The opinions or assertions contained herein are the private views of the authors and are not to be construed as official or as reflecting the views of the Department of the Army or the Department of Defense. This research was performed while the authors Alberto Mu&#241;iz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene and Jae-Hyek Choi held a National Research Council Postdoctoral Research Associateship at the USAISR. This work was supported by U.S. Army Clinical Rehabilitative Medicine Research Program (CRMRP) and Military Operational Medicine Research Program (MOMRP).

1. Preparação de Culturas Reagentes e placas de cultura <ol><li> Prepare meio de cultura livre de células-tronco-alimentador por adição de 100 ml de suplemento de 5x isento de soro a 400 ml de meio basal de células estaminais. O meio é estável a 4 ° C durante até 2 semanas e a -20 ° C durante 6 meses. </li><li> Adicionar 10 mM solução de associado-ró, coiled-coil contendo proteína quinase (Rock) inibidor para comercialmente disponível corpo embryoid (EB) médio de formação (Y-27362). </li><li> Prepare meio de diferenciação pela adição de 0,1 mM de β-mercaptoetanol, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, 2 mM de L-glutamina, 10% de substituição de soro nocaute (KSR) e 10 ug / ml de gentamicina a Modified Eagle Médium / Nutrient Mixture Dulbecco F-12 (DMEM / F12). </li><li> Prepare meio iPS-RPE por adição de suplemento 1x N1, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, 250 ug / ml de taurina, sal de sódio de 13 ng / ml triiodo-L-tironina, 20 ng / ml de hidrocortisona, de 5 ug / ml de gentamicina e 15% de soro bovino fetal (FBS) &lt;sup&gt; 21 de Meio Essencial Mínimo de Eagle (MEM). Ajustar o pH para 7,4. </li><li> Preparar a solução estoque de sal de sódio triiodo-L-thyronine. Dissolve-se 1 mg de sal de sódio triiodo-L-tironina em 1 N de hidróxido de sódio por agitação suave. Adicionar 49 ml de MEM para fazer 50 ml de 20 ug / ml de sal de sódio triiodo-L-tironina. Preparar alíquotas e congelar a -20 ° C até ser necessário. Use volume adequado para atingir a concentração desejada em meio de cultura final. </li><li> Preparar a solução de estoque de hidrocortisona. Solubiliza-se 1 mg de hidrocortisona em 1 ml de etanol a 100% por agitação suave. Adicionar 19 ml de MEM para fazer 20 ml de 50 ug / ml de solução de estoque de hidrocortisona. Alíquotas e congelamento a -20 ° C até ser necessário. Use volume apropriado para atingir a concentração desejada no meio de cultura final. </li><li> Preparar uma solução de trabalho de dispase a 1 mg / ml em DMEM / F12. </li><li> Preparação das placas de matriz revestido <ol><li> Prepare matriz proteína extraída da Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) moucélulas de sarcoma si em DMEM / F12 a 0,08 mg / ml. Bata de cada poço de uma placa de 6 poços com 1 ml da solução de matriz. Incubar as placas revestidas à temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Após a incubação de 1 hora, aspirar o excesso de DMEM / F12. Adicionar 0,5 ml de meio de cultura de células estaminais livre de alimentador para evitar a secagem dos poços. As placas de matriz revestida está pronto para uso. </li></ol></li><li> Para preparar as placas de micropoços, por lavagem de cada poço com 2 ml de DMEM / F12. Remover DMEM / F12 e adicionar 0,5 ml de meio de formação de EB suplementado com inibidor da rocha a cada poço. Centrifugar a placa a 2000 xg durante 5 minutos para remover quaisquer bolhas de ar. </li><li> Preparar tampão de coloração de FACS através da mistura de 2% de FBS e 0,09% de azida de sódio em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Ajustar o tampão de pH 7,4. </li><li> Preparar a solução de neutralização de tripsina por adição de 10% FBS para DMEM / F12. </li></ol> 2. iPS Cultura <ol><li> Antes da semeadura de células iPS, warm-tronco meio de cultura de células sem alimentador de até 37 ° C, e têm a matrix placas revestidas