Name: culturing caenorhabditis elegans in axenic liquid media and creation of transgenic worms by microparticle bombardment
Uploaded: 2014-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de HealthGrants DK85035 e DK074797 (IH).

1. Cepas Worm <ol><li> Obter C. elegans do tipo selvagem estirpes Bristol N2 a partir do Centro de Genética Caenorhabditis (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) e mantê-los em placas NGM semeados com E. OP50 coli 7. Nota: verme transgênico cepas IQ6011 (Phrg-1 :: GFP) utilizados foram gerados como descrito anteriormente 11. IQ6011 pode ser solicitado ao autor correspondente. </li></ol> 2. Preparação de modificação C. elegans Habitação e Reprodução Médio (mCeHR) Prepare mCeHR meios líquidos, como descrito abaixo de 12. Esta mídia líquido axênica permite que os vermes a crescer sem quaisquer fontes de alimentos adicionais. Realizar todas as manipulações dos meios líquidos axênicas e worms axênicos usando condições rigorosamente estéreis, como uma capela de fluxo laminar. <ol><li> Obter leite livre de gordura ultra-pasteurizado de uma mercearia. Use o pró refrigeradoduto e não o produto a temperatura ambiente. Antes de ser utilizado na mCeHR meio, a sequência de leite em Brain Heart Infusion (BHI) em placas de agar e incubar durante 3 dias a 30 ° C e 37 ° C para verificar a esterilidade. Colocar o leite para tubos de 50 ml estéreis e armazenar a -80 ° C </li><li> Prepare a cada um dos seguintes componentes e combinar na ordem e quantidades apresentadas para preparar 1 litro de mCeHR (Tabela 1A): 10 ml de 2 mM de citrato de colina diácido, 10 ml de vitaminas e mistura de factor de crescimento (ver receita na Tabela 1B), 10 ml de 2,4 mM de mio-inositol, 10 ml de 2 mM de cloreto de hemina, 250 ml de água deionizada. Aplicar sucção e filtra-se através de uma unidade de filtro de 0,22 um. </li><li> Adicionar 20 ml da mistura de ácido nucleico (receita na Tabela 1C), 100 ml de mistura de minerais (receita na Tabela 1E), 20 ml de 170 mg / ml de hidrolisado de lactalbumina, 20 ml de aminoácidos essenciais, 10 ml de aminoácidos não essenciais Os ácidos, de 20 ml de 450 mM de KH 2 PO 4,50 ml de 1,45 M de D-glucose, 10 ml de HEPES 1 M, sal de sódio, 250 ml de água desionizada. </li><li> Aplicar sucção para filtrar esterilizar os componentes. Retire o filtro e adicionar 1 ml de 5 mg / ml de colesterol. Certifique-se que o pH do meio é de cerca de 6-6,5. Nota: Esta solução pode ser armazenada a -80 ° C durante até um ano. </li><li> Adicionar 20% (v / v), ultra-pasteurizado de leite desnatado orgânico para o meio mCeHR antes da utilização. Use técnica escrupulosamente estéril (por exemplo, numa câmara de fluxo laminar), quando a abertura e alíquotas do leite. Armazene a mídia a 4 ° C. </li></ol> 3. Prepare C. elegans para a Cultura em Axenic mCeHR Líquido Médio <ol><li> Crescer vermes em dez 60 milímetros placas NGM até há muitos vermes grávidas e uma quantidade mínima de OP50 E. coli nas placas. </li><li> Remover as minhocas de cada placa por enxaguamento com 5 ml de tampão M9 (receita na Tabela 1F), e combinar num tubo de 50 ml. </li><li> Permita que os vermes para settle, deixando o tubo em repouso durante 5 a 10 min, em seguida, remover cuidadosamente o sobrenadante contendo a E. coli. </li><li> Repita os passos 3.2 e 3.3 2x para remover tanto as bactérias residuais quanto possível, antes de continuar o procedimento. </li><li> Ressuspender as minhocas em 0,1 N de NaCl num volume que é um múltiplo de três, por exemplo, 1,5 ml, 3 ml ou 6 ml, em que os vermes individuais pode ser visto no tubo. </li><li> Branquear os vermes por adição de NaOH 5 N e de hipoclorito de sódio a 5% solução (lixívia) numa proporção de 01:02:06 para a suspensão verme. Por exemplo, 1 ml de NaOH 5 N: 2 ml de hipoclorito de sódio a 5%: 6 ml de suspensão de vírus. Misture o NaOH e branqueador antes da adição à suspensão de verme. </li><li> Vortex se vigorosamente a solução até as minhocas grávidas são dissolvidos e apenas os ovos são visíveis dentro da suspensão (cerca de 5 a 10 min). Monitorar o processo usando um microscópio de contraste de fase com uma objetiva de 10X. </li><li> Após os vermes se ter dissolvido completamente, a pelota imediatamenteovos de 800 g durante 45 segundos a 4 ° C. Remover o sobrenadante e lavar o sedimento duas vezes com 10 ml de água estéril, por centrifugação a pelota em 800 xg durante 45 seg a 4 ° C. </li><li> Após o branqueamento, transferir o sedimento de ovo a um frasco de 25 de tecido cm 2 de cultura contendo 10 ml de meio mCeHR suplementadas com 100 ug / ml de tetraciclina. Realizar este procedimento usando técnicas estéreis. Se for o caso, adicionar antibióticos adicionais, incluindo 250 ug / ml de ácido nalidíxico, para prevenir o crescimento bacteriano nas culturas líquidas axênicos. </li><li> Incubar as culturas liquidas a 20 ° C num incubador com agitação a cerca de 70 rpm. </li><li> Verificar os vermes diária observar a fase de desenvolvimento e a taxa de crescimento. Nota: Worms inicialmente crescem lentamente e exigem 7 a 10 dias para se tornar grávido. No entanto, como os vermes aclimatar ao meio líquido o tempo de geração irá diminuir a aproximadamente 4 dias para o tipo selvagem (N2) vermes. </li><li> Depois que os vermes têm desenvolvido para a fase grávida em meio líquido, a transferência da cultura para um tubo sem-fim cónico e sedimentar as minhocas a 800 xg por 5 min a 4 ° C utilizando um rotor de balde oscilante. