CRM is a Damon Runyon-Genentech Clinical Investigator. This work was supported, in part, by grants to CRM from the Damon Runyon Cancer Research Foundation (CI-45-09), Department of Defense (W81XWH-09-2-0042), and University of North Carolina University Cancer Research Fund (UCRF). The authors wish to thank Daniel Roth for mouse husbandry assistance. The authors also wish to thank Hannah Chae, Carter McCormick, Demi Canoutas, Stephanie Gillette, and Susannah Krom for tissue culture and immunofluorescence assistance.

The authors have nothing to disclose.

Os passos mais críticos para assegurar a colheita e a cultura de astrócitos do córtex são 1) adequada para excisar o córtex sem tomar tecido abaixo do corpo caloso, 2) para remover as meninges, 3) para dissociar completamente as células, e 4) para o enriquecimento para a GFAP + astrócitos. Embora utilizando mecânica (agitação), e genética (restrição de recombinação genética com um vector Ad5GFAPCre ou utilização de um transgene transformadora dominante (TgGZT 121) sob o c...

Astrocitomas são o tumor cerebral primário mais comum e glioblastoma (GBM), a IV astrocitoma grau, é o subtipo mais comum e agressivo, com uma sobrevida média de 12-15 meses 1,2. Invasão de astrocitomas difusos, particularmente GBM, opõe-se a ressecção cirúrgica completa, limita a eficácia de terapias adjuvantes, e inevitavelmente leva a recorrência pós-tratamento 3. Inicialmente, os pacientes apresentam, quer com de novo (primário) GBM ou com astrocitoma grau menor que inevitavelmente progride para GBM (secundário) 4. GBM é genomicamente heterogêneo e caracterizado por mutações que se excluem mutuamente e que co-ocorrem em genes que governam três principais vias de sinalização: o G 1 / S (Rb) checkpoint do ciclo celular, receptor tirosina quinase (RTK), e TP53 vias 5-7. GBM é composta por quatro subtipos do genoma com perfis de expressão distintos que se assemelham a diferentes tipos de células do cérebro, sugerindo que o GBM subtipo é influciada por sua célula de origem 6,8,9. Modelos astrocitoma melhores são necessários para definir o papel de combinações específicas de mutações em determinados tipos de células durante astrocitoma patogênese. Aproveitando esses modelos para o desenvolvimento de drogas mais eficientes pré-clínico, em última instância ajudar a melhorar os resultados dos pacientes. Astrocitoma modelos atuais incluem linhas celulares estabelecidas humanos, paciente derivado xenotransplantes (PDX), astrócitos humanos normais geneticamente modificados e de células-tronco neurais (NSC) e camundongos geneticamente modificados (GEM) 10-14. Nós desenvolvemos uma alternativa, GEM não germinativa (nGEM) modelo 15 utilizando células cerebrais primários - astrócitos corticais e NSC - colhidas GEM abrigando várias combinações de alelos oncogênicos floxed. O objectivo foi o de gerar modelos astrocitoma com células geneticamente definidas que poderia ser fenotipicamente caracterizadas tanto in vitro como in vivo e potencialmente utilizados para o desenvolvimento pré-clínico de drogas em icamundongos mmune-competentes. Linhagens de células humanas estabelecidas são o modelo mais comumente usado de patogênese astrocitoma e resposta à droga in vitro e in vivo. Eles são tecnicamente simples, amplamente disponível, e definiram cinética e tumorigenicity sobre xeno ortotópico em ratos imunodeficientes 10,11,16-18 . Suas desvantagens incluem a incapacidade de gerar linhagens celulares estabelecidas de astrocitomas de baixo grau, limitando estudo apenas para astrocitomas de alto grau; falta de uma célula de origem definido; a presença de anormalidades genômicas complexas, muitas vezes com perfis genômicos que diferem acentuadamente a partir da amostra original do doente; e susceptibilidade à fenotípica e genotípica de deriva durante a cultura de série no soro 11,17,19-22. As conseqüências fenotípicas de mutações oncogênicas individuais em linhas de células humanas estabelecidas GBM pode ser mascarado pela multidão de anomalias que estão realmente presentes, que muitas vezes impede elucdação das conseqüências diretas genótipo-fenótipo. PDX são gerados através da passagem subcutânea de células astrocitoma isolado do paciente em ratos imunodeficientes ou através de sua cultura como esferóides não aderentes em definido, meio sem soro antes da injeção ortotópico em cérebros de ratos imunodeficientes 12,23. PDX manter com maior precisão a paisagem genómico de astrocitomas humanos, mas semelhante às linhas de células humanas estabelecidas, o efeito de mutações oncogénicas fenotípica individuais pode ser mascarado pela sua complexidade genómico 19,24. Para definir as conseqüências fenotípicas de mutações oncogênicas específicas, particularmente em resposta a novas terapias, painéis de linhas de células humanas estabelecidas ou PDX são freqüentemente utilizados para estabelecer correlações genótipo-fenótipo, mostrar generalização, e minimizar a probabilidade de efeitos específicos de linha celular. Enquanto PDX recapitular com precisão as características histopatológicas de astrocitoma humano, including invasão, xenotransplantes ortotópico de linhas de células humanas estabelecidas geralmente não 21,23,25. Além disso, os astrócitos humanos normais e NSC foram geneticamente modificadas com mutações oncogênicas definidas para modelar astrocitoma tumorigênese in vitro e in vivo 13,14,26. Estas células não possuem a complexidade genómico de linhas celulares humanas estabelecidas e PDX e recapitulam precisão histopatologia astrocitoma humano, mas requerem xeno em roedores imunodeficientes in vivo. Como todos os modelos de células humanas exigem hospedeiros roedores imunodeficientes para evitar a rejeição de xenotransplante imunomediada, estes modelos não recapitular as interações tumor-estroma nativas de um sistema singênico e falta