordagem simples e livre de cromatografia para purificar a maioria dos péptidos e ELPs ELP ou fusões de proteínas expressas em E. coli. O protocolo resumido aqui permite purificação of ELPs em um único dia, utilizando equipamentos que são comuns à maioria dos laboratórios de biologia. A facilidade de purificação de ELPs e suas fusões será, esperamos, incentivar uma crescente diversidade de projetos ELP para novas aplicações em ciência dos materiais, biotecnologia e medicina.

Polipéptidos elastina semelhantes (ELPS) são biopolímeros compostos da VPGXG pentapéptido de repetição, em que X, o resíduo hóspede, é qualquer aminoácido excepto prolina. ELPs exposição temperatura crítica inferior de solução (LCST) comportamento de transição de fase, de tal forma que uma solução homogênea ELP vai separar em duas fases após aquecimento à sua LCST, o que é comumente chamado de temperatura de transição inversa (T t) na literatura ELP 1. As duas fases são constituídas por uma fase muito diluída glóbulo ELP e uma fase rica sedimento ELP. Os ricos sedimentos ELP é formado em um curto espaço de tempo após a agregação das cadeias ELP em partículas micro-empresas que, posteriormente, se aglutinam. Este comportamento ocorre ao longo de um intervalo de alguns graus Celsius e está geralmente reversíveis, como uma solução homogénea é recuperada após retorno a uma temperatura inferior a T t. ELPs são tipicamente sintetizados em Escherichia coli (E. coli) from um gene artificial que é ligado a um plasmídeo de expressão. Este plasmídeo é então transformado num E. linha celular de E. coli, que é óptimo para a expressão da proteína. Temos usado exclusivamente o sistema de vetor T7-lac pET para a expressão de uma grande variedade de ELPs em E. coli, embora outros sistemas de expressão em levedura 2-4, 5 fungos, plantas e 6-8, também têm sido utilizados por outros investigadores. Uma série de abordagens existem para construir genes geneticamente ELP repetitivas, incluindo ligadura recursiva direcional (RDL) 9, ligadura direcional recursiva por plasmídeo reconstrução (pré-RDL) 10, e se sobrepõem extensão rolamento círculo de amplificação (OERCA) 11. A capacidade para manipular ELPs a nível genético permite a oportunidade de usar técnicas de DNA recombinante para criar ELPs com uma variedade de arquitecturas de (por exemplo, monoblocos, diblocos, triblocos, etc), que pode ainda ser acrescentada com funcionalpeptídeos e proteínas. Controle no nível genético também garante que cada ELP é expressa com o comprimento ea composição ditada por seu modelo plasmídeo genética exata, fornecendo produtos de biopolímeros perfeitamente monodispersos. As propriedades térmicas de cada ELP depender de parâmetros intrínsecos ao biopolímero tal como o seu peso molecular (PM) e da sequência, assim como factores extrínsecos, incluindo a sua concentração em solução e na presença de outros cosolutes, tais como sais. O comprimento do ELP 12 e sua composição resíduo convidado 1, 13, 14 são dois parâmetros ortogonais em design ELP que podem ser usados ​​para controlar o T t, em que os resíduos de hóspedes hidrofóbicas e comprimentos de cadeia mais longa resultará em menor T t s, enquanto hidrofílico resíduos de hóspedes e comprimentos de cadeia mais curta resultar em maior T t s. Concentração ELP está inversamente relacionado com a T t, onde as soluções de grconcentração comedor ELP têm menor T t s 12. O tipo e concentração de sais também influenciar o ELP T t, onde o efeito de sais segue a série de Hofmeister 15. Ânions cosmotrópicos (Cl - e maior na série de Hofmeister) reduzir o ELP T t e aumento da concentração de sal aumenta esse efeito. Estes parâmetros intrínsecos e extrínsecos podem ser ajustados para se obter um comportamento térmico dentro de um intervalo de temperatura alvo, que é necessário para uma aplicação específica de uma ELP. O comportamento estímulo-responsivo de ELPs é útil para uma gama diversificada de aplicações, incluindo biosensing 16, 17, 18 a engenharia de tecidos, e entrega da droga 19, 20. Além disso, quando ELPs são fundidas com os péptidos ou proteínas a nível genético, o ELP pode servir como uma marca de purificação simples para proporcionar um método barato para a purificação de lote