pronto. </li><li> Rapidamente descongelar as células iPS IMR90-1 em um banho de água a 37 ° C. Em seguida, retire o crio-frasco do banho de água e limpe o frasco com etanol 70%. Transferem-se as células para um tubo de 15 ml com uma pipeta de 2 ml para minimizar a quebra de aglomerados de células. </li><li> Adicionar 5 ml de meio de cultura de células-tronco quente livre de alimentador para as células, gota a gota e misture delicadamente. Centrifuga-se as células a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente e remover o sobrenadante. </li><li> Ressuspender cuidadosamente os aglomerados de células em 2 ml de meio de cultura de células-tronco sem alimentador e semear os aglomerados de células nos poços de placa revestida com matriz. Colocar a placa numa incubadora a 37 ° C com 5% de CO2, 95% de humidade. </li><li> Alterar o meio de cultura de células iPS diária. Observe colônias indiferenciadas cinco a sete dias após a semeadura. Verifique a existência de colônias indiferenciadas que estão prontos para passagem (colônias com um centro denso) sob um microscópio de luz. </li></ol> 3. Passaging de iPS Cells <ol><li> A passagem das células iPS antes de começar, aqueça a solução dispase, DMEM / F12 e haste meio de cultura de células sem alimentador de 37 ° C em banho-maria. </li><li> Antes passaging células iPS, remova todas as áreas de diferenciação por raspagem da área e aspirar o meio. Lavar cuidadosamente as células iPS com 2 ml de DMEM / F12. </li><li> Adicionar 1 ml de 1 mg / ml de dispase a cada poço e incubar a 37 ° C durante 7 min. Aspirar o dispase e lavar cuidadosamente as colônias de células com 2 ml de DMEM / F12 duas vezes. Depois de enxaguar, adicionar 2 ml de meio de cultura livre de células-tronco-alimentador para cada poço. </li><li> Usando uma pipeta de 5 ml raspe as colônias da placa para formar aglomerados de células. Transfira os aglomerados de células isoladas para um tubo cônico de 15 ml. Adicionar haste meio de cultura de células sem alimentador suficiente para semear a próxima passagem de células. </li></ol> 4. Geração da EBS Usando Microplacas <ol><li> Preparação de uma suspensão de células isoladas de células iPS <ol><li> Remover o medium a partir de células iPS e lave as células iPS com 2 ml de DMEM / F12. Adicionar 750 ul de Accutase para células iPS em cada poço da placa de 6 poços. Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO2 para permitir que as células a separar da placa (cerca de 5-10 minutos). </li><li> Usar uma pipeta para dissociar suavemente as células restantes e a separar quaisquer células restantes na superfície da placa. Transferem-se as células para um tubo cónico de 50 ml. Lavar a placa com 5 ml de DMEM / F12 e combinar o enxaguado DMEM / F12 com as células no tubo cónico. Passar a suspensão de células através de um coador de células de 40 mm para remover quaisquer possíveis aglomerados de células residuais. </li><li> Centrifuga-se as células a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente para remover a Accutase. Ressuspender o sedimento de células em meio de formação de EB modo que a concentração de células é de cerca de 0,5-1,0 x 10 7 células / ml. </li><li> Determinar o número de células viáveis ​​por contagem das células com azul de tripano e um hemocitómetro. </li></ol></li><li> Adjusting densidade celular em micropoços para formar EBs controlada de tamanho <ol><li> Ajustar o número de células para cada poço da placa de micropoços para gerar os desejados tamanhos EB. Adicionar células aos micropoços das placas preparadas no passo 1.9, distribuir uniformemente as células por suavemente pipetando as células várias vezes. NOTA: Número de células por poço requeridas = o número desejado de células por EB x número de micropoços por poço. </li><li> Ajustar a forma formação EB suplementado com inibidor de rocha nos poços para um volume final de 2,0 ml. Redistribuir as células com cuidado pipetando cada poço. Centrifugar