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o sedimento de vírus num volume igual de 0,1 M de NaCl. Por exemplo, utilizar 10 ml de 0,1 M de NaCl para vermes cultivados em 10 ml de mCeHR. Permita que os vermes que se contentar com 5 min no gelo. </li><li> Realizar o procedimento de clareamento, como descrito acima em passos 3,5-3,8, e permitir que os vermes a crescer para uma segunda geração nos meios líquidos axênicas. Se necessário, adicionar o antibiótico de novo para inibir o crescimento bacteriano. </li><li> Novamente permitir que os vermes se tornar prenhe então granulada e ressuspender os vermes em 0,1 M de NaCl, tal como descrito nos passos 3.12 e 3.13, então lixívia novamente como descrito nos passos de 3,5-3,8, para produzir uma população sincronizada. Crescer os vermes larvais L1 em ​​meios líquidos sem antibióticos a partir de agora. </li></ol> 4. Sincronizando Worms de líquidoCultura <ol><li> Pellet e ressuspender os vermes em NaCl 0,1 M, como descrito acima nos passos 3.12 e 3.13. Lixívia como descrito acima nos passos 3,5-3,8. </li><li> Ressuspender o sedimento de ovo em 10 ml de tampão M9 e permitir que as larvas eclodem O / N a 20 ° C num agitador de plataforma rotativa. Nota: Os ovos eclodem em larvas L1, mas não vai desenvolver ainda mais, sincronizando os vermes na fase L1. </li><li> Para manter e vermes subcultura, pelota larvas L1 a 800 xg durante 5 min, em seguida, voltar a suspender as larvas em 10 ml de mCeHR e transferência para um frasco de 25 cm 2. Permitir que os vermes a crescer a 20 ° C numa plataforma rotativa. Manter uma densidade máxima de 3.000 vermes / ml / cm 2 para garantir nutrição adequada para os vermes. Nota: Nesta fase, os antibióticos não são necessárias para manter as condições axénicas, quando os procedimentos são efectuados utilizando técnicas esterilizadas numa hote de fluxo laminar. Worms deve ser verificado diariamente para acompanhar o crescimento. </li></ol> 5. Grátiszing e descongelamento Worms para culturas Axenic Médio <ol><li> Congelar culturas vermes assíncronos axênicos ou larvas L1 sincronizado em nitrogênio líquido. Vermes pelete a 800 x g durante 5 min e em seguida ressuspender em tampão S (6,45 mM KHPO 4, 43,55 mM KHPO 4, NaCl 146,25 mM) usando 0,5 ml para cada frasco. Adicionar um volume igual de tampão de S com 30% v / v de glicerol a cada frasco e transferir os vermes para -80 ° C, antes de armazenamento a longo prazo em N2 líquido. Congelar a cerca de 1 x 10 6 por ml vermes em cada frasco. </li><li> Descongelar vermes por incubação dos tubos a 37 ° C durante aproximadamente 2 minutos até quase todo o gelo é derretido. Em uma câmara de fluxo laminar, transferir os vermes para um frasco estéril contendo mCeHR e colocá-los a 20 ° C. </li></ol> 6. Determinar o efeito de Hemin Concentração de Crescimento e Reprodução em mCeHR <ol><li> Use mídia mCeHR axênicos para ensaio de crescimento dependente de nutrientes de C. elegans. Para determinar o efeito of concentração hemina sobre o crescimento e desenvolvimento sem fim, use sincronizado vermes N2 axênicos ou outras cepas de interesse. Sincronizar larvas L1, como descrito acima na seção 4. </li><li> No dia seguinte, pelota e contar larvas L1 sincronizado e diluir a 1 verme por mL de mídia axênicas. Adicione cloreto de hemina a 10 mM em 0,3 M de NH 4 OH e ajustar a pH 8, utilizando HCl concentrado. </li><li> Adicionar 800 ul de meio mCeHR para uma placa de 24 poços. Adicionar 100 vermes para cada poço em 100 ul de meio. Adicionar cloreto de hemina a cada poço em concentrações que variam de 0 uM, 1,5 uM a 1,000 uM em triplicado. Assegurar que todos os poços contêm a mesma concentração de 0,3 M de NH 4 OH. Suavemente ressuspensas os vermes antes pipetando para assegurar que 100 larvas L1 são adicionados a cada poço. </li><li> Examine os vermes diariamente e observe o crescimento em cada concentração em cada poço. Contar o número de vermes após 9 dias de incubação e traçar o número de vermes / ml correspondem a cada hemeconcentração (Figura 1). </li></ol> 7. Efeito da Hemin Concentração em Heme Sensor Worms <ol><li> Incubar sincronizados L1 vermes sensores heme (Phrg-1 :: GFP) em mCeHR contendo 4 pM, 8 pM, 10 uM e 20 uM de hemina. </li><li> Imagem os vermes usando microscopia confocal de fluorescência, 48 pós horas de incubação (Figura 2). </li></ol> 8. Utilizando mCeHR gerar Transgênicos C. elegans Usando Microparticle Bombardeio Nota: O procedimento para a criação e a realização de bombardeamento com micropartículas usando vermes cultivados em mCeHR unc-119 (ed3) é mostrada na figura 3 13. <ol><li> Preparação Worm <ol><li> Transferir cerca de 1 x 10 6 assíncronas unc-119 (ed3 vermes) em 90 ml de meio mCeHR em um balão de 175 centímetros 2 uma semana antes do bombardeamento. Permita que os vermes a crescer a 20 ° C