Este protocolo demonstra a interrupção mecânica dos elegans marinhos. Em um formato de poço 96 permitindo quantificação média de rendimento de carga bacteriana em vermes individuais. Esta técnica aumenta a velocidade e a uniformidade da interrupção mecânica em comparação com os métodos baseados em Pasel, permitindo que os pesquisadores produzam facilmente conjuntos de dados maiores de medições de vermes únicos de alta qualidade.
Esta técnica envolve muitas partes móveis e é fácil perder seu lugar. Certifique-se de ter todos os materiais, tubos rotulados, tampões e placas configurados antes do início. Demonstrando o procedimento será Megan Taylor uma especialista em pesquisa líder do meu laboratório.
Comece suspendendo a amostra de vermes em um mililitro de M9 TX zero um em um tubo de micro centrífuga. Colete os vermes adultos por centrifugação e descarte o supernatante. Usando os mesmos parâmetros de centrifugação.
Enxágüe os vermes duas vezes com um mililitro de M9TX01 e uma vez com um mililitro de tampão de minhoca M9, para minimizar as bactérias externas. Em seguida, suspender novamente cada amostra em um mililitro de S médio mais dois x calor matou OP50 em um tubo de cultura. Incubar os tubos a 25 graus Celsius por 20 a 30 minutos para passar as bactérias não ad aderidas do intestino.
Após a incubação, enxágue os vermes purgados duas vezes com um mililitro de M9TX01 frio e descarte o super natant. Coloque os tubos no gelo por 10 minutos para paralisar os vermes. Em seguida, adicione um mililitro de gelo frio M nove tampão de verme com alvejante não perfumado a cada tubo.
Incubar os tubos no gelo por um mínimo de 10 minutos para matar bactérias externas. Descarte o tampão de alvejante e devolva os tubos ao gelo para evitar que os vermes bombeiem. Em seguida, adicione um mililitro de M9TX01 frio a cada tubo e centrífuga por cinco segundos.
Em uma mini centrífuga. Devolva os tubos ao gelo e remova o supernasal. Repita este passo uma vez.
Para permeabilização química da cutícula de verme. Transfira os tubos contendo os vermes em 20 microliters de tampão para um rack de tubo de temperatura ambiente. Em seguida, adicione 100 microliters de solução SDS/DTT a cada amostra quente.
Incubar os tubos por até oito minutos no banco para quebrar parcialmente a cutícula dos vermes adultos. Neste ponto, os vermes morrerão e se estabelecerão no fundo do tubo. Após a incubação, descarte cuidadosamente o supernatante SDS/DTT.
Em seguida, adicione um mililitro de M9TX01 a cada tubo e centrífuga brevemente para pellet os vermes. Descarte o supernasal e suspenda os vermes em um mililitro M nove tampão de verme com 0,1%Triton x-100. Para se preparar para a interrupção mecânica dos vermes, obtenha um poço de dois mililitros de profundidade e uma tampa de placa de silicone.
Use uma espátula estéril para adicionar uma pequena quantidade de carboneto de silicone de 36 grade estéril a cada poço, de tal forma que a grade mal cubra a parte inferior do poço. Adicione 180 microliters de M nove tampão de vermes a cada poço. Rotule as colunas e as linhas e cubra a placa com a tampa da placa de silicone.
Em seguida, transfira os vermes permeabilizados para uma pequena placa de Petri com M9TX01 preenchido até uma profundidade de um centímetro. Usando uma pipeta de microscópio dissecando vermes individuais em 20 volumes de microliteres e transferi-los para poços individuais da placa de poço 96 para ejetar quaisquer vermes presos à pipeta, aspirar 20 microlitros de M9TX01 de uma área clara da placa de Petri e liberá-lo de volta para a placa. Uma vez que todos os vermes são transferidos cubra a placa 96 com uma folha de filme de teto flexível com o lado apoiado de papel voltado para os poços de amostra.
Coloque levemente o tapete do teto de silicone em cima do filme de teto flexível sem pressionar a tampa para baixo nos poços. Coloque a placa a quatro graus Celsius por 30 a 60 minutos para evitar superaquecimento durante a interrupção. Depois de esfriar a placa pressione o tapete do teto de silicone firmemente para baixo nos poços para selá-los.
Em seguida, proteja as placas no disruptor do tecido. Agite as placas por um minuto a 30 hertz. Em seguida, gire as placas em 180 graus e repita tremendo por um minuto.
Toque firmemente nas placas no banco duas ou três vezes para desalojar qualquer grão do filme de teto flexível. Centrifugar a placa definida 2.400 vezes G por dois minutos para coletar as amostras na parte inferior dos poços. Em seguida, remova a tampa de silicone e retire o filme do teto.
Para preparar a diluição serial de dez vezes dos digestores de vermes, encha 180 microliters de um X PBS nas fileiras B a D de uma placa de 96 poços. Usando um pipetter multi-poço definido para 200 microliters, misture lentamente o digestor do verme por pipetação. Transfira o valor máximo do líquido para a linha A da placa do poço 96 contendo PBS.
Usando uma pipeta multicanal, remova 20 microliters da linha superior e dispense na linha B.Seguido pela mistura. Repita este passo para a linha B para C e, em seguida, linha C a D para obter uma diluição de 1000 vezes para quantificação bacteriana de vermes mono colonizados. Placa 10 a 20 microliters de cada diluição em placas de ágar sólidos.
Para a colonização de várias espécies, placa 100 microlitres de cada diluição em placas de ágar de 10 centímetros. Utilizando este protocolo, observou-se higienização externa eficaz após o branqueamento superficial de vermes paralisados a frio, como visto pelo declínio de bactérias externas no buffer. Sem afetar as bactérias associadas ao intestino.
A interrupção manual dos vermes resultou em mais heterogeneidade. O grão de carboneto de silicone era ideal para interrupção com ou sem Tri Andex. No método 96, grandes contas de vidro não foram adequadas para a técnica 96 bem.
Pequenas contas de vidro produziram resultados consistentes, mas entupiram o tubo na ponta. Vermes colonizados no mesmo pool de bactérias apresentaram alta variação na carga intestinal quando observados para bactérias individuais e comunidades bacterianas multi-espécies. Vermes colonizados com bactérias que expressam GFP, mostraram heterogeneidade em medições individuais de vermes.
Para este GFP expressando tensão bacteriana comparando a colonização do tipo selvagem Bristol Len dois vermes. Para daf dois mutantes IGF mostraram que o mutante DAF 16 suporta populações maiores de bactérias, enquanto DAF dois é resistente à colonização. Essa heterogeneidade foi característica e consistente ao longo de diferentes corridas do mesmo experimento.
A re amostragem de dados para simular digestos em lote foi encontrada para alterar a distribuição em comparação com dados individuais de vermes. O lote extrapolado da UFC por verme foi centrado em torno da média aritmética dos dados individuais que levaram à perda de variação biológica. Em vez de proceder para digerir alvejante da superfície viva e enxaguar vermes pode ser usado para outros experimentos.
O movimento será retomado rapidamente assim que os vermes forem removidos do frio.