de pep recombinantemarés ou proteínas que não requer cromatografia 21. Modificação do processo de purificação assegura que a actividade do péptido ou proteína de fusão para o ELP é mantida. Péptido ou proteína ELP fusões podem ser purificados para aplicações em que a etiqueta ELP é útil 22, 23, ou alternativamente, quando é necessário o péptido livre ou de proteína, um local de reconhecimento de protease pode ser inserido entre o péptido ou proteína e ELP. A remoção do tag ELP pode ser alcançado através da digestão com protease livre ou uma fusão ELP protease, onde a última oferece a facilidade adicional de processamento como uma rodada final de ELP purificação pode separar o ELP tag e protease ELP fusão do peptídeo alvo ou proteína num único passo 24, 25. O protocolo seguinte descreve o procedimento de purificação para ELPs e péptidos ou ELP fusões de proteína por meio das suas propriedades térmicas e discute técnicas básicas para caracterizaro comportamento térmico de produtos ELP.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1503">
	<tbody>
		<tr>
			<td>pET-24a(+) 
			pET-25b(+)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69749-3 
			69753-3</td>
			<td>T7-lac expression vectors with resistance to kanamycin (pET-24) or ampicillin (pET-25).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra BL21 (DE3) competent cells</td>
			<td>Edge BioSystems</td>
			<td>45363</td>
			<td>Competent E. coli for recombinant protein expression.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth (TB) Dry Powder Growth Media</td>
			<td>MO BIO Laboratories</td>
			<td>12105</td>
			<td>Media is reconstituted in DI H2O and autoclaved before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I2481C</td>
			<td>IPTG is reconstituted in DI H2O, sterile filtered, and added to cultures to induce enhanced expression.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) tablet</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>524650</td>
			<td>These PBS tablets, when dissolved in 1 L of DI H2O, yield a 10 mM phosphate buffer with 140 mM NaCl, and 3 mM KCl with a pH of 7.4 at 25 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine (PEI) Solution (~50% w/v)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>195444</td>
			<td>PEI is prepared as a 10% (w/v) solution in deionized H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Oak Ridge high-speed centrifuge tubes, 50 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3138-0050</td>
			<td>These round-bottom tubes withstand high-speed centrifugation of 30-50 ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP-HCl)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20491</td>
			<td>A stock solution of TCEP-HCl is prepared at 100 mM in DI H2O and adjusted to pH 7.0. For ELPs with a high cysteine content the stock solution of this reducing agent is added to the ELP pellet to reach 10 mM in H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ready Gel Tris-HCL gel, 4-20% linear gradient polyacrylamide gel, 10 well, 30 &#956;l</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>161-1105</td>
			<td>These linear gradient gels offer good visualization of ELPs with a range of MWs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cupric chloride dihydrate (CuCl2-2H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C454-500</td>
			<td>A filtered 0.5 M solution is prepared for negative staining of Tris-HCL polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anotop 10 syringe filter: 
			0.02 &#956;m 
			0.1 &#956;m 
			0.2 &#956;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6809-1002 
			6809-1012 
			6809-1022</td>
			<td>These 10 mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes for DLS measurements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV filter: 
			0.45 &#956;m</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLHVX13NK</td>
			<td>These 13 mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes of solutions with large nanoparticle assemblies for DLS measurements.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-chromatographic purification of recombinant elastin-like polypeptides and their fusions with peptides and proteins from escherichia coli