ona plataforma de agitação em ~ 70 rpm (Figura 3-1). Nota: Uma semana mais tarde, a densidade de sem-fim deve ser significativamente maior com diversos vermes adultos grávidos. Aproximadamente 3 x 10 7 vermes será necessária para bombardeamento com micropartículas. </li><li> Frio JM109 E. coli semeadas 10 placas NGM cm no gelo. </li><li> Transferir os vermes axênicos para dois tubos de 50 ml e centrifugar cónicas dos vermes a 800 xg durante 2 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender os vermes em cada tubo de 50 ml de tampão M9 (Figura 3-2). </li><li> Permita que os vermes adultos para sedimentar por gravidade por 10 a 15 min em gelo. Nota: Os sedimentos de 2 ml agora deve conter&gt; 90% vermes adultos. Este sedimento 2 ml devem ter aproximadamente 5 x 10 6 de vermes e é suficiente para um bombardeamento de micropartículas. </li><li> Casaco de toda a superfície da placa de JM109 refrigerados semeadas NGM com o sedimento de 2 ml de vermes. Deixe o líquido ser absorvido completamente em seguida, deixar a placapor 30 min no gelo antes de prosseguir (Figura 3-3). </li></ol></li><li> Preparação de partículas de ouro <ol><li> Pesar 30 mg de partículas de ouro para um tubo de microcentrífuga siliconizada. Adicionar 1 ml de etanol 70% e vortex do tubo durante 5 min. </li><li> Permitir que o tubo em repouso durante 15 min, depois, centrifugar a 6000 xg durante 10 seg para sedimentar as partículas de ouro. Retirar o sobrenadante utilizando uma pipeta, tocando cuidadosamente a ponta para o lado oposto do tubo com as partículas de ouro. </li><li> Lavar as partículas de ouro com 1 ml de água estéril, vortex durante 1 min e centrifugar brevemente o tubo a 6.000 xg durante 10 seg. Repetir o passo de lavagem, duas vezes, em seguida, voltar a suspender as partículas de ouro, em 0,5 ml de glicerol a 50% estéril. Nota: A concentração final das partículas de ouro será de 60 mg / ml e pode ser armazenado durante 1 a 2 meses a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparar a mistura de partículas de DNA a ouro <ol><li> Combinar 10 ug do ADN de plasmídeo desejado com 10 &amp;# 956; g do unc-119 plasmídeo de resgate em uma siliconizada 1,5 ml tubo de microcentrífuga. Adicionar 50 mL de água DI e 100 ul de solução de partículas bem ressuspenso ouro depois vórtice durante 1 min. </li><li> Adicionar 150 ul de 2,5 M CaCl2 e vortex a solução novamente durante 1 min. A esta solução, adicionar 60 ul de espermidina 0,1 M e vortex durante 3 a 5 min. </li><li> Pulso centrifugar a solução a 6.000 xg durante 10 seg, remover o sobrenadante e adicionar 300 ul de etanol a 70%. Vortex bem durante 1 min, centrifugar a 6.000 xg pulso, remove-se o sobrenadante e ressuspender em 170 ul de etanol a 100%. Vortex vigorosamente a solução durante 5 a 10 minutos, em seguida centrifuga pulso e remover o sobrenadante. </li></ol></li><li> Bombardeio (Figura 3-3) Nota: Este protocolo realiza-se com o sistema de entrega de partículas especificado na Tabela de Materiais / equipamento. Siga as instruções para o instrumento de entrega de partículas disponível. <ol> &lt;li&gt; Coloque uma folha de papel de tecido em uma placa de 15 cm. Com uma pinça, mergulhe sete macrocarriers individualmente em etanol 100% e colocá-las sobre o tecido para secar. </li><li> Limpe bem a câmara de biobalística, titular microtransportador, e placa-alvo com etanol 70%. Limpe e autoclave as telas de parada antes de cada procedimento de bombardeio. </li><li> Coloque as macrocarrriers no suporte usando uma pinça e imprensa no suporte usando a ferramenta de estar. </li><li> Uniformemente distribuído 20 ul do DNA de partículas de ouro revestidas, no centro de cada microtransportador e, em seguida, permitir que a solução seque completamente. </li><li> Limpar as duas partes do divisor de pressão com etanol e montar com etanol limpo discos de ruptura. Aperte o divisor de pressão montado e discos de ruptura na câmara de bombardeamento. </li><li> Montar uma tela de parada autoclavado com o titular da microtransportador e coloque o aparelho em cima da prateleira de metal necessárias e trava no lugar. </li><li> Insira o macr montadoAparelho ocarrier na câmara biolística na ranhura colocado abaixo do divisor de tensão e alinhar com o divisor de tensão. </li><li> Tape a placa NGM aberto com os vermes na prateleira placa-alvo e fechar a porta da câmara. </li><li> Para bombardear vermes, ajustar a pressão para que a necessária para quebrar os discos de ruptura. Ligue o vácuo de 28 polegadas de pressão de Hg, em seguida, pressione o botão de fogo até que os discos de ruptura. </li><li> Solte o vácuo e retirar a placa NGM do aparelho. Lave os vermes da placa e redistribuir em vinte placas de 10 cm NGM semeados com JM109 E. coli (Figura 3-4). </li><li> Permitir que os vermes se crescer durante 10 a 14 dias a 25 ° C e as placas de fome. Worms resgatados de defeito unc-119 terá movimento normal e pode ser identificada neste momento. Escolha pelo menos 10 &quot;tipo selvagem&quot; vermes de pratos separados para análise uma vez que estes representam linhagens transgênicas independentes (Figure 3-5). </li></ol></li></ol>