as placas de micropoços a 100 xg durante 3 min. Colocar as placas em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2 e 95% de humidade durante 24 horas. </li></ol></li><li> EBs colheita das placas de micropoços <ol><li> Colheita de EBs micropoços por meio de pipetagem no poço cima e para baixo com uma micropipeta 1 ml para remover a maior parte dos CEs. Passar a suspensão através de uma célula EB 40 um invertidafiltro no topo de um tubo cónico de 50 ml para remover as células individuais. </li><li> Lava-se a placa de micropoços 5 vezes com 1 ml de DMEM / F12 para remover todos os CEs. Recolha lavagens e passar por cima do filtro de células invertido. Vire filtro de células do lado direito para cima para um novo tubo de 50 ml. Recolha as EBs por lavagem com meio formação EB. Contagem EBS para determinar o rendimento. </li></ol></li></ol> 5. chapeamento EBs e Iniciando Diferenciação <ol><li> Placa os CEs em matriz de proteína revestidas placas de seis poços (como no passo 1.8.1), a uma densidade de &lt;1000 EB / poço em meio de formação de EB mais 10 uM de inibidor da rocha. Incubar as CEs a 37 ° C com 5% de CO 2 e 95% de humidade durante 24 horas. </li><li> 24 horas após a EB chapeamento, substitua-o por meio de diferenciação para iniciar a diferenciação. Mudar metade do meio de diferenciação em dias alternados até as células são recolhidas para análise posterior. </li><li> Recolher amostras no dia 6, 17, 29 e 60 para realizar RT-PCR, immunocytochemistry e FACS para validar a expressão de genes e proteínas do EPR característicos. </li></ol> 6. Extração de RNA e PCR <ol><li> Extrai-se ARN a partir de amostras EB acordo com as instruções fornecidas no kit disponível comercialmente. Determinar a concentração de RNA usando um espectrofotómetro. </li><li> Realizar a transcrição reversa em 100 ng de ARN total de acordo com o ARN em ADNc comercialmente disponível kit de transcrição reversa. </li><li> Executar PCR com 10 ng de ADNc, utilizando os seguintes iniciadores (Tabela 1), a uma concentração de 10 pmol / 10 ng de cDNA. Definir a PCR como se segue: desnaturar o ADN, a 95 ° C durante 5 min, com 35 ciclos de amplificação a 95 ° C durante 15 seg, 60 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 1 min, seguido de um ciclo final de 72 ° C durante 10 min. Executar o produto de PCR num gel de agarose 1%. </li></ol> 7. Immunocytochemistry <ol><li> Lavar as CEs com PBS duas vezes à temperatura ambiente. Fixar as EBs na RT em 4% paraformaldehyde durante 10 min. Lavar uma vez com PBS à temperatura ambiente. Armazenar as amostras em PBS a 4 ° C até ser utilizado para a coloração. </li><li> No dia da coloração, tratar as células fixas com fixação e permeabilização reagentes. Incubar as amostras com a solução (10% de soro de cabra em solução de permeabilização) durante 1 h à TA bloqueio. </li><li> Realizar imunoquímica em 10% de soro de cabra em solução de permeabilização utilizando os seguintes anticorpos primários nas diluições indicadas: anti-Pax6 (01:10), anti-RX (1: 200), anti-MITF (01:30), e anti- ZO1 (1: 100). Incubar as amostras com anticorpos O / N correspondente a 4 ° C. </li><li> No dia seguinte, remover o anticorpo primário a partir das células e lavar as amostras três vezes com PBS. Incubar as amostras com anticorpos secundários fluoróforos, durante 1 h à TA. </li><li> Remover o anticorpo secundário a partir das células e lavar as amostras três vezes em PBS. Montar a tampa desliza sobre lâminas de vidro com meio de montagem contendo DAPI e permitir que as amostras para definir O / N em câmara escura.Usar um microscópio de fluorescência para visualizar a coloração. </li></ol> 8. Coloração para análise FACS <ol><li> Lavar as CEs cultivadas em PBS duas vezes. Incubar as CEs com 0,5 ml de 0,25% de tripsina, durante 5-10 minutos para se obter uma suspensão de célula única. Neutraliza-se a tripsina com uma solução de tripsina neutralizante (1 ml / poço). </li><li> Transferir