de um sistema imunológico intacto, limitando a investigação pré-clínica de alvo-estroma e imunomoduladores terapias 10,11. GEM exame autorização das conseqüências fenotípicas de combinações pré-determinadas de muta oncogênicoções in vivo durante a tumorigênese situ. Considerando GEM não condicional têm mutações em todos os tecidos ao longo do desenvolvimento, GEM condicional têm floxed alelos oncogênicos que permitem a segmentação de mutações, restringindo recombinação Cre-mediada para tipos específicos de células através do uso de celulares promotores específicos do tipo 10,11,15,18. Condicional GEM astrocitoma foram utilizados para elucidar os papéis funcionais de mutações oncogénicas em tipos de células distintos dentro de um cérebro intacta 11. A utilidade em pré-clínico da gliomagênese situ utilizando GEM condicional é limitada por um certo número de factores, incluindo 1) a ausência de uma correlação in vitro, 2) dificuldade em gerar grandes grupos de ratinhos com genótipos complexos, 3) de comprimento de latência para o desenvolvimento de tumor in situ , 4) e estocástica progressão tumoral. Porque in situ tumorigenesis carece de um modelo correspondente in vitro, testes de drogas in vitro não pode ser realizada wmodelos condicionais convencionais om jóia. Em contraste com outros tipos de câncer, os modelos GEM condicionais de astrocitoma raramente são induzidas por simples mutações oncogênicas 11. Assim, esquemas de melhoramento complexas são necessárias para gerar GEM condicional com múltiplas mutações oncogênicas. Além disso, a iniciação astrocitoma ocorre com penetrância variável depois de um longo período de latência nesses modelos, enquanto a progressão para astrocitomas de alto grau geralmente ocorre de forma não-uniforme, estocástica e, finalmente, dá origem a tumores com paisagens genômicas complexas e cinética de crescimento rápido 27, 28. A penetrância variável e natureza estocástica de progressão maligna em modelos GEM condicional exige que os ratos individuais ser rastreada por radiografia para detectar a presença e localização de astrocitomas de alto grau antes de sua inclusão em estudos pré-clínicos de drogas. Tomados em conjunto, estas limitações impedir a geração e ensaios dos grandes grupos de GEM condicional necessário para prtestes de drogas eClinical. O sistema GEM RCAS-tva, que utiliza retrovirais aviária (RCAS) vectores para infectar GEM manipuladas para expressar o receptor viral (TVA) em tipos de células neurais específicos, tem sido extensivamente utilizado para modelar astrocitoma tumorigénese 11. Em contraste com a GEM condicional, este sistema modelo permite a introdução de múltiplas mutações oncogénicas em tipos de células específicas, sem a necessidade de sistemas complexos de reprodução. No entanto, é limitado por uma penetrância variável, o requisito para a divisão activa de células para alcançar a integração virai, e a inserção dos transgenes aleatoriamente no genoma do hospedeiro 29. Modelos não-germinativas GEM (nGEM), que utilizam células colhidas de GEM, estão se tornando cada vez mais importante, porque eles superar muitas das limitações de outros sistemas modelo 15. O papel do tipo de célula e de iniciar as mutações que ocorrem simultaneamente em astrocitoma patogénese são de difícil dissuadirmina usando linhas celulares estabelecidas humanas ou GBM PDX porque são derivados a partir de tumores em fase terminal que se acumularam extensas mutações genéticas em tipos de células não definidas durante o curso da progressão maligna. Em contraste, todos os graus de astrocitomas pode ser modelada utilizando nGEM definido por induzir mutações genéticas dentro tipos de células cerebrais específicas purificadas 11,30. Assim, a influência de mutações genéticas específicas e tipo de células em fenótipos celulares e moleculares pode ser determinada in vitro e in vivo. Semelhante às linhas de células humanas estabelecidas GBM, em testes in vitro inicial de droga usando nGEM pode ser usado para dar prioridade drogas para os ensaios in vivo, utilizando as mesmas células. Tumorigénese in vivo pode ser determinada por aloenxerto células nGEM ortotopicamente nos cérebros de ninhada singeneicos imunocompetentes 30. Estes modelos de aloenxerto ortotópico, pois, permitir testes in vivo, não só de um citotóxico convencionalnd terapias-alvo, mas imunomoduladores e de terapias alvo-estroma também. Finalmente, o papel do microambiente no início e progressão do tumor pode ser determinada por comparação dos resultados entre nGEM e modelos GEM convencionais utilizando as mesmas mutações nos mesmos tipos de células. Nós e outros desenvolveram astrocitoma nGEM usando células primárias - astrócitos, NSC, ou células precursoras de oligodendrócitos (OPC) - colhidas GEM 30-34. A lógica por trás do desenvolvimento de um astrocitoma nGEM era criar um modelo para determinar as conseqüências fenotípicas de mutações oncogênicas em tipos específicos de células que poderiam ser usados ​​para testes de drogas pré-clínicos in vitro e in vivo em animais imunocompetentes. Colhemos astrócitos fenotipicamente WT corticais e NSC de não-Cre expressar, GEM condicional mantida em um&gt; 94% C57 / Bl6 fundo com caminho RB floxed - Rb1 loxP / loxP, ou TgGZT121 - e floxed RTK / RAS / PI3K - Nf1 loxP / loxP, Kras G12D, Pten loxP / loxP - genes em várias combinações 35-39. Nós induzida recombinação genética in vitro utilizando vetores de adenovírus que codificam Cre recombinase. Porque colheitas astrócitos corticais contêm uma mistura de tipos de células, foram utilizados os vectores Ad5GFAPCre ou transgenes oncogénicos dominantes, tais como TgGZT 121 dirigido a partir do promotor GFAP humana, para enriquecer para GFAP + astrócitos corticais nestas culturas. Definimos as consequências fenotípicas de G 1 / S (RB), MAPK, e mutações PI3K em