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	<li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi.">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li><li>Nass, R., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+dopaminergic+system:+opportunities+for+insights+into+dopamine+transport+and+neurodegeneration.">The Caenorhabditis elegans dopaminergic system: opportunities for insights into dopamine transport and neurodegeneration.</a> Annual review of pharmacology and toxicology. 43, 521-544 (2003).</li><li>Lapierre, L. R., Hansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+C+elegans+signaling+pathways+for+longevity.">Lessons from C elegans signaling pathways for longevity.</a> Trends in endocrinology and metabolism TEM. 23, 637-644 (2012).</li><li>Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasticity+of+aging+insights+from+long-lived+mutants.">The plasticity of aging insights from long-lived mutants.</a> Cell. 120, 449-460 (2005).</li><li>Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+life+span+determination+in+Caenorhabditis+elegans.">Mechanisms of life span determination in Caenorhabditis elegans.</a> Neurobiology of aging. 20, 487-502 (1999).</li><li>Poole, R. J., Bashllari, E., Cochella, L., Flowers, E. B., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genome-Wide+RNAi+Screen+for+Factors+Involved+in+Neuronal+Specification+in+Caenorhabditis+elegans.">A Genome-Wide RNAi Screen for Factors Involved in Neuronal Specification in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS genetics. 7, e1002109 (2011).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C+elegans+WormBook+the+online+review+of+C.">Maintenance of C elegans WormBook the online review of C.</a> elegans biology. , 1-11 (2006).</li><li>Win, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validated+Liquid+Culture+Monitoring+System+for+Lifespan+Extension+of+Caenorhabditis+elegans+through+Genetic+and+Dietary+Manipulations.">Validated Liquid Culture Monitoring System for Lifespan Extension of Caenorhabditis elegans through Genetic and Dietary Manipulations.</a> Aging and disease. 4, 178-185 (2013).</li><li>Clegg, E. D., LaPenotiere, H. F., French, D. Y., Szilagyi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+CeHR+Axenic+Medium+for+Exposure+and+Gene+Expression+Studies.">Use of CeHR Axenic Medium for Exposure and Gene Expression Studies.</a> East Coast Worm Meeting. , (2002).</li><li>Severance, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+novel+genes+essential+for+heme+homeostasis+in+Caenorhabditis+elegans.">Genome-wide analysis reveals novel genes essential for heme homeostasis in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS genetics. 6, e1001044 (2010).</li><li>Rajagopal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haem+homeostasis+is+regulated+by+the+conserved+and+concerted+functions+of+HRG-1+proteins.">Haem homeostasis is regulated by the conserved and concerted functions of HRG-1 proteins.</a> Nature. 453, 1127-1131 (2008).</li><li>Nass, R., Hamza, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+1+Unit+1+9.">Chapter 1 Unit 1 9.</a> The nematode C. elegans as an animal model to explore toxicology in vivo: solid and axenic growth culture conditions and compound exposure parameters. Current protocols in toxicology editorial board, Mahin D. Maines. , (2007).</li><li>Schweinsberg, P. J., Grant, B. D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+gene+transformation+by+microparticle+bombardment+WormBook+the+online+review+of+C.">elegans gene transformation by microparticle bombardment WormBook the online review of C.</a> elegans biology. , 1-10 (2013).</li><li>Rao, A. U., Carta, L. K., Lesuisse, E., Hamza, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+heme+synthesis+in+a+free-living+eukaryote.">Lack of heme synthesis in a free-living eukaryote.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4270-4275 (2005).</li><li>Szewczyk, N. J., Kozak, E., Conley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+medium+and+Caenorhabditis+elegans.">Chemically defined medium and Caenorhabditis elegans.</a> BMC biotechnology. 3, 19 (2003).</li><li>Szewczyk, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+development+and+lifespan+extension+as+features+of+metabolic+lifestyle+alteration+in+C+elegans+under+dietary+restriction.">Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C elegans under dietary restriction.</a> The Journal of experimental biology. 209, 4129-4139 (2006).</li><li>White, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HRG1+is+essential+for+heme+transport+from+the+phagolysosome+of+macrophages+during+erythrophagocytosis.">HRG1 is essential for heme transport from the phagolysosome of macrophages during erythrophagocytosis.</a> Cell metabolism. 17, 261-270 (2013).</li><li>Chen, C., Samuel, T. K., Sinclair, J., Dailey, H. A., Hamza, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intercellular+heme-trafficking+protein+delivers+maternal+heme+to+the+embryo+during+development+in+C+elegans.">An intercellular heme-trafficking protein delivers maternal heme to the embryo during development in C elegans.</a> Cell. 145, 720-731 (2011).</li><li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans.">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li><li>Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+gene+targeting+in+Caenorhabditis+elegans+by+biolistic+transformation.">Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation.</a> Nucleic acids research. 32, e40 (2004).</li><li>Semple, J. I., Biondini, L., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+transgenic+nematodes+by+bombardment+and+antibiotic+selection.">Generating transgenic nematodes by bombardment and antibiotic selection.</a> Nature Methods. 9, 118-119 (2012).</li></ol>