a suspensão de células individuais para um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 600 xg durante 10 min. </li><li> Descartar o sobrenadante e adicionar 10 ml de DMEM / F12 para as células no tubo. Inverter cuidadosamente para misturar as células. Centrifuga-se a 600 x g. Após centrifugação, descartar o sobrenadante e ressuspender as células em tampão de coloração de FACS. </li><li> Contar o número total de células. Centrifugar a 600 xg por 10 min. Após centrifugação descarte sobrenadante. Fixar as células imediatamente por adição de 0,5 ml de paraformaldeído a 4%. Misture bem em vórtice suave. Incubar as células a 4 ° C durante 20 min. </li><li> Centrifugar a 600 xg durante 10 min e remover osobrenadante. Vortex suavemente para perturbar o sedimento celular. Permeabilizar as células por adição de 1 ml de solução de permeabilização refrigeradas. Vortex suavemente para misturar e incubar em gelo durante 30 min. </li><li> Centrifugar a 600 xg durante 10 min e remover o sobrenadante. Adicionar 3 ml de tampão de coloração de FACS e ressuspender. Repita este passo para mais uma vez. Ressuspender as células em tampão de coloração de FACS a uma concentração final de 5 x 10 6 células / ml. </li><li> Transferir 100 ul da suspensão de células (0,5 x 10 6 células) para cada um de microcentrífuga tubos e adicionar o volume recomendado de anticorpo primário. Para Pax6, adicionam-se 5 ul de PE anti-Pax6 em 100 ul de suspensão de células. Para MITF, adicionam-se 5 ul de anti-MITF em 100 ul de suspensão de células. </li><li> Misturar e incubar à temperatura ambiente durante 60 min. Adicionar 3 ml de tampão de coloração de FACS. Misturar e centrifugar a 600 xg durante 10 min. Remover o sobrenadante e repetir 8,16 por duas vezes adicionais. </li><li> Para a coloração de MITF, incubar as células na Antibo secundáriody, de cabra anti-rato Alexa Fluor 488, a uma diluição de 1: 2000 durante 1 hora a 4 ° C. Para a coloração Pax6, evitar este passo. </li><li> Lavam-se as células com 5 ml de tampão de coloração de FACS e centrifugar a 600 xg durante 10 min. Repetir o processo por mais duas vezes. </li><li> Ressuspender as células em 500 ul de tampão de coloração de FACS e vórtice suavemente para perturbar o sedimento celular. As amostras estão prontos para análise de citometria de fluxo. </li></ol> 9. iPS-RPE Isolamento e Cultura <ol><li> No dia 29, cuidadosamente cortadas à volta das colónias pigmentadas seleccionados a partir da placa de cultura utilizando uma pipeta de ponta de 200 ul. Transfira as colônias flutuantes para um tubo cônico de 15 ml. Centrifuga-se as colónias a 600 xg durante 10 min à temperatura ambiente e remover o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as colónias de células em 10 ml de DMEM / F12 e centrifugar a 600 xg durante 10 min. Remover o sobrenadante. </li><li> Prepara-se uma suspensão de células individuais por incubação das colónias com 2 ml de tripsina a 0,25% a 37 ° C durante 7-10 min. Gentilmente vortex a suspensão de células de dissociar as colônias. </li><li> Neutralizar a tripsina, adicionando 2 ml de meio iPS-RPE. Centrifugar a 600 xg durante 10 min e desprezar o sobrenadante. Ressuspender as células individuais em 2 ml de meio iPS-RPE. Transferem-se as células em uma matriz proteica revestido placa de 6 poços e lugar numa incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2 e 95% de humidade. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Para realizar o pleno potencial das células-tronco pluripotentes para terapia celular, é necessário regulamentar a sua diferenciação de uma forma consistente e reproduzível. Este relatório descreve os protocolos para formar EBs controlada porte usando tecnologia de microplaca, iniciar a diferenciação em direção RPE e identificar marcadores de proteínas e genes de RPE. Para sincronizar a diferenciação in vitro, tamanhos homogêneos da EBS foram formados por um número conhecido de células iPS cent...