Polipéptidos de elastina-como são biopolímeros repetitivas que exibem um comportamento crítica inferior a temperatura de transição de fase de solução, como unimers solúveis existente abaixo de uma temperatura de transição característica e agregação em coacervatos escala mícron acima da sua temperatura de transição. A criação de polipéptidos de elastina semelhante ao nível genético permite um controlo preciso da sua sequência e comprimento, que determina as suas propriedades térmicas. Polipéptidos de elastina-como são utilizados numa variedade de aplicações, incluindo biosensing, engenharia de tecidos, e a entrega da droga, em que a temperatura de transição e arquitectura biopolímero do PEL pode ser sintonizado para a aplicação específica de interesse. Além disso, o comportamento de transição de fase da temperatura crítica inferior de solução de polipeptídeos elastina semelhantes permite a sua purificação por meio de sua resposta térmica, de tal modo que a sua coacervação selectiva e ressolubilização permite a remoção de ambos os contaminantes solúveis e insolúveiss seguinte expressão em Escherichia coli. Esta abordagem pode ser utilizada para a purificação de si só ou como uma ferramenta para a purificação de péptidos de proteínas ou péptidos recombinantes em que as fusões ou proteínas geneticamente anexas para as etiquetas de polipeptídeos elastina semelhantes podem ser purificados sem cromatografia de elastina-como polipeptídeos. Este protocolo descreve a purificação de polipeptidos semelhantes elastina e suas fusões de péptido ou proteína e discute técnicas básicas de caracterização para avaliar o comportamento térmico de produtos polipeptídicos de elastina puros similares.