Os autores declaram que não há concorrentes interesses financeiros ou conflitos de interesses.

Neste protocolo, apresentamos uma mCeHR mídia modificado axênica líquido que permite a rápida C. geração elegans com a produção de um grande número de vermes. Esta mídia mostra várias vantagens como os vermes são cultivados sem contaminar E. coli ou subprodutos de bactérias e pode ser explorada em estudos nutricionais e toxicológicos. O uso de E. coli ou outras bactérias em tais estudos tem vários inconvenientes. Por exemplo, o crescimento das bactérias podem mudar, s...

O nematóide do solo, Caenorhabditis elegans, é um poderoso organismo modelo utilizado em inúmeros estudos da genética à toxicologia. Como resultado do seu tamanho 1 mm de tempo de geração rápida de quatro dias, a facilidade de cultivo, e um grande número da progenitura, estes nemátodos têm sido utilizados num certo número de telas genéticos e farmacológicos 1, 2. Pesquisadores tirar proveito deste worm para identificar moléculas e vias conservadas em sistemas de vertebrados. Estas vias incluem sinais de morte celular, as vias de envelhecimento e metabolismo, e o sistema nervoso 3-6. Além disso, a transparência da C. elegans permite a geração de linhas transgénicas usando repórteres de proteínas fluorescentes, que podem ser visualizadas directamente para analisar os padrões de expressão de genes e localização de proteínas. Em muitos estudos desse nematóide é cultivado em uma superfície à base de agar sólido usando nematóide meio de crescimento placas (NGM) ou lculturas iquid semeada com Escherichia coli como uma fonte de alimento 7,8. Estas fontes alimentares bacterianas podem confundir estudos bioquímicos e toxicológicos com a interferência de bactérias subprodutos que afetam a interpretação dos resultados. A fim de evitar estes efeitos combinados, C. elegans podem ser cultivadas num meio líquido axênicos que é desprovido de bactérias como uma fonte de alimento. Usando essa mídia, cultivadas com sucesso milhões de vermes altamente sincronizadas para muitos padrão C. protocolos elegans, incluindo a análise de microarray de genes diferencialmente regulados em C. elegans expostas a diferentes concentrações de heme e a produção de vermes transgénicas usando bombardeamento de genes. Esta mídia é quimicamente definidos e modificados a partir de uma receita original formulada pelo Dr. Eric Clegg 9. Utilizando este suporte mCeHR, identificámos com sucesso genes envolvidos na homeostase do heme, que se refere a genes que respondem a heme (hrg s) 10, o qual farianão ter sido possível em condições de crescimento normais que utilizam placas de agar semeadas com E. NGM coli. Neste protocolo, descrevemos o procedimento para a introdução e manutenção de C. elegans crescidos em E. coli para o mCeHR axênica e utilizar este método para obter um grande número de vermes para a produção transgénica C. linhas elegans utilizando micropartículas bombardeio. Nós também apresentamos estudos que mostram a utilidade de usar mídia axênicos para determinar a exigência nutricional de C. elegans utilizando heme como um exemplo. Estes estudos mostram que o uso de meios de comunicação mCeHR permite o crescimento rápido de um grande número de C. elegans para muitas aplicações a jusante utilizados por pesquisadores verme.