As células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) são um tipo de célula-tronco pluripotentes derivadas através da reprogramação de células adultas com fatores extrínsecos 1. Em contraste, as células estaminais embrionárias (CES), um outro tipo de célula de tronco pluripotente, são gerados a partir da massa celular interna do blastocisto 2-3. Apesar de suas origens diferentes, as células iPS e CES são comparáveis ​​em sua capacidade ilimitada para replicar in vitro e na sua capacidade de se diferenciar em qualquer tipo de célula 4-5. Estas características de células iPS torná-los os candidatos ideais para aplicações em medicina regenerativa personalizado. Os recentes esforços de pesquisa estão focados no desenvolvimento de protocolos de diferenciação robustos para a produção de células adultas especializadas, incluindo epitélio pigmentar da retina (RPE) 6-11. Para potenciais aplicações clínicas de células iPS derivadas, uma diferenciação direcionado para esse tipo específico de célula é essencial. Existem vários métodospublicado pela diferenciação dirigida de ambas as células iPS CES e em RPE que varia muito em sua eficiência 6-7, 12-16. Nós ainda não sabemos muitos dos eventos moleculares que governam o destino de células / tecidos durante o desenvolvimento ou diferenciação. Nos últimos anos, foram feitos esforços para desenvolver o protocolo de diferenciação que pode imitar o desenvolvimento embrionário, tanto quanto possível. Durante a fase de blastocisto, a população não confirmadas de células-tronco estão juntos em um microambiente tridimensional. Assim, várias estratégias foram aplicados para tornar as células CES / iPS reunidos e crescê-las em três dimensões. Estes agregados de células-tronco são chamados de corpos embrióides (EBS). Estudos têm mostrado que a EB diferenciação de células estaminais imitar fase precoce do desenvolvimento do embrião e pode dar origem espontaneamente a endoderme primitiva na sua superfície exterior. Mais tarde, como EB desenvolvimento progride, os fenótipos de células diferenciadas de todas as três linhagens germinais aparecer 17-18. Therefore, o EBS protocolos de diferenciação com base têm atraído muita atenção para a diferenciação in vitro de células ESC / IPS e é um bom candidato para a geração EPR ​​a partir de células-tronco pluripotentes 13. EB pode ser feita usando vários métodos de células ESC / IPS. Inicialmente, foram feitas EBs raspando as colónias aderentes e mantê-las em cultura em suspensão não-aderente. No entanto, esta abordagem produz população heterogénea de EBs que provoca baixa reprodutibilidade. Suspensão de cultura de células de queda e micropoco formação EBs baseado outras técnicas populares para formação EBs que produzem EBs homogêneos de tamanhos definidos que são altamente reprodutível. Além disso, a técnica de micropoços podem produzir grande número de agregados com menos esforço. Diferenciação de células dentro EBS é regulada por um multiplex de pistas morfogénicos do microambiente extracelular e intracelular. Em contraste com a diferenciação em um monformato olayer, o EBS fornecer uma plataforma para montagem complexa de células e sinalização intercelular para ocorrer 17. Curiosamente, foi observado o número de células estaminais pluripotentes usados ​​para fazer EBs individuais para influenciar o destino das células. Por exemplo, em um estudo diferenciação hematopoiética da CES humanos, observou-se que 500 células EB promoveu a diferenciação no sentido de linhagem mielóide enquanto que 1.000 células EB empurrado na direcção da linhagem eritróide 20. Em outro estudo, a EBS menores favoreceu diferenciação endoderme Considerando EB maiores promovidas no sentido de neuro-ectoderma diferenciação 11, 17. Estes estudos anteriores sugerem fortemente que o número de células ESC / IPS usados ​​para fazer EBs individuais afetam as EBs diferenciação com base para quaisquer tipos de células. No entanto, a nosso conhecimento, não há estudos atuais que elucidaram o impacto do tamanho EBs em sua propensão de se diferenciar em direção RPE. O objetivo deste estudo é caracterizar a influência deTamanho EB em induzida células-tronco pluripotentes (IPS) - epitélio pigmentar da retina (iPS-RPE) diferenciação e para identificar o número célula ideal para fazer as EBs para a diferenciação dirigida para RPE linhagem.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="722">
	<tbody>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:239px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:183px;">Company</td>
			<td style="width:140px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:161px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mTeSR1 media + 5X supplement</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y-27632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">M-7154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Non essential amino acids</td>
			<td style="width:183px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>SH30853.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Knockout serum replacement</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Gentamicin&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">MEM media</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">10370-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">N1 supplement</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">N-6530-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Taurine</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">T-8691-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">H0888-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:183px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>SH3008803HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triiodo-l-thyronine sodium&#160; salt</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Dispase</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td>17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Matrigel</td>
			<td style="width:183px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:140px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:183px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Aggrewell 400 plate</td>
			<td style="width:183px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td>27940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">AggreWell medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Accutase</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Mouse Anti-PAX6 antibody</td>
			<td colspan="2">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Rabbit Anti- RX antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab23340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Mouse&#160; Anti-MITF antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MS-772-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Rabbit Anti-ZO-1 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>40-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">RNeasy plus mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">PCR master mix</td>
			<td>promega</td>
			<td>M7502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">High capacity RNA to c DNA kit</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td>4387406</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deriving retinal pigment epithelium (rpe) from induced pluripotent stem (ips) cells by different sizes of embryoid bodies