Aqui descrevemos resultados representativos para a purificação e caracterização de um homopolímero e um copolímero de ELP dibloco ELP. Após 24 horas de expressão em E. coli, as células são recolhidas por centrifugação e lisadas por sonicação. Tipicamente, uma mudança na cor subtil ocorre após sonicação, confirmando a lise celular suficiente (Figura 1A). Após a adição de PEI, componentes genómicos e os restos celulares são recolhidas por centrifugação, a separação de uma grande pelota de contaminantes insolúveis do ELP solúvel no sobrenadante (Figura 1B). ELP é ainda purificado por inversa ciclismo transição (ITC), que explora o comportamento TCIS para separar o PEL de contaminantes ambos solúveis e insolúveis (Figura 2) 28. A transição de fase do ELP é desencadeada pela adição de calor e / ou sal. Resultados da centrifugação a formação de um sedimento no fundo do tubo que é constituído por um ELPnd alguns contaminantes insolúveis (Figura 1C). Este passo denominado um spin-descarta quentes contaminantes solúveis no sobrenadante enquanto o sedimento ELP é retido e ressuspenso em tampão frio. O ressolubilizado ELP é centrifugado de novo a 4 ° C. Este passo-denominado um resfriado spin-devoluções a pelota de contaminantes insolúveis enquanto o sobrenadante contendo ELP solúvel é mantido. Repetir o ciclo de rotações alternadas quentes e frios aumenta a pureza do PEL, mas ao custo de diminuir ligeiramente o rendimento, como ELP residual é perdida durante cada ronda ITC em tubos de centrífuga e em pontas de pipeta. Purificação bem sucedida de ELPs e péptido ou proteína fusões ELP é confirmada por SDS-PAGE. Pequenos aliquotas tomadas ao longo do processo de purificação demonstram a purificação progressiva de ELP do E. lisado de E. coli. ELP é sobre-expresso na E. bruto lisado e contaminantes coli diminuir sagacidadeh sucessivas rondas de ITC (Figura 3). Purificada ELP aparece como uma única banda perto do MW teórico previsto. O ELP T t é caracterizada por turbidimetria a temperatura programada. O perfil de turvação de um homopolímero ELP exibe um único aumento acentuado na OD a 350 nm (cerca de 2,0 unidades acima do valor inicial de uma concentração de 25 uM ELP) (Figura 4A). Arrefecimento varreduras turbidez confirmar a natureza reversível da transição ELP como o OD retorna à linha de base, quando a temperatura é reduzida abaixo da T t (Figura 4B). ELP copolímeros dibloco exibem um perfil de turvação mais complexo, em relação ao homopolímero ELPs. O OD primeiro tipicamente aumenta a 0,1-0,5 unidades acima do valor inicial, após o que os OD aumenta abruptamente para 2,0 unidades acima do valor basal (Figura 5A). DLS medições fornecem informações sobre a mudança de R H, com respeito à temperatura, co<html> rroborating as informações obtidas a partir do perfil de turbidez (Figura 5B). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1. Preliminar purificação ELP. Após 24 horas de expressão, E. coli As células são recolhidas por centrifugação e ressuspensas em PBS. A) As células são lisadas por ultra-sons, que é acompanhado por uma alteração subtil de cor de tal modo que o lisado escurece após sonicação. B) Após a adição de PEI a condensar os contaminantes de ADN, o lisado é centrifugada e um grande pellet de detritos insolúveis são separados do ELP solúvel no sobrenadante. C) A transição ELP é induzida com a adição de calor e / ou sal e as formas de centrifugação a pelota ELP translúcida.ank &quot;&gt; Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig2highres.jpg" width="600" /> Ciclismo transição Figura 2. Inversa. ELP é purificado por meio de seu comportamento TCIS de contaminantes ambos solúveis e insolúveis. Começando com o lisado ELP-rico (1) a transição ELP é induzida com a adição de calor e / ou sal e do ELP é separado por centrifugação (spin quente) (2). O sedimento ELP é retido (3a), enquanto que o sobrenadante contendo os contaminantes solúveis é descartada (3b). O ELP é ressuspenso em tampão frio (4) e novamente centrifugado a 4 ° C (de centrifugação a frio) (5). O sedimento que contém os contaminantes insolúveis é descartada (6a), enquanto o sobrenadante contendo ELP solúvel é mantido (6b). Ciclos alternados de rotações quentes e frias são repetidos até que a pureza desejada é alcançada, tal como determinado comSDS-PAGE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig3highres.jpg" width="600" /> A análise de SDS-PAGE a Figura 3. De produtos de purificação de ELP. Purificação bem sucedida de uma ELP é confirmada por SDS-PAGE. Superexpressos ELP é evidente na E. bruto lisado de E. coli após ultra-sons (2). Após a adição de PEI e centrifugação a ELP solúvel é, em grande parte mantida no sobrenadante (3), apesar de alguns ELP é perdida no sedimento descartado de contaminantes insolúveis (4). O sobrenadante após a primeira rodada quente contém níveis significativos de contaminantes solúveis (5). O sobrenadante após a primeira rodada fria indica uma boa separação dos ELP de contaminantes insolúveis (6). Ciclos adicionais de quente (7) e cidade gira (8) remover os contaminantes solúveis e insolúveis residuais, respectivamente, até (9) e de rotação (10) a frio quente sobrenadantes finais não apresentam bandas de contaminantes estranhos, confirmando a pureza satisfatória do produto ELP. Este homopolymer ELP, com uma seqüência de SKGPG-(VGVPG) 80-Y, tem um peso molecular esperado de 33,37 kDa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4. Caracterização de ELP homopolímero por turbidimetria a temperatura programada. ELP A T T é determinada pela monitorização da densidade óptica a 350 nm, enquanto que o aumento da temperatura a uma taxa de 1 ° C / min. UM) homopolímeros ELP exibem um único aumento acentuado na OD que defines seu T t a uma dada concentração. B) A reversibilidade da transição ELP é verificada por meio de monitorização da densidade óptica a 350 nm de uma solução a 25 μ M, enquanto a diminuição da temperatura, em que a reversibilidade é confirmada pelo retorno do OD de linha de base. Este homopolymer ELP tem a seqüência SKGPG-(VGVPG) 80-Y. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig5highres.jpg" width="600" /> Figura 5. Caracterização do ELP copolímero diblock por turbidimetria a temperatura programada e espalhamento dinâmico de luz. ELPs que se submetem a nano-escala de auto-montagem, como ELP copolímeros diblocos que se juntam em micelas esféricas, apresentam perfis de turbidez mais complexos. <strong&gt; A) Moderado aumento OD indica a transição de unimers de micelas, antes de um rápido aumento na OD que indica agregação completa do PEL em agregados escala mícron medições. DLS B) confirmam o comportamento inferida a partir do perfil para uma turbidez solução a 25 mM, fornecendo informações sobre a mudança de R H em relação à temperatura. Aqui o Unimer ELP tem um R H ~ 8 nm e da micela tem um R H ~ 25 nm. Este copolímero diblock ELP tem a seqüência GCGWPG-(VGVPG) 60 - (AGVPGGGVPG) 30 PGGS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Polipeptídeos Elastina-like são biopolímeros de estímulo-responsivo com aplicações que vão desde a purificação da proteína recombinante para a entrega da droga. Este protocolo descreve a purificação e caracterização de polipeptídeos elastina semelhantes e suas fusões de péptido ou proteína a partir de Escherichia coli utilizando o seu comportamento crítico de transição de fase inferior temperatura da solução como uma alternativa simples, a cromatografia.