<table><tbody><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;6H2O</td><td>Sigma</td><td>M-2393</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Sigma</td><td>S-4641</td><td></td></tr><tr><td>Potassium citrate monohydrate</td><td>Sigma</td><td>P-1722</td><td></td></tr><tr><td>CuCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher</td><td>C455-500</td><td></td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher</td><td>M87-100</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>Z-0152</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NH4)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;(SO4)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>F-1018</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt</td><td>Sigma</td><td>A-1752</td><td></td></tr><tr><td>Cytidine 5 -phosphate</td><td>Sigma</td><td>C-1006</td><td></td></tr><tr><td>Guanosine 2&#039; - and 3&#039; -monophosphate</td><td>Sigma</td><td>G-8002</td><td></td></tr><tr><td>Uridine 5 -phosphate, disodium salt</td><td>Sigma</td><td>U-6375</td><td></td></tr><tr><td>Thymine</td><td>Sigma</td><td>T0376</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylglucosamine</td><td>Sigma</td><td>A3286</td><td></td></tr><tr><td>DL-Alanine</td><td>Fisher</td><td>S25648&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>p-Aminobenzoic Acid</td><td>Sigma</td><td>A-9878</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma</td><td>B-4639</td><td></td></tr><tr><td>Cyanocobalamine (B-12)</td><td>Sigma</td><td>V-2876</td><td></td></tr><tr><td>Folinate (Ca)</td><td>Sigma</td><td>F-7878</td><td></td></tr><tr><td>Niacin</td><td>Sigma</td><td>N-0761</td><td></td></tr><tr><td>Niacinamide</td><td>Sigma</td><td>N-3376</td><td></td></tr><tr><td>Pantetheine</td><td>Sigma</td><td>P-2125</td><td></td></tr><tr><td>Pantothenate (Ca)</td><td>Sigma</td><td>P-6292</td><td></td></tr><tr><td>Pteroylglutamic Acid (Folic Acid)</td><td>ACRCS</td><td>21663-0100</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxal 5&#039;-phosphate</td><td>Sigma</td><td>P-3657</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxamine 2HCl</td><td>Sigma</td><td>P-9158</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxine HCl</td><td>Sigma</td><td>P-6280</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavin 5-PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;(Na)</td><td>Sigma</td><td>R-7774</td><td></td></tr><tr><td>Thiamine HCl</td><td>Sigma</td><td>T-1270</td><td></td></tr><tr><td>DL-6,8-Thioctic Acid</td><td>Sigma</td><td>T-1395</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>Choline di-acid citrate</td><td>Sigma</td><td>C-2004</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;myo&lt;/em&gt;-Inositol</td><td>Sigma</td><td>I-5125</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G-7520</td><td></td></tr><tr><td>Lactalbumin enzymatic hydrolysate</td><td>Sigma</td><td>L-9010</td><td></td></tr><tr><td>Brain Heart Infusion</td><td>BD</td><td>211065</td><td></td></tr><tr><td>Hemin chloride</td><td>Frontier Scientific</td><td>H651-9</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, sodium salt</td><td>Sigma</td><td>H-3784</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>J.T. Baker</td><td>F676-05</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids</td><td>Invitrogen</td><td>11140-076</td><td></td></tr><tr><td>MEM Amino Acids Solution</td><td>Invitrogen</td><td>11130-051</td><td></td></tr><tr><td>Nalidixic acid sodium salt</td><td>Sigma</td><td>N4382</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline Hydrochloride</td><td>MP Biomedicals</td><td>2194542</td><td></td></tr><tr><td>Biolistic Delivery System</td><td>BioRad</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>Gold particles (Au Powder)&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;Ferro Electronic Material Systems</td><td>6420 2504, JZP01010KM</td><td></td></tr><tr><td>or</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gold Particles 1.0 &amp;mu;m</td><td>BioRad</td><td>&amp;nbsp;165-2263</td><td></td></tr></tbody></table>

culturing caenorhabditis elegans in axenic liquid media and creation of transgenic worms by microparticle bombardment

Neste protocolo, apresentamos os materiais necessários, bem como o procedimento para a tomada de C modificado. Legans e habituação e de reprodução da mídia (mCeHR). Além disso, as etapas para expor e aclimatação C. elegans crescidos em E. coli para axênica meios líquidos são descritos. Finalmente, experimentos a jusante que utilizam axênica C. elegans ilustrar os benefícios deste procedimento. A capacidade de analisar e determinar C. elegans exigência nutricional foi ilustrada pelo crescimento N2 tipo selvagem vermes em meio líquido axênicos com concentrações variadas de heme. Este procedimento pode ser replicado com outros nutrientes para determinar a concentração óptima para o crescimento e desenvolvimento de sem-fim ou, para determinar os efeitos toxicológicos de tratamentos com drogas. Os efeitos da concentração do heme variadas sobre o crescimento de tipo selvagem vermes foram determinados por meio de observação microscópica qualitativa e quantificando tele número de vermes que cresciam em cada concentração de heme. Além disso, o efeito de concentrações variadas de nutrientes pode ser ensaiada utilizando vermes que expressam sensores fluorescentes que respondem a alterações nos teores de nutrientes de interesse. Além disso, um grande número de vermes foram facilmente produzida para a geração de C. elegans transgénicos utilizando bombardeamento com micropartículas.