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.

Neste experimento, as células iPS foram cultivadas e diferenciadas na linhagem RPE da EBS. EB de tamanhos controladas foram formados utilizando placas de micropoços. Como visto na Figura 1 formação EB foi homogénea nas placas de microcavidades. Estes EB foram então recolhidas e colocadas em placas de 6 poços (Figura 2). EPR podem ser identificados pela sua morfologia hexagonal clássica, pigmentação, e a expressão de marcadores EPR. Após 12 semana...

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Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

O objetivo deste relato é descrever os protocolos para derivar o epitélio retinal pigmento (RPE) a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) células usando diferentes tamanhos de corpos embrióides.

Derivando Retinal Pigment Epithelium (RPE) de pluripotentes induzidas (iPS) Stem Cells por diferentes tamanhos de corpos embrióides

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

deriving-retinal-pigment-epithelium-rpe-from-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

10.5K visualizações.  U.S. Army Institute of Surgical Research.  O objetivo deste relato é descrever os protocolos para derivar o epitélio retinal pigmento (RPE) a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) células usando diferentes tamanhos de corpos embrióides. 

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Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

Derivação eficiente do epitélio pigmentar da retina células de células-tronco

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Biologia do Desenvolvimento

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

Análise do induzida por ácido retinóico Neural diferenciação de células estaminais embrionárias rato em corpos embrióides Dois e tridimensionais

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

Condrócitos diferenciadores de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos derivadas de sangue periférico

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. Currently, efforts are being made to regenerate damaged cartilage with ex vivo expanded chondrocytes or bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs). However, the restricted viability and instability of these cells limit their application in cartilage reconstruction. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have received scientific attention as a new alternative for regenerative applications. With unlimited self-renewal ability and multipotency, hiPSCs have been highlighted as a new replacement cell source for cartilage repair. However, obtaining a high quantity of high-quality chondrogenic pellets is a major challenge to their clinical application. In this study, we used embryoid body (EB)-derived outgrowth cells for chondrogenic differentiation. Successful chondrogenesis was confirmed by PCR and staining with alcian blue, toluidine blue, and antibodies against collagen types I and II (COL1A1 and COL2A1, respectively). We provide a detailed method for the differentiation of cord blood mononuclear cell-derived iPSCs (CBMC-hiPSCs) into chondrogenic pellets.

Here, we propose a protocol for chondrogenic differentiation from cord blood mononuclear cell-derived human induced pluripotent stem cells.