A purificação cromatográfica do não-polipéptidos recombinantes Elastina semelhantes e suas fusões com Peptídeos e Proteínas de<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

non-chromatographic-purification-recombinant-elastin-like

Research

JoVE Journal

Biology

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

21.5K visualizações.  Duke University.  Polipeptídeos Elastina-like são biopolímeros de estímulo-responsivo com aplicações que vão desde a purificação da proteína recombinante para a entrega da droga. Este protocolo descreve a purificação e caracterização de polipeptídeos elastina semelhantes e suas fusões de péptido ou proteína a partir de Escherichia coli utilizando o seu comportamento crítico de transição de fase inferior temperatura da solução como uma alternativa simples, a...

Vídeo: Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biologia

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

High Throughput Screening da atividade endoglucanase de fungos em Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificação de complexos de proteínas em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Utilizando a purificação por afinidade sequencial Peptide em combinação com espectrometria de massa tandem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

De alto rendimento de purificação de afinidade com tag Proteínas Recombinantes

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

Protocolo Rápido para Preparação de electrocompetentes<em&gt; Escherichia coli</em&gt; E<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

High Throughput Screening expressão quantitativa e Purificação Aplicada à recombinante Dissulfeto ricos em proteínas veneno produzido em<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

As multifacetadas benefícios da proteína Co-expressão em<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein belonging to the prion family. A chromatographic method for the purification of (His)6-tagged recombinant Shadoo expressed as inclusion bodies is described. The inclusion bodies are solubilized in 8 M urea and bound to a Ni2+-charged column to perform ion affinity chromatography. Bound proteins are eluted by a gradient of imidazole. Fractions containing Shadoo protein are subjected to size exclusion chromatography to obtain a highly purified protein. In the final step purified Shadoo is desalted to remove salts, urea and imidazole. Recombinant Shadoo protein is an important reagent for biophysical and biochemical studies of protein conformation disorders occurring in prion diseases. Many reports demonstrated that prion neurodegenerative diseases originate from the deposition of stable, ordered amyloid fibrils. Sample protocols describing how to fibrillate Shadoo into amyloid fibrils at acidic and neutral/basic pHs are presented. The methods on how to produce and fibrillate Shadoo can facilitate research in laboratories working on prion diseases, since it allows for production of large amounts of protein in a rapid and low cost manner.

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of His6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

A two-step chromatographic method is described for the purification of recombinant Shadoo protein expressed as inclusion bodies in Escherichia coli, as well as a protocol to fibrillate purified Shadoo into amyloid structures.

Purificação e redobramento de amilóide fibrilas de (seu)<sub&gt; 6</sub&gt; tagged proteína recombinante Shadoo Expresso como Corpos de Inclusão em<em&gt; E. coli</em

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules derived from the parental cells. EVs function as intra- and inter-species communication vectors while also contributing to the interaction between bacteria and host organisms in the context of infection and colonization. Given the multitude of functions attributed to EVs in health and disease, there is a growing interest in isolating EVs for in vitro and in vivo studies. It was hypothesized that the separation of EVs based on physical properties, namely size, would facilitate the isolation of vesicles from diverse bacterial cultures. 
The isolation workflow consists of centrifugation, filtration, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography (SEC) for the isolation of EVs from bacterial cultures. A pump-driven tangential flow filtration (TFF) step was incorporated to enhance scalability, enabling the isolation of material from liters of starting cell culture. Escherichia coli was used as a model system expressing EV-associated nanoluciferase and non-EV-associated mCherry as reporter proteins. The nanoluciferase was targeted to the EVs by fusing its N-terminus with cytolysin A. Early chromatography fractions containing 20-100 nm EVs with associated cytolysin A - nanoLuc were distinct from the later fractions containing the free proteins. The presence of EV-associated nanoluciferase was confirmed by immunogold labeling and transmission electron microscopy. This EV isolation workflow is applicable to other human gut-associated gram-negative and gram-positive bacterial species. In conclusion, combining centrifugation, filtration, ultrafiltration/TFF, and SEC enables scalable isolation of EVs from diverse bacterial species. Employing a standardized isolation workflow will facilitate comparative studies of microbial EVs across species.

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Bacteria secrete nanometer-sized extracellular vesicles (EVs) carrying bioactive biological molecules. EV research focuses on understanding their biogenesis, role in microbe-microbe and host-microbe interactions and disease, as well as their potential therapeutic applications. A workflow for scalable isolation of EVs from various bacteria is presented to facilitate standardization of EV research.

Isolamento escalável e purificação de vesículas extracelulares de Escherichia coli e outras bactérias

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...