Cultivar C. elegans em axênicos ajudas meio líquido na determinação de nutrientes que são necessários por vermes, sem a interferência de metabólitos secundários produzidos por E. coli. Vermes de tipo selvagem N2 aclimatar a mídia mCeHR dentro de três gerações e mostrar um crescimento comparável a vermes cultivadas em placas bacterianas NGM. Na verdade, esses vermes se tornar grávida dentro de 4 dias, em comparação com 3,5 dias para vermes cultivadas em OP50 bactérias. <p class="jo...

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Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans é normalmente cultivadas em placas de agar sólido ou em meio líquido semeadas com E. coli. Para evitar subprodutos bacterianos de confundir os estudos toxicológicos e nutricionais, utilizamos um meio líquido axênico, CEHR, para crescer e sincronizar um grande número de vermes para uma gama de aplicações a jusante.

A cultura<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; Em Axenic Liquid Media e Criação de transgênicos Worms por bombardeamento com micropartículas

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

culturing-caenorhabditis-elegans-axenic-liquid-media-creation

Research

JoVE Journal

Biology

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

16.9K visualizações.  University of Maryland.  C. elegans é normalmente cultivadas em placas de agar sólido ou em meio líquido semeadas com E. coli. Para evitar subprodutos bacterianos de confundir os estudos toxicológicos e nutricionais, utilizamos um meio líquido axênico, CEHR, para crescer e sincronizar um grande número de vermes para uma gama de aplicações a jusante. 

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The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the intestine the primary location for disease. The nematode intestine structurally and functionally mimics mammalian intestines and is transparent making it amenable to microscopic study of colonization. Here we show that pathogens can cause disease and death. We are able to identify microbial mutants that show altered virulence. Its conserved innate response to biotic stresses makes C. elegans an excellent system to probe facets of host innate immune interactions. We show that hosts with mutations in the dual oxidase gene cannot produce reactive oxygen species and are unable to resist microbial insult. We further demonstrate the versatility of the presented survival assay by showing that it can be used to study the effects of inhibitors of microbial growth. This assay may also be used to discover fungal virulence factors as targets for the development of novel antifungal agents, as well as provide an opportunity to further uncover host-microbe interactions. The design of this assay lends itself well to high throughput whole-genome screens, while the ability to cryo-preserve worms for future use makes it a cost-effective and attractive whole animal model to study.

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Here, we present the nematode Caenorhabditis elegans as a versatile host model to study microbial interaction.

O nemátode Caenorhabditis Elegans - um modelo versátil na Vivo para estudar interações do anfitrião-micróbio

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Genética

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Geração de transgênicos Estável C. elegans Usando microinjeção

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Biologia

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

Aplicação de RNAi e calor-choque-induzida expressão de fator de transcrição para reprogramar as células germinativas de neurônios em c. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Biologia do Desenvolvimento

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Sistema Modelo para Estudo Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Neurociência

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Geração de transgênicos C. elegans Por biobalística Transformação

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic of their life cycle is the mutualistic association with the bacteria Photorhabdus and Xenorhabdus, respectively. The nematode parasites are able to locate and enter suitable insect hosts, subvert the insect immune response, and multiply efficiently to produce the next generation that will actively hunt new insect prey to infect. Due to the properties of their life cycle, entomopathogenic nematodes are popular biological control agents, which are used in combination with insecticides to control destructive agricultural insect pests. Simultaneously, these parasitic nematodes represent a research tool to analyze nematode pathogenicity and host anti-nematode responses. This research is aided by the recent development of genetic techniques and transcriptomic approaches for understanding the role of nematode secreted molecules during infection. Here, a detailed protocol on maintaining entomopathogenic nematodes and using a gene knockdown procedure is provided. These methodologies further promote the functional characterization of entomopathogenic nematode infection factors.

Entomopathogenic nematodes live in symbiosis with bacteria and together they successfully infect insects by undermining their innate immune system. To promote research on the genetic basis of nematode infection, methods for maintaining and genetically manipulating entomopathogenic nematodes are described.

Culturing e Geneticamente Manipulação Nematodes Entomopatômicos

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic ...

Imunologia e Infecção

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather than individual worm samples to quantify bacterial load in this organism. Here it is argued that the large inter-individual variability seen in bacterial colonization of the C. elegans intestine is informative, and that batch digest methods discard information that is important for accurate comparison across conditions. As describing the variation inherent to these samples requires large numbers of individuals, a convenient 96-well plate protocol for disruption and colony plating of individual worms is established.

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

This protocol describes a 96-well disruption of individual bacterially colonized Caenorhabditis elegans following cold paralysis and surface bleaching&#160;to remove external bacteria. The resulting suspension is plated on agar plates to allow accurate, medium-throughput quantification of bacterial load in large numbers of individual worms.