astrócitos corticais e NSC in vitro e in vivo. MAPK e PI3K-ativado via G1 / S-defeituosos astrócitos molecularmente imitou GBM humano proneural e, após a injeção ortotópico, tumores formados em um local pré-definido com cinética de crescimento uniforme, latências curtas, eo histopatológicosal marcas de GBM humano 30. Monitorização longitudinal do crescimento do tumor in vivo ajuda de testes pré-clínicos de drogas através da normalização de coortes de tratamento e análise quantitativa do crescimento do tumor, em resposta ao tratamento com 40. Determinou-se a cinética de crescimento do tumor por imagem de bioluminescência longitudinal de camundongos injetados com luciferase expressando astrócitos corticais. Portanto, os astrócitos corticais e NSC derivados GEM condicional fornecer um sistema modelo tratável para a definição de repercussão funcional de mutações associadas à astrocitoma e um sistema modelo potencial para o desenvolvimento de fármacos pré-clínicos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="784">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:241px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:233px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:241px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td>
			<td style="width:191px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11995065</td>
			<td style="width:233px;">DMEM can also be purchased from other suppliers including GIBCOSigma and Cellgro</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:241px;">Fetal Bovine Serum, Regular</td>
			<td style="width:191px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">35-010-CV</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:241px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:191px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Sharp-Pointed Dissecting Scissors</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-395</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Cartilage Thumb Forceps, Curved</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1631</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Forceps, Fine, 4</td>
			<td style="width:191px;">Miltex</td>
			<td style="width:119px;">17-301</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:241px;">Ethanol (200 proof)</td>
			<td style="width:191px;">Decon Labs</td>
			<td style="width:119px;">2710</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:241px;">Razor Blades</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">55411-050</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid</td>
			<td style="width:191px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14175-095</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:241px;">TrypLE Express (1X), Phenol Red</td>
			<td style="width:191px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12605-010</td>
			<td style="width:233px;">Other Trypsin solutions are also suitable for cortical astrocyte havest and culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:241px;">CULTURE DISH, 60 x 15 mm</td>
			<td style="width:191px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">9380H77</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:241px;">15 ml tubes</td>
			<td style="width:191px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">352096</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:241px;">50 ml tubes</td>
			<td style="width:191px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:241px;">Adenovirus stock</td>
			<td style="width:191px;">Gene Transfer Vector Core, U. Iowa</td>
			<td style="width:119px;">Ad5CMVCre</td>
			<td style="width:233px;">Store in 5 &#181;l aliquots at -80 C. Hazardous.&#160; Use Bsl2 safetyy&#160; precautions</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:241px;">Sodium sulfate (Na2SO4)&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">238597</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:241px;">Potassium sulfate (K2SO4)</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">221325</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:241px;">Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M8266</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:241px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">746495</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:241px;">HEPES potassium salt</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H0527</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:241px;">D-(+)- Glucose</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270&#160;</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:241px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P3532</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:241px;">Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S5881</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:241px;">Papain</td>
			<td style="width:191px;">Worthington</td>
			<td style="width:119px;">LS003127</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:241px;">L-Cysteine-HCl</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C1276</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:241px;">Syringe filter (0.22 &#181;m pore size)</td>
			<td style="width:191px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLGP033NS</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:241px;">Neurocult proliferation kit, mouse</td>
			<td style="width:191px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">5702</td>
			<td style="width:233px;">This kit contains the NeuroCult NSC Basal Medium and NeuroCult NSC supplement needed for NSC culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:241px;">0.2% Heparin solution</td>