Formação de grânulos condrogénicos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por sangue do cordão umbilical

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Rápida, dirigida a diferenciação de células epiteliais de pigmento Retinal de células-tronco humanas embrionárias ou induzida de Pluripotent

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms of retinitis pigmentosa (RP) and age-related macular degeneration (AMD). Cell therapy is one of the most promising therapeutic strategies proposed to cure these diseases, with already encouraging preliminary results in humans. However, the method of preparation of the graft has a significant impact on its functional outcomes in vivo. Indeed, RPE cells grafted as a cell suspension are less functional than the same cells transplanted as a retinal tissue. Herein, we describe a simple and reproducible method to engineer RPE tissue and its preparation for an in vivo implantation. RPE cells derived from human pluripotent stem cells are seeded on a biological support, the human amniotic membrane (hAM). Compared to artificial scaffolds, this support has the advantage of having a basement membrane that is close to the Bruch&#39;s membrane where endogenous RPE cells are attached. However, its manipulation is not easy, and we developed several strategies for its proper culturing and preparation for grafting in vivo.

We describe a method to engineer a retinal tissue composed of retinal pigment epithelial cells derived from human pluripotent stem cells cultured on top of human amniotic membranes and its preparation for grafting in animal models.

Engenharia de tecido de epitélio do pigmento da retina transplante-apropriado derivado de células estaminais embrionárias humanas

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent epiblast cells by orchestrated exposures to cytokines, including bone morphogenetic protein 4 (Bmp4). In human embryos, the earliest PGCs have been identified on the endodermal wall of yolk sac around the end of the 3rd week of gestation, but little is known about the process of human PGC specification and their early development. To circumvent the technical and ethical barriers of studying human embryonic PGCs, surrogate cell culture models have been recently generated from pluripotent stem cells. Here, we describe a 13-day protocol for robust production of human PGC-Like Cells (hPGCLCs). Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) maintained in the primed pluripotency state are incubated in the 4i na&#239;ve reprogramming medium for 48 hours, dissociated to single cells, and packed into microwells. Prolonged maintenance of hiPSCs in the na&#239;ve pluripotency state causes significant chromosomal aberrations and should be avoided. hiPSCs in the microwells are maintained for an additional 24 hours in the 4i medium to form embryoid bodies (EBs), which are then cultured in low-adherence plasticware under a rocking condition in the hPGCLC induction medium containing a high concentration of recombinant human BMP4. EBs are further cultured for up to 8 days in the rocking, non-adherent condition to obtain maximum yields of hPGCLCs. By immunohistochemistry, hPGCLCs are readily detected as cells strongly expressing OCT4 in almost all EBs exclusively on their surface. When EBs are enzymatically dissociated and subjected to FACS enrichment, hPGCLCs can be collected as CD38+ cells with up to 40-45% yield.

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of both sperm and eggs. Human embryonic PGCs are specified from pluripotent epiblast cells through interactions of cytokines. Here, we describe a 13-day protocol of inducing human cells transcriptomally resembling PGCs at the surface of embryoid bodies from primed-pluripotency induced pluripotent stem cells.

Geração de células humanas de células germinativas, como Primordial na superfície dos órgãos do Embryoid de aprontado-pluripotência induzida por células estaminais pluripotentes

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

Geração de organoides pele 3D do cordão hemoderivados induzida por células-tronco pluripotentes

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

Na geração de Vitro do Somite derivados de humanos induzida por células tronco pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous transplants to treat hematological and malignant disorders. Hemogenic endothelium (HE) is an amenable platform to produce functional HSPCs by transcription factors or to induce lymphocytes in a robust manner. However, current methods to derive HE are either costly or variable in yield. In this protocol, we established a cost-effective and precise method to derive HE within 4 days in a feeder- and xeno-free defined condition. The resultant HE underwent an endothelial-to-hematopoietic transition and produced CD34+CD45+ clonogenic hematopoietic progenitors. The potential capacity of our platform for generating functional HSPCs will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Here, we present a protocol to precisely form hemogenic endothelium from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free condition. This method will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Diferenciação do endotélio hemogênico de células-tronco pluripotentes humanas em um alimentador-e condição definida livre de Xeno

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...