Usando dados de verme único para quantificar a heterogeneidade em Interações elegans-bacterianas de Caenorhabditis

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid nematode growth media (NGM), allowing the efficient collection of population-level data for survival and other physiological phenotypes, and periodic sampling of subpopulations for fluorescent biomarker quantification. Limitations to this approach are the inability to (1) follow individual worms over time to develop age trajectories for phenotypes of interest and (2) monitor fluorescent biomarkers directly in the context of the culture environment. Alternative culture approaches use liquid culture or microfluidics to monitor individual animals over time, in some cases including fluorescence quantification, with the tradeoff that the culture environment is contextually distinct from solid NGM. The WorMotel is a previously described microfabricated multi-well device for culturing isolated worms on solid NGM. Each worm is maintained in a well containing solid NGM surrounded by a moat filled with copper sulfate, a contact repellent for C. elegans, allowing longitudinal monitoring of individual animals. We find copper sulfate insufficient to prevent worms from fleeing when subjected to aversive interventions common in aging research, including dietary restriction, pathogenic bacteria, and chemical agents that induce cellular stress. The multi-well devices are also molded from polydimethylsiloxane, which produces high background artifacts in fluorescence imaging. This protocol describes a new approach for culturing isolated roundworms on solid NGM using commercially available polystyrene microtrays, originally designed for human leukocyte antigen (HLA) typing, allowing the measurement of survival, physiological phenotypes, and fluorescence across the lifespan. A palmitic acid barrier prevents worms from fleeing, even in the presence of aversive conditions. Each plate can culture up to 96 animals and easily adapts to a variety of conditions, including dietary restriction, RNAi, and chemical additives, and is compatible with automated systems for collecting lifespan and activity data.

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Here, we present a protocol to culture isolated individual nematodes on solid media for lifelong physiological parameter tracking and fluorescence quantification. This culture system includes a palmitic acid barrier around single-worm wells to prevent animals from fleeing, allowing the use of aversive interventions, including pathogenic bacteria and chemical stressors.

Cultura de Longo Prazo de Caenorhabditis elegans Individuais em Meio Sólido para Monitoramento Longitudinal de Fluorescência e Intervenções Aversivas

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid ...

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

The nematode Caenorhabditis elegans is among the most common model systems used in aging research owing to its simple and inexpensive culture techniques, rapid reproduction cycle (~3 days), short lifespan (~3 weeks), and numerous available tools for genetic manipulation and molecular analysis. The most common approach for conducting aging studies in C. elegans, including survival analysis, involves culturing populations of tens to hundreds of animals together on solid nematode growth media (NGM) in Petri plates. While this approach gathers data on a population of animals, most protocols do not track individual animals over time. Presented here is an optimized protocol for the long-term culturing of individual animals on microfabricated polydimethylsiloxane (PDMS) devices called WorMotels. Each device allows up to 240 animals to be cultured in small wells containing NGM, with each well isolated by a copper sulfate-containing moat that prevents the animals from fleeing. Building on the original WorMotel description, this paper provides a detailed protocol for molding, preparing, and populating each device, with descriptions of common technical complications and advice for troubleshooting. Within this protocol are techniques for the consistent loading of small-volume NGM, the consistent drying of both the NGM and bacterial food, options for delivering pharmacological interventions, instructions for and practical limitations to reusing PDMS devices, and tips for minimizing desiccation, even in low-humidity environments. This technique allows the longitudinal monitoring of various physiological parameters, including stimulated activity, unstimulated activity, body size, movement geometry, healthspan, and survival, in an environment similar to the standard technique for group culture on solid media in Petri plates. This method is compatible with high-throughput data collection when used in conjunction with automated microscopy and analysis software. Finally, the limitations of this technique are discussed, as well as a comparison of this approach to a recently developed method that uses microtrays to culture isolated nematodes on solid media.

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

Presented here is an optimized protocol for culturing isolated individual nematodes on solid media in microfabricated multi-well devices. This approach allows individual animals to be monitored throughout their lives for a variety of phenotypes related to aging and health, including activity, body size and shape, movement geometry, and survival.

Cultura de Longa Duração e Monitoramento de Caenorhabditis elegans Isolados em Meio Sólido em Dispositivos Multipoços

The nematode Caenorhabditis elegans is among the most common model systems used in aging research owing to its simple and inexpensive culture techniques, ...

C. elegans Maintenance

Ceanorhabditis elegans has been, and is still, used to great success as a model organism for studying a variety of developmental, genetic, molecular and even physical phenomena. In order to use C. elegans to its full potential, proper care and attention to the basic maintenance of this powerful organism is essential.
In this video you will learn the basic housing and feeding requirements of C. elegans, how to correctly handle and manipulate worms using a worm pick and how to freeze and recover important worm stocks. Towards the end of the video we will visit a few applications of modifying the housing, feeding and manipulation of these important animals.

Maintenance of Caenorhabditis elegans

Manutenção de C. elegans

Ceanorhabditis elegans has been, and is still, used to great success as a model organism for studying a variety of developmental, genetic, molecular and ...

A cultura

Resumo

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