			<td style="width:191px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">7980</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:241px;">EGF&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">PMG8041</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:241px;">bFGF&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">PHG0261</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) (10X)</td>
			<td style="width:191px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14185-052</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:241px;">Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M7506</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:241px;">Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S5761</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">E-64</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E3132</td>
			<td style="width:233px;">Make 10 mM stock in DMSO, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:241px;">6-well plates</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-200-83</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:241px;">Cell strainer (40 &#181;m pore size)</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Stem cell dissociation solution</td>
			<td style="width:191px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">5707</td>
			<td style="width:233px;">Alternatively, use gentle enzyme solutions such as Accutase</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:241px;">Methyl cellulose 15 cP</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M7027</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Media 2X</td>
			<td style="width:191px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLM-202-B</td>
			<td style="width:233px;">For making 5% methyl cellulose solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">1.7mL Snap Cap Microcentrifuge Tube</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3620</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Hamilton syringe, 250 &#181;l LT no needle</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-815-92</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:241px;">PB600-1 Antigen Dispenser</td>
			<td style="width:191px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">&#160;83700</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:241px;">Disposable 18 ga needles&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC9015638&#160;</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:241px;">27 ga 1/2&#34; luer tip needle</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-826-48</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:241px;">2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T48402</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:241px;">Betadine</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC9386574</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:241px;">Puralube Opthalmic Ointment</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC9689910</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:241px;">&#160;Model 900 Stereotaxic frame</td>
			<td style="width:191px;">Kopf Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:241px;">VETBOND</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC9259532&#160;</td>
			<td style="width:233px;">Tissue adhesive&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:241px;">Lidocaine&#160;</td>
			<td style="width:191px;">ShopMedVet</td>
			<td style="width:119px;">RXLIDO-EPI</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:241px;">CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)</td>
			<td style="width:191px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G3580</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:241px;">Anti-Sox2</td>
			<td style="width:191px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">AB5603</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)</td>
			<td style="width:191px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">Z0334&#160;</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:241px;">IVIS Kinetic</td>
			<td style="width:191px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:233px;">For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent Substrate</td>
			<td style="width:191px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">122796</td>
			<td style="width:233px;">For in vivo bioluminescence imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:241px;">EdU Imaging Kit</td>
			<td style="width:191px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C10340</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:241px;">MSCV Luciferase PGK-hygro</td>
			<td style="width:191px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">18782</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo using cortical astrocytes or neural stem cells from conditional, genetically engineered mice

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Foi desenvolvido um sistema de modelo nGEM com astrócitos corticais e NSC colhidas de abrigar GEM neonatal floxed alelos oncogênicos condicional que pode ser fenotipicamente caracterizados in vitro e in vivo (Figura 1). A fim de investigar os efeitos de mutações oncogénicas especificamente em astrócitos do córtex in vitro, que é crítico para o primeiro enriquecimento em astrócitos. Colheitas de astrócitos corticais conter uma mistura de microglia, astrócitos, oligodendróci...

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Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

Modelagem astrocitoma Patogênese<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando Cortical astrócitos ou células-tronco neurais de condicional, Geneticamente Modificadas Ratos

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

13.3K visualizações.  University of North Carolina School of Medicine. Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

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